抗菌肽共表達載體及其構建和表達方法

抗菌肽共表達載體及其構建和表達方法
【專利摘要】本發明公開了抗菌肽共表達載體及其構建和表達方法，所述抗菌肽為四種，四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩連接到在同一宿主菌中同時表達的雙表達載體pETDuet-1、pRSFDuet-1。本發明的抗菌肽共表達載體可以同時高效穩定的表達四種抗菌肽，從而具有高效廣譜抗菌和抗病毒活性，表達的抗菌肽蛋白結構和天然抗菌肽保持一致，解決了融合表達時改變蛋白結構而影響抗菌肽活性及產量的問題。
【專利說明】抗菌肽共表達載體及其構建和表達方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及能夠同時表達多種抗菌肽的共表達載體，屬于生物工程【技術領域】。

【背景技術】
[0002]由于抗生素與化學合成藥物在畜牧生產中多年濫用，很多病原菌都出現了耐藥性，藥物殘留等問題，因此研究人員開始利用現代生物學技術研發綠色、高效、有利于生物體健康、有利于環境保護以及提高養殖效益的、能夠代替抗生素的新型生物治療制劑。
[0003]在目前已有的生物制劑中，抗菌肽是一種廣泛存在于自然界生物有機體內的小分子活性物質，通常由15-45個氨基酸殘基組成，可經誘導產生，作用于微生物細胞膜，使細胞膜穿孔，破壞細胞膜的完整性，導致細胞質外溢而達到殺菌的目的，具有高效、廣譜及不產生耐藥性等優勢。迄今為止，人們已經從細菌、真菌、植物、動物中分離出了多種抗菌肽，由于不易產生耐藥性，抗菌肽具有廣闊的應用前景。
[0004]LEAP-2(II型肝表達抗菌肽)是近年來在脊椎動物中發現的一種新型抗菌肽，具有較強的抗微生物活性。LEAP-2基因包含3個外顯子和2個內含子，只有I個拷貝。通過放射性雜交圖發現LEAP-2基因位于5號染色體的長臂3區I帶，編碼由77個氨基酸殘基組成的前體蛋白質，多分布于肝臟。LEAP-2對多種細菌尤其是革蘭氏陽性菌有很好的抑制和殺滅效果，具有很好的開發前景。
[0005]TAP (牛氣管抗菌肽)是從牛的氣管黏膜上皮細胞中發現，也是第一個被發現的動物β -防御素，由38個氨基酸殘基組成，含3對分子內二硫鍵，相對分子質量為4.3KD。牛β -防御素TAP對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯肺炎桿菌、綠膿桿菌和念珠菌屬等乳房炎病原菌有較強的抗菌活性。大量研究還表明，動物防御素在免疫調節、激素調節及刺激傷口愈合等方面也有重要作用。
[0006]綿羊體內有兩種動物β -防御素，SBD-1和SBD-2。SBD-1存在于氣管和整個消化道(從舌到結腸)中，含有6個保守的半胱氨酸殘基，這6個半胱氨酸殘基形成二硫鍵，有利于防御素保持穩定的結構，而且還是其抗微生物活性及細胞毒效應的主要結構。
[0007]溶菌酶(Lysozyme)又稱胞壁質酶(Muramidase),是水解酶的一種,是一種無毒、無害的高鹽基水解酶，廣泛分布于動物、植物以及微生物中。溶菌酶通過裂解革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌細胞壁的多糖成分而將其破壞，從而具有殺滅多種病菌的作用。此外，溶菌酶的抗菌活性還表現在其他方面，例如，溶菌酶可以直接結合帶有負電荷的病毒蛋白，與脫輔基蛋白、DNA以及RNA等形成復鹽，從而使病毒失去活性。因此，溶菌酶以其獨特的作用機理，為其在各個領域發揮其抗菌、抗病毒等活性奠定了基礎。
[0008]傳統的制備抗菌肽的方法是組織器官提取法，如有機溶劑提取法、水浸提法和有機酸提取法等。這類方法存在著許多問題，如含量低導致提取效率低，雜質種類復雜導致純度不理想，易失活導致提取后的活性不理想，嚴重制約了抗菌肽的開發和應用。，
[0009]針對上述問題，近年來本領域嘗試利用基因工程生產抗菌肽，迄今為止，抗菌肽已在原核表達系統、昆蟲細胞表達系統、酵母表達系統得到了表達。但是在表達過程中發現，表達的抗菌肽對宿主細胞有毒性，而且對宿主本身的蛋白酶非常敏感導致降解，降低了抗菌肽的表達量。


【發明內容】

[0010]針對現有技術的缺陷，本發明公開了一種共表達載體，能夠在同一宿主菌中同時穩定、高效表達多達四種抗菌肽，共表達多肽具有高效廣譜抗菌和抗病毒活性，蛋白結構和天然抗菌肽保持一致，解決了融合表達時改變蛋白結構而影響抗菌肽活性及產量的問題。
[0011]為實現上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的:
[0012]抗菌肽共表達載體，所述抗菌肽為四種，四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩連接到在同一宿主菌中同時表達的雙表達載體pETDuet-1、pRSFDuet-1。
[0013]本發明并不限定具體的抗菌肽類型，基于本發明所公開的構建方法，目前已有的具有良好生物活性的抗菌肽均可通過選擇設計具有針對性的特異性引物將其連接到上述雙表達載體中。
[0014]優選的，所述抗菌肽為LEAP-2、TAP、SBD-1、Lysozyme，所述抗菌肽的編碼基因與雙表達載體的連接關系為pETDuet-1-L2-T和pRSFDuet-1-Sl-Ly。
[0015]本發明所用的載體pETDuet-1、pRSFDuet-1是雙表達載體，每一個載體上有兩個啟動子，屬于單一載體雙啟動子系統，每個編碼基因都有獨立的一個啟動子，每個啟動子獨立驅動各個蛋白的表達。
[0016]與傳統的構建融合基因相比，本發明的雙表達載體避免了基因之間的相互影響，保證了抗菌肽的穩定表達，克服了串聯表達表達量不足的缺點，并且通過在同一宿主菌中表達的雙質粒表達系統，pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι作為復制子相同不相容的兩個質粒，在Amp和Kana兩種抗生素存在的壓力下子代菌能夠有效存活，不會被抗生素殺死，從而可以同時轉化進入同一宿主菌后有效的表達外源抗菌肽蛋白。
[0017]為了便于規模化生產，降低培養難度，本發明所用的宿主菌為大腸桿菌，其培養簡單，遺傳背景清楚，可以采用發酵罐實現大規模、高密度發酵生產。
[0018]常規的生物工程中所用的大腸桿菌均可用于本發明，包括但不限于大腸桿菌BL21，BL21 (DE3)，和 BL21 (DE3) PLySs 等。
[0019]相應的，本發明公開了上述抗菌肽共表達載體的構建方法，針對具體的抗菌肽，利用引物擴增抗菌肽的編碼基因，通過酶切、連接、轉化將四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩插入雙表達載體 pETDuet-1、pRSFDuet-1。
[0020]本領域技術人員應該了解，針對不同的抗菌肽編碼基因，根據抗菌肽編碼基因以及共表達pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι的多克隆位點，即可利用引物合成軟件Primer設計引物，擴增出各個抗菌肽基因，因此本發明的構建方法可以普遍適用于多種抗菌肽共表達載體的構建。
[0021]具體的，針對本發明所公開的四種優選抗菌肽，構建方法包括下述步驟:
[0022]I)以抗菌肽LEAP-2、TAP、SBD-U Lysozyme編碼基因作為PCR模版擴增出抗菌肽基因;
[0023]2)使用 EcoR1、NotI 分別雙酶切載體 pETDuet-1、pRSFDuet-1 ；
[0024] 3)利用EcoR1、NotI分別雙酶切LEAP_2、SBD_1抗菌肽的編碼基因，將其與雙酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-1載體連接得到表達載體；
[0025]4)利用BglI1、XhoI雙酶切步驟3)得到的表達載體，使用BglI1、XhoI雙酶切TAP、Lysozyme抗菌肽的編碼基因，分別與雙酶切后的表達載體連接得到共表達載體。
[0026]通過上述構建方法，實現了將攜帶四個抗菌肽基因的兩個共表達載體轉化進入同一個宿主菌，能夠穩定、高效表達LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme四種抗菌肽蛋白。
[0027]其中，步驟I)的編碼基因即可從相關的生物制品公司和實驗室購買成品或者合成，針對上述四種具體的抗菌肽，采用PCR擴增所用對應的引物序列如下:
[0028]LEAP-2-F:CCGGAATTCATGACTCCATTTTGGAG (含 EcoRI 酶切位點)
[0029]LEAP-2-R:ATAGCGGCCGCTCATTCCTGGGCCACACT (含 NotI 酶切位點)
[0030]TAP-F:CGCAGATCTAATCCTGTAAGCTGTGTTA(含 BglII 酶切位點)
[0031 ] TAP-R:CCGCTCGAGACTTCTTTCTACAGCATAAAT (含 XhoI 酶切位點)
[0032]SBD-1-F: CCGGAATTCCAAGGAGTAAGAAATCGTCTAAG (含 EcoRI 酶切位點)
[0033]SBD-1-R:ATAGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTTACT (含 NotI 酶切位點)
[0034]Lysozyme-F:CGCAGATCTAGGTCTTTGCTAATCTTGGTG(含 BglII 酶切位點)
[0035]Lysozyme-R:CCGC TCGAGCAGCCGGCAGCCTCTGATCCA (含 XhoI 酶切位點)。
[0036]PCR的條件和參數采用本領域常規實驗條件即可。
[0037]相應的，本發明還公開了上述共表達抗菌肽的表達方法，通過將共表達載體轉化到同一宿主菌進行涂板，過夜培養，挑取單克隆菌落接種于LB培養基中，搖菌過夜，轉接至新LB培養基中，加入IPTG進行誘導產生四種抗菌肽。
[0038]其中，培養最終達到OD值0.6-0.8，所用IPTG濃度為ImM/L。
[0039]其中，所用的菌株采用適合于外源蛋白表達的菌株，優選的是BL21(DE3)、BL21(DE3) PLySs 等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為四種抗菌肽的編碼基因擴增電泳圖，其中M為1K Maker，A為TAP抗菌肽的441bp編碼基因、B為Lysozyme抗菌肽編碼基因441bp、C為SBD-1抗菌肽編碼基因174bp、D為LEAP-2抗菌肽編碼基因168bp ；
[0041]圖2是四種共表達的抗菌肽的SDS-PAGE圖，M為Maker，I是同時轉入空質粒pETDuet-Ι 和 pRSFDuet-Ι 的 BL21 (DE3)全細胞裂解物；2 是同時轉入 pETDuet-1-L2_T 和pRSFDuet-1-Sl-Ly共表達載體未加IPTG誘導的BL21 (DE3)全細胞裂解物；3是同時轉入pETDuet-1-L2-T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly 共表達載體加入 BL21 (DE3)中經 ImM IPTG 誘導表達四個毒素蛋白4小時后的SDS-PAGE圖。

【具體實施方式】
[0042]在下述實施例中， 申請人:提供了一種具體的共表達載體構建和表達過程，并且詳細描述了所用原料的來源，僅為示意，并非構成特別限定。本領域技術人員采用符合公知定義的相關原料和實驗條件也可實現本發明的發明目的。
[0043]在下述實施中，所用原料來源如下:
[0044]LEAP-2、TAP、SBD-1> Lysozyme四種抗菌肽的編碼基因來自于GenBank數據庫，LEAP-2 編號為 Q95JB4、TAP 編號為 AF014106.1、SBD-1 編號為 U75250.1、Lysozyme 編號為V00428.1。
[0045]pETDuet-1 和 pRSFDuet-1 雙表達載體購自 Novagen 公司。
[0046]表達菌:BL21(DE3)購自北京全式金生物技術有限公司。
[0047]所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0048]限制性內切酶Bglll、EcoR1、Notl、Xhol，T4 DNA 連接酶和 2XPower Taq PCRMasterMix均購自大連寶生物有限公司；IPT6、SDS (十二烷基磺酸鈉)、核酸Marker、Agarose DNA extract1n kit、DNA快速純化回收試劑盒、質粒快速提取試劑盒均購自大連寶生物工程公司；細菌基因組提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖購自Invitrogen公司；預染蛋白Marker購自Fermentas公司。
[0049]實施例1:抗菌肽共表達載體的構建
[0050]1.LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme 編碼基因的擴增
[0051]利用引物，擴增抗菌肽LEAP-2、TAP、SBD-U Lysozyme編碼基因，得到各個抗菌肽基因。
[0052]PCR反應體系:50 μ L MasterMix,上下游引物各2 μ L,模版16 μ L,去離子水30 μ L ；DNA膠回收試劑盒回收四個抗菌肽編碼基因；
[0053]2.pETDuet-1-L2 和 pRSFDuet-1-Sl 載體的構建
[0054]將pETDuet-1、pRSFDuet-1 兩個載體進行 EcoR1、NotI 雙酶切。
[0055]40 μ L酶切體系:10XH緩沖液4 μ L，EcoR1、NotI各I μ L，載體24 μ L，去離子水10 μ L0
[0056]酶切產物I %瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收；
[0057]然后用EcoR1、NotI 雙酶切的 LEAP-2、SBD-1 基因。
[0058]40 μ L酶切體系:10XH緩沖液4 μ L，EcoR1、NotI各I μ L，目的基因24 μ L，去離子水10 μ L0
[0059]酶切產物I %瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收，然后分別與雙酶切的pETDuet-1、pRSFDuet-1的載體連接,構建兩個連接體系:
[0060]10XT4DNA Ligase Buffer 2.5 μ L, LEAP-2 編碼基因膠回收產物 14 μ L，pETDuet-1 2 μ L, T4DNA Ligasel μ L,去離子水 5.5 μ L ;
[0061]10XT4DNA Ligase Buffer 2.5 μ L, SBD-1 編碼基因膠回收產物 14yL，pRSFDuet-1 2 μ L, T4DNA Ligasel μ L,去離子水 5.5 μ L。
[0062]16°C連接過夜，分別轉化Transl09態細胞，挑取單克隆菌落分別進行菌液PCR鑒定、酶切鑒定、菌液測序確定LEAP-2、SBD-1分別連接到pETDuet-l_L2和pRSFDuet-1-Sl載體上；
[0063]3.pETDuet-1-L2-T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly 載體的構建
[0064]pETDuet-1-L2 和 pRSFDuet-1-Sl 進行 Bglll、XhoI 雙酶切。
[0065]40yL酶切體系:10XH緩沖液4yL，Bglll、XhoI各I μ L，載體24 μ L，去離子水10 μ L，酶切產物I %瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收。
[0066]BglII> XhoI 雙酶切的 TAP、Lysozyme 編碼基因。
[0067]40 μ L酶切體系:10XH緩沖液4 μ L，EcoR1、PstI各I μ L，目的基因24 μ L，去離子水10 μ L，酶切產物I %瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收，然后構建兩個鏈接體系:
[0068]10XT4DNA Ligase Buffer 2.5 μ L，TAP 編碼基因膠回收產物 14 μ L，pETDuet_l_L2 2 μ L, T4DNA Ligasel μ L,去離子水 5.5 μ L ;
[0069]10 X T4DNA Ligase Buffer 2.5 μ L, Lysozyme 編碼基因膠回收產物 14 μ L，pRSFDuet-1-Sl 2 μ L, T4DNA Ligasel μ L,去離子水 5.5 μ L。
[0070]16°C連接過夜，分別轉化Transl09態細胞，挑取單克隆菌落分別進行菌液PCR鑒定、酶切鑒定、菌液測序確定TAP、LyS0Zyme分別連接到pETDuet-1-L2和pRSFDuet-1-Sl載體上。
[0071]實施例2:LEAP_2、TAP、SBD-ULysozyme四種抗菌肽共表達載體的共表達
[0072]pETDuet-1-L2-T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly 各 0.5 μ L 質粒同時轉化 BL21 (DE3)宿主菌，挑取單克隆菌落接種于新鮮1ml LB培養基中，搖菌過夜，按1: 100比例轉接新鮮1ml LB培養基中，OD值達0.6-0.8時取Iml菌液作為未誘導樣品，然后加入終濃度1.0mM的10 μ L IPTG誘導表達四小時收取Iml菌液樣品；
[0073]在上述共表達完成后，對所表達獲得的LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme四種抗菌肽進行了 SDS-PAGE檢測。
[0074]其中，所配制的SDS-PAGE溶液組成如下:
[0075]Tris-甘氨酸緩沖液:25mmol/L Tris、250mmol/L 甘氨酸(pH 8.0)、0.I % SDS。
[0076]2X SDS 上樣buffer:1 OOmmoI/L Tris.Cl (ρΗ8.0)、200m mol/L巰基乙醇、4% SDS、
0.2%溴酚藍、20%甘油。
[0077]考馬斯亮藍染色液:45ml甲醇、45ml水、1ml冰醋酸中溶解0.25g考馬斯亮藍R250。
[0078]脫色液:30%甲醇、10%冰乙酸，蒸餾水補體積至100ml。
[0079]SDS-PAGE檢測過程為:
[0080](I)洗凈玻璃板，固定在電泳槽上，用2.0%瓊脂糖封邊。按分子克隆的配方配制15%的分尚膠5ml,迅速注入兩玻璃板之間,膠頂覆蓋Iml雙蒸水。待分尚膠凝固后傾出覆蓋層液體，用去離子水沖洗凝膠頂部數次，倒置空干液體，加入2ml 5%的濃縮膠溶液，插上梳子，垂直放置電泳槽使其凝固。
[0081](2)小心移去梳子，在電泳裝置上、下槽間加入Tris-甘氨酸緩沖液，用注射器沖洗加樣孔數次，將電源負極與上槽相連。
[0082](3)收集的菌液12000rpm離心2min,用50 μ I ρΗ7.4的PBS懸浮,加入等體積的2X SDS上樣buffer，混勻，水浴煮沸lOmin，用微量進樣器上樣10 μ 1，打開電源，用80V電壓電泳至溴酚藍進入分離膠，把電壓提高到120V，繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部。
[0083](4)染色:取下凝膠用蒸餾水沖洗，用5倍凝膠體積的考馬斯亮藍染色液浸泡凝膠，放在脫色搖床上室溫染色3h。
[0084](5)脫色:用30%甲醇、10%冰乙酸的混合液，在脫色搖床上脫色過夜，其間更換染色液3~4次。待藍色背景完全脫凈后，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。
[0085]參考附圖2所示，顯示本發明的共表達載體成功實現了四種抗菌肽的共表達，其中 TAP 5.3kDa、LEAP-2 6.1kDa、SE?-1 6.4kDa> Lysozyme 16kDa。
【權利要求】
1.抗菌肽共表達載體，其特征在于所述抗菌肽為四種，四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩連接到在同一宿主菌中同時表達的雙表達載體pETDuet-1、pRSFDuet-1。
2.根據權利要求1的共表達載體，其特征在于所述抗菌肽為LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme0
3.根據權利要求2的共表達載體，其特征在于所述抗菌肽的編碼基因與雙表達載體的連接關系為 pETDuet-1-L2-T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly。
4.根據權利要求1的共表達載體,其特征在于宿主菌為大腸桿菌。
5.權利要求1的抗菌肽共表達載體的構建方法，其特征在于利用引物擴增抗菌肽的編碼基因，通過酶切、連接、轉化將四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩插入雙表達載體pETDuet-1、pRSFDuet-1。
6.根據權利要求5的構建方法，其特征在于所述抗菌肽為LEAP-2、TAP、SBD-1、Lysozyme,與雙表達載體的連接關系為 pETDuet_l-L2_T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly。
7.根據權利要求6的構建方法，其特征在于包括下述步驟:1)以抗菌肽LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme編碼基因作為PCR模版擴增出抗菌肽基因；2)使用EcoR1、NotI分別雙酶切載體pETDuet-1、pRSFDuet-l ；3)利用EcoR1、NotI分別雙酶切LEAP_2、SBD_1抗菌肽的編碼基因，將其與雙酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-l載體連接得到表達載體；4)利用BglI1、XhoI雙酶切步驟3)得到的表達載體，使用Bglll、XhoI雙酶切TAP、Lysozyme抗菌肽的編碼基因，分別與雙酶切后的表達載體連接得到共表達載體。
8.根據權利要求7的構建方法，其特征在于步驟I)各抗菌肽的特異性引物分別為 LEAP-2-F: CCGGAATTCATGACTCCATTTTGGAG ；
LEAP-2-R:ATAGCGGCCGCTCATTCCTGGGCCACACT ；
TAP-F:CGCAGATCTAATCCTGTAAGCTGTGTTA ；
TAP-R:CCGCTCGAGACTTCTTTCTACAGCATAAAT ；
SBD-1-F:CCGGAATTCCAAGGAGTAAGAAATCGTCTAAG ；
SBD-1-R:ATAGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTTACT ；
Lysozyme-F:CGCAGATCTAGGTCTTTGCTAATCTTGGTG ；
Lysozyme-R:CCGCTCGAGCAGCCGGCAGCCTCTGATCCA。
9.權利要求1的共表達載體的表達方法，其特征在于將共表達載體轉化到同一宿主菌進行涂板，過夜培養，挑取單克隆菌落接種于LB培養基中，搖菌過夜，轉接至新LB培養基中，加入IPTG進行誘導。
10.根據權利要求9的表達方法，其特征在于培養最終達到OD值0.6-0.8，所用IPTG濃度為ImM/L。
【文檔編號】C12N15/70GK104131021SQ201410375519
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】周繼章, 陳啟偉, 李兆才, 曹小安, 宮曉煒 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所