H7n9亞型禽流感病毒診斷環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于H7N9亞型禽流感病毒診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒及其使用方法。所述試劑盒，其特征在于，分別由HA基因及NA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物混合液、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)預(yù)混液、HA基因及NA基因體外轉(zhuǎn)錄RNA陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品構(gòu)成，可進行H7N9亞型禽流感病毒的快速診斷。所述試劑盒的使用方法，其特征在于，可通過等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)實現(xiàn)H7N9亞型禽流感病毒實時快速診斷。該方法特異性強，靈敏度高，為H7N9亞型禽流感病毒的防控及流行趨勢調(diào)查分析提供了一種簡便、快速的途徑。
【專利說明】H7N9亞型禽流感病毒診斷環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒及使用 方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一套用于病毒快速診斷的引物組、試劑盒及使用方法，尤其涉及一套 用于診斷H7N9亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組、試劑盒及其使用方法，屬于禽流 感病毒檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感是由A型流感病毒引起的一種禽類的急性高度致死性傳染病。1878年發(fā)生 在意大利，隨后，在其它歐洲國家、南美、東南亞、美國和前蘇聯(lián)也時有發(fā)生。由于禽流感的 變異太多，不宜有效檢測控制，其疫情傳播的風(fēng)險性引起了國際社會的高度關(guān)注。2005年9 月29日，被聯(lián)合國秘書長安南任命為聯(lián)合國禽流感事務(wù)協(xié)調(diào)員的世界衛(wèi)生組織（WHO)專家 大衛(wèi)納巴羅（David Nabarro)博士說："下一場流感爆發(fā)隨時可能到來，而根源可能正是目 前肆虐于亞洲地區(qū)的禽流感病毒的某種變體。如果出現(xiàn)一場流感大爆發(fā)，500萬到1. 5億人 將會喪生"。據(jù)亞洲開發(fā)銀行初步估計，如果爆發(fā)一場嚴(yán)重的禽流感疫情，亞太地區(qū)在短期 內(nèi)就將蒙受2500億至2900億美元（約4235億至4912億新元）的經(jīng)濟損失。
[0003] H7N9亞型禽流感病毒是于2013年3月底全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒，臨床 癥狀表現(xiàn)主要為：高燒，咳嗽，氣促，呼吸困難，缺氧，胸片顯示下呼吸道渾濁，浸潤，片狀陰 影。感染并發(fā)癥包括膿毒性休克，呼吸衰竭，急性呼吸窘迫綜合癥，難治性低氧血癥，急性腎 功能障礙，多器官功能障礙，橫紋肌溶解癥，肝性腦病，細菌和真菌感染等。2013年4月經(jīng) 調(diào)查，H7N9亞型禽流感病毒基因來自于東亞地區(qū)野鳥和中國上海、浙江、江蘇雞群的基因重 配。截止至2013年8月，實驗室確診H7N9型感染病例共計132人，其中43例死亡，病例分 布于北京、上海、江蘇、浙江、安徽、山東、河南、臺灣、福建等地。新型H7N9亞型禽流感的出 現(xiàn)，給全社會帶來了恐慌，因此研究開發(fā)一種行之有效的H7N9亞型禽流感病毒快速診斷試 劑盒，具有極其重要的意義。
[0004] 目前，禽流感病毒的臨床診斷方法主要包括病毒分離方法、血清學(xué)檢測方法和分 子生物學(xué)方法三大類。其中，臨床應(yīng)用的分子生物學(xué)方法主要指實時熒光定量PCR核酸分 子診斷方法，也是診斷H7N9亞型禽流感病毒最常用的方法。然而，傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)對溫度 具有一定的依賴性，要求精密控溫系統(tǒng)，檢測時間長，實驗成本高。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP) 法是2000年由日本Notomi博士發(fā)明的一種新的核酸擴增技術(shù)，更具有簡便、快速、敏感性 高和特異性強等優(yōu)點。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，該方法得到不斷完善，尤其在結(jié)果判定方面，已 有多種肉眼可視的方法及實時熒光檢測法得到廣泛應(yīng)用，可從源頭上控制住由電泳開蓋造 成的氣溶膠污染，尤其適合于現(xiàn)場快速檢測以及床旁檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的主要目的是提供一套用于H7N9亞型禽流感病毒快速診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫 擴增引物組，由HA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組、NA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組構(gòu)成，可用 于H7N9亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)。
[0006] 所述H7N9亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組是通過大量比對Genbank中下 載的不同亞型H7N9甲型禽流感病毒HA及NA的核酸序列，針對特異性差異較大的片段所設(shè) 計。其中，HA基因引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，NA基因引物組包括 一對外引物和一對內(nèi)引物。HA基因引物組的內(nèi)引物與外引物按6 : 1-12 : 1的比例配制 成，優(yōu)選比例為8 : 1，環(huán)引物與內(nèi)引物的比例為1 : 2;NA基因引物組的內(nèi)引物與外引物 按6 : 1-12 : 1的比例配制成，優(yōu)選比例為8 : 1。
[0007] 所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)預(yù)混液，可以是使擴增產(chǎn)物發(fā)出熒光信號的一種商品 化試劑盒Isothermal Master Mix或者等效的其他試劑盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜堿、 MgSOjP緩沖溶液組成，及逆轉(zhuǎn)錄酶如AMV reverse transcriptase或者等效的其他逆轉(zhuǎn)錄 酶構(gòu)成。試劑盒中還同時引入一組陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，其中HA基因及NA基因陽性 質(zhì)控品，為經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄純化得到的RNA片段，其濃度均為ZxKTcopies/μ L，陰性質(zhì)控品是 不含各引物組的介質(zhì)溶液。
[0008] 所述Η7Ν9亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系的總體積為25yL，其 中包括HA/NA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組溶液6 μ L/4 μ L，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)預(yù)混液 14 μ Ι7?6μ L，待測試樣或者陽性質(zhì)控品或者陰性質(zhì)控品各5μ L ;環(huán)介導(dǎo)等溫擴增熒光檢 測系統(tǒng)的擴增程序為：① 63°c，60min，② 98°C -80°c，0· 05°C /s，lOmin。
[0009] 所述的H7N9亞型禽流感病毒診斷試劑盒，實時熒光檢測法中每個反應(yīng)熒光信號 達最大值所對應(yīng)的擴增時間與模板RNA初始拷貝數(shù)的對數(shù)值之間，在10 5拷貝數(shù)-1011拷貝 數(shù)范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，R2 > 0. 990,可根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線進行待測樣本模板RNA拷貝數(shù)的測 定；該方法HA基因與NA基因的檢出限都可達到單拷貝/反應(yīng)。
[0010] 擴增結(jié)果的分析和判定方法包括：
[0011] 1)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)測得的擴增曲線平臺熒光值高于本底噪音信號 5倍且溶解曲線為單一尖銳峰的判定為陽性結(jié)果，擴增曲線平臺熒光值低于本底噪音信號 5倍的判定為陰性結(jié)果，擴增曲線平臺熒光值高于本底噪音信號5倍但溶解曲線不是單一 尖銳峰的判定為非特異性的交叉干擾信號。
[0012] 2)陽性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陽性結(jié)果，陰性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果的 視為有效試驗，否則試驗無效，重新進行。
[0013] 3)待測試樣各反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果，則未檢測到H7N9亞型禽流感病毒；待測試 樣各反應(yīng)管任意一管為陽性結(jié)果，則為H7N9亞型禽流感病毒感染。其中HA基因的擴增曲 線以15min時的讀數(shù)為基準(zhǔn)，NA基因的擴增曲線以30min時的讀數(shù)為基準(zhǔn)。
[0014] 一種用于H7N9亞型禽流感病毒診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒的使用方法，還包 括熒光信號達到最大值所對應(yīng)的擴增時間與模板RNA(HA、NA基因）初始拷貝數(shù)的量化關(guān) 系分析。其方法為，分別配制濃度均為10 11拷貝數(shù)/反應(yīng)、101°拷貝數(shù)/反應(yīng)、1〇9拷貝數(shù)/ 反應(yīng)、10 8拷貝數(shù)/反應(yīng)、107拷貝數(shù)/反應(yīng)、106拷貝數(shù)/反應(yīng)、105拷貝數(shù)/反應(yīng)的HA基因 和NA基因體外轉(zhuǎn)錄RNA陽性質(zhì)控品水溶液系列，用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)分別測定 RNA陽性質(zhì)控品水溶液系列，以各反應(yīng)熒光信號達到最大值時所對應(yīng)的擴增時間為縱坐標(biāo)， 以模板RNA初始拷貝數(shù)對數(shù)值為橫坐標(biāo)，建立關(guān)系曲線。利用該曲線，通過測定未知模板熒 光信號達到最大值所對應(yīng)的擴增時間，即可測得待測模板RNA的初始拷貝數(shù)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1甲醛變性MOPS凝膠電泳鑒定HA及ΝΑ基因體外轉(zhuǎn)錄RNA陽性質(zhì)控品純度及 完整性
[0016] 圖2實時熒光檢測法ΗΑ基因引物特異性實驗結(jié)果。
[0017] (a)實時熒光擴增曲線，（b)實時熒光溶解曲線
[0018] 圖3實時熒光檢測法NA基因引物特異性實驗結(jié)果。
[0019] (a)實時熒光擴增曲線，（b)實時熒光溶解曲線
[0020] 圖4熒光信號達最大值所對應(yīng)的擴增時間與模板RNA(HA基因）初始拷貝數(shù)對數(shù) 值間的關(guān)系曲線。
[0021] (a)實時熒光擴增曲線（HA基因），（b)函數(shù)關(guān)系曲線（HA基因）
[0022] 圖5熒光信號達最大值所對應(yīng)的擴增時間與模板RNA(NA基因）初始拷貝數(shù)對數(shù) 值間的關(guān)系曲線。
[0023] (a)實時熒光擴增曲線（NA基因），（b)函數(shù)關(guān)系曲線（NA基因）
[0024] 具體實施方法
[0025] 下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施方法做進一步詳細描述，本發(fā)明的優(yōu)點和特 點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何 限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù) 方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0026] 實施例
[0027] 1.試驗材料與方法
[0028] 1. 1試驗材料
[0029] H7N9亞型禽流感病毒HA及NA基因人工合成片段，是參考Genbank上已發(fā)表的序 列（HA基因序列號為KC853766. 1，NA基因序列號為KC853765. 1)人工合成，片段連接到pCR Π載體上，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5 α，以30%甘油的菌液的形式儲存。
[0030] 1.2引物設(shè)計
[0031] 運用DNAMAN軟件對Η7Ν9亞型禽流感病毒ΗΑ及ΝΑ基因進行比對，選擇ΗΑ 及ΝΑ基因差異性較大的片段作為祀序列，運用在線軟件PrimerExplorer V4(http :// primerexplorer. jp/e/)設(shè)計HA及ΝΑ基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組。HA基因環(huán)介導(dǎo)等溫 擴增引物組，由一對外引物（SEQ No. 1、SEQ No. 2)、一對內(nèi)引物（SEQ No. 3、SEQ No. 4)和一 對環(huán)引物（SEQ No. 5、SEQ No. 6)組成，其引物序列為：
[0032]
【權(quán)利要求】
1. 一套用于H7N9亞型禽流感病毒診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組，由血凝素（HA)基因 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組、神經(jīng)氨酸酶（NA)基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組構(gòu)成，其特征在于， 可用于2013年春夏季節(jié)爆發(fā)的H7N9亞型禽流感病毒診斷時的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)； 所述H7N9亞型禽流感病毒HA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組，其特征在于，由一對外引物 (SEQ No. 1、SEQ No. 2)、一對內(nèi)引物（SEQ No. 3、SEQ No. 4)和一對環(huán)引物（SEQ No. 5、SEQ No. 6)組成，其引物序列為：
〇
2. 如權(quán)利要求1所述的H7N9亞型禽流感病毒HA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組、H7N9亞 型禽流感病毒NA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組，其特征在于，用于H7N9亞型禽流感病毒檢測 的方法包括： 1) 實時熒光檢測法，其特征在于，使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)實現(xiàn)同步等溫擴 增并實時檢測反應(yīng)管中的熒光信號，獲得等溫擴增曲線和溶解曲線，進而判定檢測結(jié)果； 2) 實時濁度檢測法，反應(yīng)時實時監(jiān)測反應(yīng)管中濁度信號，獲得等溫擴增曲線，進而判定 檢測結(jié)果； 3) 紫外照射熒光檢測法，擴增反應(yīng)后將反應(yīng)管中反應(yīng)液在紫外光下照射，呈紅色熒光 的檢測為陽性結(jié)果，不呈紅色的檢測為陰性結(jié)果； 4) 直接熒光目測法，其特征在于，在擴增反應(yīng)前向反應(yīng)管中加入鈣黃綠素作為熒光指 示劑，可通過肉眼直接判定結(jié)果，反應(yīng)管中反應(yīng)液呈綠色的為陽性結(jié)果，不呈綠色的為陰性 結(jié)果； 5) 凝膠電泳檢測法，其特征在于，反應(yīng)后反應(yīng)液電泳時有特征梯形條帶者為陽性結(jié)果， 無特征梯形條帶者為陰性結(jié)果； 6) 微全分析法或者微流控芯片法或者芯片實驗室法，其特征在于，樣品裂解、核酸提取 純化、等溫擴增和檢測均集成在微全分析系統(tǒng)上自動完成，結(jié)果判定方法包括前述的實時 熒光檢測法、實時濁度檢測法、紫外照射熒光檢測法、直接熒光目測法、凝膠電泳檢測法，該 微全分析系統(tǒng)由微膜片泵（閥）驅(qū)動，通過程序控制微膜片泵（閥）的開啟與閉合實現(xiàn)微 流體樣品的驅(qū)動控制。
3. -種如權(quán)利要求1所述的H7N9亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組，用于H7N9 亞型禽流感病毒診斷的試劑盒，主要由HA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組溶液、ΝΑ基因環(huán)介導(dǎo) 等溫擴增引物組溶液、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)預(yù)混液、ΗΑ基因及ΝΑ基因體外轉(zhuǎn)錄RNA陽性質(zhì) 控品和陰性質(zhì)控品構(gòu)成，其特征在于，采用實時熒光檢測方法，可以進行Η7Ν9亞型禽流感 病毒的快速診斷； 所述Η7Ν9亞型禽流感病毒ΗΑ基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組溶液，其特征在于，是由 一對內(nèi)引物、一對外引物和一對環(huán)引物按一定的比例配置而成，其中內(nèi)引物與外引物按 6 : 1-12 : 1的比例配制成，優(yōu)選比例為8 : 1，環(huán)引物與內(nèi)引物的比例為1 : 2;所述ΝΑ 基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組溶液，其特征在于，是由其中的內(nèi)引物與外引物按6 : 1-12 : 1 的比例配制成，優(yōu)選比例為8 : 1 ;所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)預(yù)混液，其特征在于，由Bst聚 合酶、dNTP、甜菜堿、MgS04和緩沖溶液，及逆轉(zhuǎn)錄酶如AMV reverse transcriptase或者等 效的其他逆轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)成，包括可使擴增產(chǎn)物發(fā)出熒光信號的一種商品化試劑盒Isothermal Master Mix或者等效的其他試劑盒；所述HA基因及ΝΑ基因陽性質(zhì)控品，其特征在于，是由 涵蓋上述引物擴增的ΗΑ基因及ΝΑ基因區(qū)域人工合成片段構(gòu)建的質(zhì)粒，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄純化得 到的RNA片段，其濃度均為ZxKTcopies/μ L ;所述陰性質(zhì)控品，其特征在于，為不含各引物 組的介質(zhì)溶液。
4. 如權(quán)利要求3所述的Η7Ν9亞型禽流感病毒診斷試劑盒，其特征在于，在ΗΑ及ΝΑ基 因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)管內(nèi)分別加入相應(yīng)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物組溶液6μ L或者4 μ L，環(huán) 介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)預(yù)混液14 μ L或者16 μ L，待測試樣或者陽性質(zhì)控品或者陰性質(zhì)控品各 加入5 μ L ;所述實時熒光檢測方法，其特征在于，使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)實現(xiàn) 同步等溫擴增并實時檢測反應(yīng)管中的熒光信號，獲得等溫擴增曲線和溶解曲線，熒光檢測 系統(tǒng)的擴增程序為：① 63°c，60min，② 98°C -80°c，0· 05°C /s，lOmin。
5. 如權(quán)利要求3所述的H7N9亞型禽流感病毒診斷試劑盒，其特征在于，實時熒光檢測 法中每個反應(yīng)熒光信號達最大值所對應(yīng)的擴增時間與模板RNA初始拷貝數(shù)的對數(shù)值之間， 在1〇 5拷貝數(shù)-1011拷貝數(shù)范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，R2 > 〇. 990,可根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線進行待測 樣本模板RNA拷貝數(shù)的測定；該方法HA基因與NA基因的檢出限都為單拷貝/反應(yīng)。
6. 如權(quán)利要求3所述的H7N9亞型禽流感病毒診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，擴 增結(jié)果的分析和判定方法包括： 1) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)測得的擴增曲線出現(xiàn)平臺時，其熒光值高于本底噪音 信號5倍且溶解曲線為單一尖銳峰的判定為陽性結(jié)果，其熒光值高于本底噪音信號5倍但 溶解曲線不是單一尖銳峰的判定為非特異性的交叉干擾信號；其熒光值低于或等于本底噪 音信號5倍的判定為陰性結(jié)果； 2) 陽性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陽性結(jié)果且陰性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果的視 為有效試驗，否則試驗無效，重新進行； 3) 當(dāng)待測試樣HA及NA基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果時，則未檢測到 H7N9亞型禽流感病毒；待測試樣某一反應(yīng)管為陽性結(jié)果，則為H7N9亞型禽流感病毒感染； 其特征在于，HA基因的擴增曲線以15min時的讀數(shù)為基準(zhǔn)，NA基因的擴增曲線以30min時 的讀數(shù)為基準(zhǔn)。
【文檔編號】C12Q1/70GK104099430SQ201410375338
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】鄒明強, 薛強, 殷宏 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院