用于綿羊卵母細胞體外成熟的方法及預處理液和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了用于綿羊卵母細胞體外成熟的方法及預處理液和試劑盒。本發明涉及用于綿羊卵母細胞體外成熟的預處理液，其特征在于：包含綿羊小卵泡液和用于綿羊卵母細胞體外成熟的常規培養液成分。本發明還公開了一種綿羊卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于在常規體外成熟方法的基礎上增加了預處理步驟。同時，本發明還驗證了采用本發明的成熟方法培養的卵母細胞體外受精后獲得的受精卵的卵裂率和囊胚率顯著高于常規成熟方法培養的卵母細胞。本發明提供的預處理液和體外成熟培養方法能有效地促進綿羊卵母細胞體外成熟，具有對卵母細胞無毒害、限制少、效果好等特點。
【專利說明】用于綿羊卵母細胞體外成熟的方法及預處理液和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及胚胎工程領域，具體涉及用于綿羊卵母細胞體外成熟的方法及預處理液和試劑盒。
【背景技術】
[0002]在家畜繁殖上，卵巢來源的卵母細胞是生產動物胚胎的主要來源之一，因此卵母細胞體外成熟對于動物育種、克隆以及轉基因動物生產是一個重要的平臺技術。
[0003]2003年，王旭光對比了不同季節新疆綿羊卵母細胞在不同FSH、LH濃度下體外成熟的效果，并發現綿羊卵母細胞體外成熟的培養時間以24~26h為宜，同時探索了不同的和電激活方案對卵母細胞體外成熟的影響，發現EH+A23187+CHX是最適綿羊卵母細胞激活方案，卵裂率達到69.8%，囊胚率達到30% (王旭光.綿羊卵母細胞體外成熟和孤雌激活的研究[D].新疆:新疆農業大學，2003)。呂自力等于2004年按不同分布對綿羊卵母細胞進行了分級，并研究了在同樣的體外培養條件下，不同級別的卵母細胞的成熟率，結果證明卵丘一卵母細胞復合體(COCs)的成熟率最高，達到68.9% (呂自力，馬育芳，帥志強等.不同級別綿羊卵母細胞在春季體外培養條件下的成熟率比較[J].黑龍江畜牧獸醫，2004, 05)。2006年，王寶珍通過試驗證明綿羊卵巢卵母細胞體外成熟培養時間以24h為佳，FCS濃度以20%最適宜(王寶珍.綿羊卵巢卵母細胞體外成熟培養的研究[J].甘肅畜牧獸醫，2006，05) 。同年，孫桂金研究了 FSH/LH濃度、年齡和采卵季節對綿羊卵母細胞體外成熟的影響。結果表明:FSH/LH能促進綿羊卵母細胞體外成熟，添加量以10μ g/ml為宜；成年綿羊卵母細胞成熟率高于性成熟前綿羊，但無顯著差異；發情季節綿羊卵母細胞較乏情季節易成熟。(孫桂金，尹遜河，敖紅.綿羊卵母細胞體外成熟的研究[J].中國草食動物，2006, 05)。同時，萬鵬程等人還發現在綿羊體外成熟培養系統中添加5ng/mLVEGF能夠顯著(P〈0.01)提高綿羊卵母細胞的體外成熟率，證實了 VEGF對綿羊卵母細胞的體外成熟具有調節作用(萬鵬程，羅海玲，張小紅.血管內皮生長因子對綿羊卵母細胞體外成熟及體外受精卵卵裂率的影響[J].中國畜牧雜志，2006, 23)。2008年，張曉建等人發現體外成熟培養19~21h的綿羊卵母細胞在成熟率上顯著高于體外成熟培養16~18h (P<0.05)(張曉建，安志興，李學斌.卵母細胞體外成熟時間對綿羊核移植效率的影響[J].安徽農業科學，2008, 32)。劉丑生等人于同年研究了 EGF1、GF-1以及EGF和IGF-1聯合對綿羊卵母細胞體外成熟和卵裂的影響，結果表明:50ng/mL的EGF的成熟率和卵裂率分別為71.2%和45.5%，顯著高于對照組和10、20、304、0ng/mL組(Ρ〈0.05)，當EGF濃度達到100ng/mL時，成熟率和卵裂率最高，分別為72.9%和45.7% (劉丑生，陸會寧，張利平.EGF和IGF-1對綿羊卵母細胞體外成熟和卵裂的影響[J].畜牧獸醫學報，2008，05)。2013年，徐燕霞在成熟液中分別加入BMP15、FGF8b，以成熟液作為對照組，對不同培養液的卵母細胞的成熟率和早期胚胎的發育情況進行比較。實驗結果表明，成熟液中添加BMP15，卵母細胞的成熟率和胚胎發育情況明顯高于對照組和添加FGFSb組，差異極顯著(P〈0.01);對照組和添加FGFSb組卵母細胞成熟率和胚胎發育情況差異不顯著(P>0.05)(徐燕霞.BMP15、FGF8b對綿羊卵母細胞體外成熟及早期胚胎發育影響的初步研究[D].甘肅:甘肅農業大學，2013)。2014年，劉春霞等人通過實驗證實了添加10%~15% ESS, 10 μ g/mLFSH, 20 μ g/mLLH, 1.5 μ g/mL17- β E2, 100IU青霉素，100IU鏈霉素的TCM-199成熟培養液能較好地促進綿羊卵母細胞體外成熟(劉春霞，趙瑞媛，周歡敏.綿羊卵母細胞體外受精培養體系的建立與優化[J].內蒙古農業大學學報，2014，01)。
[0004]目前，常規的體外成熟(In Vitro Maturat1n, IVM)雖然能夠使卵母細胞在體外環境下完成減數分裂，但很難使核質同步成熟，得到的卵母細胞質量遠不如體內成熟的卵母細胞，核質同步成熟成為亟待解決的問題。為了更好的模擬體內環境，研究者開發了更為科學的卵母細胞體外兩步成熟培養方法，即首先將卵母細胞在含有一定量減數分裂抑制劑的培養液中培養一段時間，然后再移入體外成熟液進行正常成熟培養，這種方法能夠延長細胞質成熟的時間，促進卵母細胞積累豐富的母源mRNA和蛋白質，盡可能達到核質同步成熟。
[0005]2012年胡媛媛采用兩步成熟培養方法對綿羊的卵母細胞進行成熟，利用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和毛喉素(FSK)兩種核成熟抑制劑組合對卵母細胞進行預成熟2h(第一步成熟)，然后轉移至含有5 μ mo I/L的Cilostamide成熟液中繼續體外成熟28h (第二步成熟)，研究結果表明:第一步成熟中的抑制劑組合適宜濃度為lOOymol/LIBMX+100ymol/L FSK 或 100 μ mol/L ΙΒΜΧ+50 μ mol/L FSK,囊胚發育率分別達到(51.6%和49.8% )，均顯著高于對照組(33.1% ) (P〈0.05)(胡媛媛.兩步體外成熟法對綿羊卵母細胞發育能力的影響[D].河北:河北農業大學，2012)。即便如此，這樣的實驗結果也并不理想。究其原因，這些報道中所采用的減數分裂抑制劑均是化學抑制劑(如，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和毛喉素(FSK))，雖然在卵母細胞成熟過程可以有效抑制減數分裂，但其在某種程度上對卵母細胞具有毒害作用，不利于胚胎的后期發育。
【發明內容】
[0006]本發明針對上述現有技術的缺陷和不足，基于綿羊小卵泡液(SMALL FOLLI⑶LARFLUID, SFF)抑制減數分裂的原理，提供了一種用于綿羊卵母細胞體外成熟的預處理液。同時，基于該預處理液，本發明還提供了改進的綿羊卵母細胞體外成熟方法:即使用所述的預處理液對需要體外培養的綿羊卵母細胞進行預處理，然后再進行常規的體外成熟培養。本發明提供的預處理液和體外成熟方法在顯著提高了綿羊卵母細胞的體外成熟效率和后期發育能力。
[0007]本發明的技術方案如下:
[0008]用于綿羊卵母細胞體外成熟的預處理液，其特征在于:在綿羊卵母細胞體外成熟的常規培養液中添加有綿羊小卵泡液。
[0009]所述的預處理液，其特征在于:所述綿羊小卵泡液的終濃度為10% (v/v)。
[0010]所述的預處理液，其特征在于:所述綿羊卵母細胞體外成熟的常規培養液為含終濃度3mg/ml BSA的TCM199培養液。
[0011]一種綿羊卵母細胞體外成熟方法，其特征在于包括如下步驟:
[0012]I)從綿羊離體卵巢中采集綿羊卵母細胞；
[0013]2)將所述綿羊卵母細胞放入所述的預處理液中進行預處理；
[0014]3)將預處理后的綿羊卵母細胞轉移至體外成熟培養液中進行體外成熟培養。
[0015]所述的方法，其特征在于:所述體外成熟培養液的配方為:TCM199+10ug/mlFSH+lug/ml LH+lug/ml E2+10% (v/v)的 FBS。
[0016]所述的方法，其特征在于:所述綿羊卵母細胞指A級卵丘卵母細胞復合體和/或B級卵丘卵母細胞復合體；所述A級卵丘卵母細胞復合體表現為胞質均勻、多層卵丘顆粒細胞包裹級卵丘卵母細胞復合體表現為胞質均勻、少于3層卵丘顆粒細胞包裹或部分裸露。
[0017]所述的方法，其特征在于:所述的預處理的步驟如下:將A、B級COCs用所述預處理液清洗2次，然后放入預先在CO2培養箱中平衡2h以上的所述預處理液中培養4h ;培養條件為:含5% CO2的空氣，溫度38.6 °C，飽和濕度。
[0018]所述的方法，其特征在于:所述體外成熟培養的步驟如下:將預處理后的COCs轉移到預先在CO2培養箱中平衡2h以上的所述外成熟培養液液中培養26h ;培養條件為:含5% CO2的空氣，溫度38.6°C，飽和濕度。
[0019]所述的預處理液的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:
[0020]I)從綿羊離體卵巢上l-3mm的卵泡中抽取卵泡液；
[0021]2)將抽取的卵泡液在HOOOrpm下離心10min，抽取上清液，用0.45 μ m孔徑的濾膜過濾；
[0022]3)所得濾液SFF與綿羊卵母細胞體外成熟預處理的常規培養液成分配制得到所述預處理液。
[0023]用于綿羊卵母細胞體外成熟的試劑盒，其特征在于:包含所述的預處理液。
[0024]所述的試劑盒，其特征在于:還包括體外成熟培養液，所述體外成熟培養液的配方如下:TCM199+10ug/ml FSH+lug/ml LH+lug/ml 的 E2+10% (v/v)的 FBS。
[0025]本發明基于綿羊小卵泡液抑制減數分裂的原理，提供了一種用于綿羊卵母細胞體外成熟的預處理液。同時，基于該預處理液，本發明人還提供了改進的綿羊卵母細胞體外成熟方法，即使用所述的預處理液對需要體外培養的綿羊卵母細胞進行預處理，然后再進行常規的體外成熟培養。實驗證明，本發明提供的預處理液和體外成熟方法顯著提高了綿羊卵母細胞的體外成熟效率和后期發育能力。
[0026]本發明提供的一種用于綿羊體外成熟的預處理液(Pre-1VM液)。是在細胞體外培養常規的培養液成分的基礎上添加了綿羊小卵泡的SFF。在本發明的一個實施例中，所述預處理液為包含10% (v/v) SFF (體積比)和終濃度3mg/ml BSA的TCM199培養液。
[0027]本發明還提供了一種綿羊卵母細胞體外成熟的新方法。本發明人利用所述的預處理液(Pre-1VM液)對可用于體外成熟的綿羊卵母細胞進行預處理，然后再進行體外成熟培養。
[0028]在本發明的一些優選實施例中，所述可用于體外成熟的綿羊卵母細胞為A級(胞質均勻、多層卵丘顆粒細胞包裹)和B級(胞質均勻、少于3層卵丘顆粒細胞包裹或部分裸露)卵丘卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes, COCs)。
[0029]本發明的一些實施例中，所述預處理的步驟具體為將包括A、B級卵丘卵母細胞的卵丘卵母細胞復合體COCs用所述Pre-1VM液清洗2次，然后放入預先在CO2培養箱中平衡2h以上的所述Pre-1VM液中培養4h ;培養條件為:含5% CO2的空氣，溫度38.6°C，飽和濕度。所述體外成熟培養具體為將預處理后的COCs轉移到預先在CO2培養箱中平衡2h以上的IVM液中培養26h ;培養條件為:含5% CO2的空氣，溫度38.6°C，包和濕度；所述IVM液為包含終濃度10ug/ml的FSH、終濃度lug/ml的LH、終濃度lug/ml的E2以及10% (v/v)的FBS的TCM199培養液。
[0030]本發明中，所述預處理液由于含有能抑制減數分裂的SFF，能延長細胞質成熟的時間，促進卵母細胞積累豐富的母源mRNA和蛋白質，在一定程度上使得核質同步成熟，從而提高體外成熟的卵母細胞的質量。
[0031]經體外受精、體外培養實驗，實驗結果數據表明，結果證實，與常規的體外成熟方法相比，經本發明的預處理液處理過并使用本發明的方法體外成熟培養的卵母細胞受精后卵裂率和囊胚率顯著提高。
[0032]綜上，本發明利用綿羊小卵泡液有效抑制綿羊卵母細胞減數分裂，提供了一種包含天然的、生理性的減數分裂抑制物質——小卵泡液SFF的綿羊卵母細胞體外成熟的預處理液，同時建立了一種有效的綿羊卵母細胞體外成熟培養方法。通過小卵泡液預處理后促進了綿羊卵母細胞成熟，提高了綿羊卵母細胞的體外發育能力。本發明提供的預處理液及相關培養方法能夠成為一種新型有效的綿羊卵母細胞體外成熟培養體系，并在畜牧業胚胎工程生產上具有良好的應用前景。
[0033]根據市場需求，基于本發明提供的預處理液及綿羊卵母細胞體外成熟方法，提供了一種用于綿羊卵母細胞體外成熟的試劑盒，其核心試劑是上述預處理液。為完善該試劑盒的便捷度，本發明的一些實施例中，還包括本發明提供的具體的體外成熟培養液，配方為TCM199+10ug/ml FSH+lug/ml LH+lug/ml 的 E2+10% (v/v)的 FBS。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1是采用本發明所述的Pre-1VM液對綿羊卵母細胞進行體外成熟的方法示意圖
【具體實施方式】
[0035]下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細說明，但并不限制本發明的范圍。如無特殊說明，下述實施例中使用的操作均為常規方法，所采用的試劑均可以商購獲得。
[0036]主要儀器設備
[0037]CO2培養箱、恒溫臺、體視顯微鏡、超凈臺。
[0038]豐要試劑
[0039]FSH(Follicle stimulating hormone,促卵泡激素)、LH(Luteinizing hormone,黃體生成素)、E2 (Estrad1l,雌二醇)、FBS (Fetal bovine serum,胎牛血清)、TCM199 (Sigma)、BAS (bovine serum albumin,牛血清蛋白)、SOF 培養液(配方見表 I),所有試劑均為Sigma公司產品。
[0040]豐要牛物材料
[0041]綿羊的離體卵巢:收集于屠宰場。
[0042]實施例1預處理液的制備
[0043]步驟1.從綿羊的離體卵巢上l_3mm的卵泡中抽取卵泡液；
[0044]步驟2.將抽取的卵泡液在14000rpm下離心1min,抽取上清液,用0.45 μ m孔徑的濾膜過濾；
[0045]步驟3.所得濾液即SFF，將其按終濃度10% (v/v)加入至含有終濃度為3mg/mlBAS的TCM199中，配制得到所述Pre-1VM液。
[0046]實施例2綿羊卵母細胞體外成熟
[0047]步驟1.卵母細胞采集:使用1ml注射器從綿羊的離體卵巢表面抽取直徑4_6_卵泡。將抽取的卵母細胞放入10mm直徑的培養皿中，在體視顯微鏡下挑選出A級(胞質均勻、多層卵丘顆粒細胞包裹)和B級(胞質均勻、少于3層卵丘顆粒細胞包裹或部分裸露)卵丘卵母細胞復合體(COCs)用于體外成熟培養。
[0048]步驟2.卵母細胞預處理:將挑選出的A、B級COCs用Pre-1VM液清洗2次，然后放入預先在CO2培養箱中平衡2h以上的Pre-1VM液中培養，培養條件為含5% CO2的空氣，溫度38.6 °C，飽和濕度，培養時間為4h。
[0049]步驟3.卵母細胞成熟培養:IVM 液(TCM199+10ug/ml FSH+lug/ml LH+lug/mlE2+10% FBS)在CO2培養箱中平衡2h以上，經上一步處理后的綿羊卵母細胞移到IVM液中繼續進行體外成熟培養，培養時間為26h，培養條件為含5% CO2的空氣，溫度38.6°C，飽和濕度。體外成熟的方法流程示意圖詳見圖1。
[0050]實施例3綿羊卵母細胞成熟率驗證
[0051]實驗方法=
[0052]1.成熟的綿羊卵母細胞的培養
[0053]分別使用常規方法和本發明提供的方法制備兩類體外成熟的綿羊卵母細胞。
[0054]I類成熟的卵母細胞的制備方法為常規成熟法，步驟如下:
[0055]I)同實施例2步驟I
[0056]2) IVM 液(TCM199+10ug/ml FSH+lug/ml LH+lug/ml E2+10% FBS) CO2 培養箱中平衡2h以上，中進行體外成熟培養，將上一步采集的COCs置于IVM液在培養時間為24h，培養條件為含5% CO2的空氣，溫度38.6°C，飽和濕度。
[0057]II類成熟的卵母細胞的制備方法為同實施例2的步驟I~3。
[0058]2.體外受精
[0059]受精液:S0F+2%發情羊血清。用38_40°C水溫預熱園底的試管，放入凍精到試管中干解凍，另兩個園底的試管中各加入受精液0.5毫升，在CO2培養箱中預熱，把解凍的精液等分輕輕加入這兩個離心管底部，放入培養箱中浮育40分鐘，然后吸取上部精液，移入1.5ml的離心管中，離心，棄上清，再加入I毫升受精液離心洗滌，棄大部分上清，留大約150ul后將精液沉淀輕輕吹打混勻，根據精子濃度將適量精子加入50 μ L受精液中。
[0060]在孵育精子的同時，將步驟I得到的I類成熟的卵母細胞和II類成熟的卵母細胞分別在0.05%的透明質酸酶液中反復吹打沖洗一次，除去部分卵丘細胞，保留2-3層卵丘細胞。用受精液將卵母細胞洗滌2次，然后將15-20個成熟卵母細胞放入50 μ I的受精液。
[0061]表1 SOF培養液的組成成分
[0062]
【權利要求】
1.用于綿羊卵母細胞體外成熟的預處理液，其特征在于:在綿羊卵母細胞體外成熟的常規培養液中添加有綿羊小卵泡液。
2.根據權利要求1所述的預處理液，其特征在于:所述綿羊小卵泡液的終濃度為10%(v/v)。
3.根據權利要求1所述的預處理液，其特征在于:所述綿羊卵母細胞體外成熟的常規培養液為含終濃度3mg/ml BSA的TCM199培養液。
4.一種綿羊卵母細胞體外成熟方法，其特征在于包括如下步驟: 1)從綿羊離體卵巢中采集綿羊卵母細胞； 2)將所述綿羊卵母細胞放入權利要求1~3任一所述的預處理液中進行預處理； 3)將預處理后的綿羊卵母細胞轉移至體外成熟培養液中進行體外成熟培養。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述體外成熟培養液的配方為:TCM199+10ug/ml FSH+lug/ml LH+lug/ml E2+10% (v/v)的 FBS。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述綿羊卵母細胞指A級卵丘卵母細胞復合體和/或B級卵丘卵母細胞復合體；所述A級卵丘卵母細胞復合體表現為胞質均勻、多層卵丘顆粒細胞包裹級卵丘卵母細胞復合體表現為胞質均勻、少于3層卵丘顆粒細胞包裹或部分裸露 。
7.根據權利要求4或5或6所述的方法，其特征在于:所述的預處理的步驟如下:將A、B級COCs用所述預處理液清洗2次，然后放入預先在CO2培養箱中平衡2h以上的所述預處理液中培養4h ;培養條件為:含5% CO2的空氣，溫度38.6 °C，飽和濕度。
8.根據權利要求5~7任一所述的方法，其特征在于:所述體外成熟培養的步驟如下:將預處理后的COCs轉移到預先在CO2培養箱中平衡2h以上的所述外成熟培養液液中培養26h ;培養條件為:含5% CO2的空氣，溫度38.6°C，飽和濕度。
9.權利要求1所述的預處理液的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)從綿羊離體卵巢上l_3mm的卵泡中抽取卵泡液； 2)將抽取的卵泡液在HOOOrpm下離心10min，抽取上清液，用0.45μπι孔徑的濾膜過濾； 3)所得濾液SFF與綿羊卵母細胞體外成熟預處理的常規培養液成分配制得到所述預處理液。
10.用于綿羊卵母細胞體外成熟的試劑盒，其特征在于:包含權利要求1~3任一所述的預處理液。
11.根據權利要求10所述的試劑盒，其特征在于:還包括體外成熟培養液,所述體外成熟培養液的配方如下:TCM199+10ug/ml FSH+lug/ml LH+lug/ml 的 E2+10% (v/v)的 FBS。
【文檔編號】C12N5/075GK104130973SQ201410369750
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】張家新, 趙麗霞, 陳秀亮 申請人:張家新