一種檢測肉牛ucp3基因單核苷酸多態性的方法
【專利摘要】本發明公開了牛UCP3基因單核苷酸多態性位點及其檢測方法，以包含UCP3基因的待測牛全基因組DNA為模版，以引物對P1為引物，PCR擴增牛UCP3基因，然后進行SSCP多態性檢測。其基因多態性位點包括：在牛的UCP3基因第5191位為A或G的堿基多態性。本發明把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決了SSCP的不穩定性，以防突變位點的漏檢，提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與牛肉質性狀密切相關的遺傳標記，可用于牛的輔助選擇和分子育種。
【專利說明】—種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子遺傳學領域，涉及一種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態性的方法，
以牛的肉用性狀基因的單核苷酸多態性(SNP)作為分子遺傳標記，特別涉及牛的UCP3(解偶聯蛋白3)基因的單核苷酸多態性位點及其應用。
【背景技術】
[0002]隨著經濟的發展，人們對于牛肉的數量和品質要求日益提高。雖然我國已成為第三大養牛與牛肉生產國，但是高檔大部分依賴于進口。因此提高肉用性能勢在必行，途徑主要有改善飼料營養，加強飼養管理水平和培育優良品種等，而良種是肉牛業發展的先決條件和物質基礎。人們在了解肉用性狀的遺傳規律和相應的生長發育、脂肪沉積等生命活動調控規律的基礎上，結合分子生物學方面的研究，發現了與肉用性狀有密切聯系的功能基因和主效基因以及和這些基因連鎖的分子遺傳標記，根據目標性狀與候選基因基因型間的關聯性進行選擇，提高了育種方向的準確性，縮短了育種年限。
[0003]單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP所表現的多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(transit1n)或顛換(transvers1n)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種:一種是同義cSNP (synonymous cSNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP (non-synonymous cSNP),指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發生改變，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。
[0004]分子生物學的發展為分子標記輔助選擇提供了理論基礎和技術支持，通過檢測功能基因某位點的多態性，對不同基因型個體與其生產性能進行關聯分析，找出優勢基因型和優勢等位基因，為選種提供依據，這一過程中檢測多態性和基因分型的準確是很關鍵的。目前主要的方法有PCR-RFLP技術或PCR-SSCP技術結合DNA測序。
[0005]UCP3基因編碼解偶聯蛋白3 (uncoupling protein 3, UCP3),該蛋白是解偶聯蛋白超家族成員之一，最早是1997年Boss在人類骨骼肌中發現的。解偶聯蛋白鑲嵌在線粒體內膜上，是哺乳動物線粒體的質子載體，在氧化磷酸化解偶聯、抗氧化和能量代謝調控中發揮重要作用。在豬的分子育種中已經發現，豬UCP3基因對日增重、脂肪沉積、飼料轉化率和小豬初生重有重要影響。牛UCP3基因定位于牛15號常染色體。Sherman等(2008)發現牛UCP3基因內含子3 —個A/G多態與歐洲牛與大不列顛雜交牛的平均日增重和局部生長效率顯著相關。Li等(2010)發現南陽牛、魯西牛、延邊牛中UCP3基因BglI酶切多態等位基因A比等位基因B頻率更高。關聯分析顯示魯西牛中AA型比AB型β_球蛋白含量更優。結果還顯示UCP3基因BglI酶切多態與南陽牛的生長性狀顯著相關，AB基因型個體優于其他個體，表明這一多態位點與牛的生長性狀相關。Brennan等(2009)發現UCP3基因的mRNA水平表達量的提高與脂肪酸β -氧化和牛體重損失產生的脂肪酸副產物有關。本發明提供的檢測方法為UCP3基因SNP與肉質性狀關系的建立奠定了基礎，以便用于肉牛肉質性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的肉牛種群。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種牛UCP3基因SNP的篩查和檢測方法，利用PCR產物混合測序的方法篩查牛UCP3基因的多態性位點。通過關聯分析尋找與牛肉質性狀相關的SNP作為分子標記，以功能SNP作為牛分子育種和輔助選擇的標記，加快良種選育速度和提聞種群品質。
[0007]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
本發明根據UCP3基因的外顯子設計引物，分別以8種牛品種的基因組DNA為模版，進行PCR擴增，對PCR產物混合并純化，測序后得到牛UCP3的部分序列。
[0008]一種用于檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態性的引物，所述的引物對Pl為:
正向引物 5’-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3’ ；
反向引物 5’ -ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3’。
[0009]一種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態性的方法，包括以下步驟: (1)以包含UCP3基因的待測牛基因組DNA為模版，以引物對Pl為引物，PCR擴增牛UCP3基因;
(2)對步驟⑴的擴增產物進行PCR目的片段檢測；
⑶對步驟⑵的目的片段進行PCR-SSCP檢測:首先對目的片段分別用變性劑進行變性處理，然后根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果判定其多態性位點。
[0010]所述多態性位點包括:在牛的UCP3基因第5191位為A或G的堿基多態性位點，表現為ΑΑ、AG、GG三種基因型。
[0011]所述的PCR擴增反應程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s ;60°C退火40s ；72°C延伸30s ;72°C延伸7min ;4°C保存。
[0012]所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
[0013]用變性劑對PCR擴增產物進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定牛UCP3基因是否有多態性。
[0014]所述的聚丙烯酰胺凝膠的質量濃度為10%。
[0015]所述的根據PCR-SSCP分析結合DNA測序結果顯示，UCP3基因片段5086-5354 (命名為UC-3片段)有AA、AG、GG3種基因型。
[0016]檢測牛UCP3基因單核苷酸多態性位點的方法在牛輔助選擇和分子育種上的應用。
[0017]本發明對8個牛品種上述SNP進行了基因分型和基因頻率分析，同時也對SSCP多態位點與牛肉質性狀之間進行了關聯分析。
[0018]本發明的優點在于:
與現有技術相比，本發明把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決了SSCP的不穩定性，以防突變點的漏檢，提供了一種簡單、快速、精確度高的方法，便于推廣應用在DNA水平上篩查和檢測與牛肉質性狀密切相關的遺傳標記，可用于牛的輔助選擇和分子育種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是引物Pl擴增不同牛個體(牛UCP3基因第5191位多態位點)PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為600bp Marker, 1-9為PCR產物
圖2是本發明中PCR產物混合測序篩查到的牛UCP3基因序列第5191為A或G突變測序結果圖。
[0020]圖3是本發明牛UCP3基因第5191位多態位點聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。其中I為AG型，2、4、5為AA型，3為GG型。
【具體實施方式】
[0021]為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體實施例對本發明進一步說明。
[0022]本發明根據UCP3基因的外顯子和內含子設計引物，分別以8個牛群體的基因組DNA為模版，進行PCR擴增，混合PCR產物并對其純化，測序。然后，進行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統計分析和肉質性狀的關聯分析，篩選出與牛肉質性狀密切相關的分子標記。下面對本發明做詳細說明，所述是本發明的解釋而不是限定。
[0023]實施例1
一、 牛UCP3基因部分DNA序列的擴增及其多態性檢測 1、牛樣品的采集和處理
本發明采用8個牛群體共計318個個體，具體為:(I)安格斯(Angus)牛血液樣品18份，晉南牛(Jinnan)血液樣品23份,利木贊(Limousin)牛血液樣品22份,魯西黃牛(Luxi)血液樣品29份,秦川牛(Qinchuan)血液樣品27份,西門塔爾(Simmental)牛血液樣品30份，夏洛萊(Charolais)牛血液樣品29份，采自河北大廠縣華安肉牛育肥場；(2)安格斯(Angus)牛血液樣品30份,海福特(Hereford)牛血液樣品30份,西門塔爾(Simmental)牛血液樣品28份，采自內蒙古通遼三元肉牛育肥場；(3)西門塔爾(Simmental)牛血液樣品，采自內蒙古通遼寶龍山肉牛育肥場。從每頭牛的頸靜脈采血8 mL于10 mL管中，加A⑶抗凝劑(血液與ACD體積比為6:1)搖勻，將血樣用加冰塊的泡沫箱帶回實驗室，于_80°C超低溫冰箱保存備用。
[0024]2、基因組DNA的提取
(I)冰凍血樣室溫下融化、搖勻，用移液槍吸取1.5mL全血加入5mL離心管中，加入1.5mL (或與血樣等體積)PBS緩沖液,顛倒混勻1min, 12000r/min離心1min,結束后可看到離心管底部白細胞沉淀。
[0025](2)棄上清液，重復(I)的步驟I~2次，至下層白細胞內無紅細胞。
[0026](3)棄上清液，加入ImL裂解液SET，40 μ L 10% SDS，20 μ L蛋白酶K溶液，振蕩器振蕩2~3min，使之充分混勻，至于恒溫水浴振蕩器中55°C水浴，消化過夜至不見粘稠團塊。
[0027](4)向管中加入與管內液體等體積的Tris飽和酚(約1.5mL)，蓋緊管蓋，緩慢連續顛倒混合不少于1min, 12000r/min離心10min。
[0028](5)小心吸取上清液至新的5 mL離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25: 24:1)混和液,緩慢顛倒離心管不少于1min,使溶液兩相充分混勻，12000r/min離心1min0
[0029](6)轉移上清液至另一離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，混勻，12000r/min 離心 lOmin。
[0030](7)轉移上清液至新的離心管，加入2倍體積預冷的無水乙醇，蓋緊管蓋，順一個方向水平搖晃數次即可看到白色絮狀DNA沉淀，離心4min，使DNA貼附在離心管管壁下部。
[0031](8)用預冷的75%乙醇洗滌兩次，小心倒出乙醇，室溫放置。
[0032](9)乙醇揮發后，加入10yL ddH20溶解，4°C放置，24h后，將DNA溶液轉移至滅菌的1.5mL離心管中，_20°C保存備用。
[0033]3、DNA濃度和純度檢測
(I)瓊脂糖凝膠電泳檢測
取5 μ L DNA 溶液，與I μ L上樣緩沖液(6X loading buffer)混勻，于1%的瓊脂糖凝膠中以100V電壓電泳30min左右，結束后利用凝膠成像系統拍照，初步觀察DNA的純度。詳見圖1。
[0034](2)紫外分光光度計檢測
將5 μ I待測DNA溶液充分溶于ddH20，并定容至1ml。利用紫外分光光度計測得其260nm和280nm波長處的OD值。根據以下公式計算DNA純度和濃度:
DNA 濃度=OD260 X 50ng/ μ I X 200
DNA 純度=0D26Q/0D28。
若DNA純度在1.8-2.0之間，則DNA純度較高；若小于1.8，則樣品中可能存在RNA污染；若大于2.0，則樣品中可能存在蛋白質污染。經紫外分光光度計測定OD值為1.72，純度較聞。
[0035]擴增引物設計
根據GeneBank數據庫提供的牛UCP3基因的DNA序列(序列號:NC_007312.5)和mRNA序列(序列號:NM-174314.2)，利用DNAStar軟件進行比對，確定外顯子和內含子，利用Primer 5.0對引物進行設計和評價；
擴增引物為:
正向引物 F: 5’-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3’ ；
反向引物 R: 5’ -ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3’。
[0036]二、 PCR 擴增
分別以8個牛品種的DNA為模版，用上述引物進行PCR擴增，PCR總反應體系為32 μ L，見表1 ;PCR總反應程序，見表2 ；
表1本發明的PCR反應體系
【權利要求】
1.一種用于檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態性的引物，其特征在于:所述的引物對Pl為: 正向引物 F: 5’-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3’ ； 反向引物 R: 5’ -ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3’。
2.一種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)以包含UCP3基因的待測牛基因組DNA為模版，以引物對Pl為引物，PCR擴增牛UCP3基因; (2)對步驟⑴的擴增產物進行PCR目的片段檢測； ⑶對步驟⑵的目的片段進行PCR-SSCP檢測:首先對目的片段分別用變性劑進行變性處理，然后根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果判定其多態性位點。
3.根據權利要 求2所述的一種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于:所述多態性位點包括:在牛的UCP3基因第5191位為A或G的堿基多態性位點，表現為AA, AG, GG三種基因型。
4.根據權利要求2所述的檢測牛UCP3基因單核苷酸多態性位點的方法，其特征在于，所述的PCR擴增反應程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s ;60°C退火40s ;72°C延伸30s ;72°C延伸 7min ;4°C保存。
5.根據權利要求2所述的檢測牛UCP3基因單核苷酸多態性位點的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
6.一種如權利要求2所述的檢測牛UCP3基因單核苷酸多態性位點的方法在牛輔助選擇和分子育種上的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104131096SQ201410361884
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】甘乾福, 喬慧, 梁學武, 陳佳欽 申請人:福建農林大學