一株產幾丁質酶的菌株及其在酶解幾丁質中的應用的制作方法

一株產幾丁質酶的菌株及其在酶解幾丁質中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株產幾丁質酶細菌，經分類鑒定后命名為Chitinibactersp.GC72，目前該菌保存于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCCNO：M2014113，保藏日期：2014年4月1日。本發明公開了該菌株適宜的培養條件和發酵產酶條件，并對其粗酶進行了酶學性質分析、水解產物分析，證實該菌分泌的幾丁質酶能有效降解幾丁質，降解產物主要為N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
【專利說明】一株產幾丁質酶的菌株及其在酶解幾丁質中的應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，特別涉及一株從自然界篩選獲得的高效幾丁質降解菌株及該菌株在酶解幾丁質中的應用。

【背景技術】
[0002]幾丁質，別名甲殼素，主要存在于甲殼綱動物外殼、昆蟲外殼、真菌細胞壁中，是自然界中含量僅次于纖維素的第二大天然高分子化合物，由單體N-乙酰-D-氨基葡萄糖通過β -1, 4-糖苷鍵連接而成。幾丁質經降解后可以生成多種產物，主要包括幾丁寡糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、殼聚糖、氨基葡萄糖等。這些產物目前在化工、食品、醫藥、材料、農業等領域應用廣泛。截至2011年，作為營養補充劑的氨基葡萄糖及其衍生物產品的全球銷售額已逾20億美元，預計到2017年，全球氨基葡萄糖產量可達46，600噸。
[0003]目前85%的商用氨基葡萄糖產品是通過酸水解海洋甲殼動物的外殼而獲得的。酸法降解幾丁質會產生大量的酸堿廢液，不僅會對環境造成污染，而且降解過程難以控制，產物混雜，生物學活性難以保證。目前也有嘗試利用微波輻射法水解幾丁質，通過控制水解時間和微波強度可得到不同分子量的產物，但是該法不僅生產技術要求高，難以推廣，而且對操作者可能會造成身體傷害。目前研究的熱點是酶法降解幾丁質，它具有條件溫和，成本低，產物活性高，環境友好的優點，在幾丁質高值化利用方面具有巨大的潛力，是目前功能性食品、材料科學及醫藥等領域的研究熱點之一。例如，中國專利CN 03112043.1公開了一種利用豚鼠氣單胞菌酶解幾丁質獲得幾丁質寡聚糖的方法。目前生物酶法降解幾丁質的主要產品是生產甲殼寡糖，獲得純度較高的N-乙酰-D-氨基葡萄糖仍較困難。


【發明內容】

[0004]本發明的第一目的是提供一株高效降解幾丁質的菌株，利用該菌所分泌的幾丁質酶可降解幾丁質獲得N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
[0005]為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
一株產幾丁質酶的菌株，其特征在于，其分類命名為如ciersp.QCl2,已于2014年4月I日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號=CCTCC NO:Μ 2014113。
[0006]本發明菌株的形態學及生理生化特征如下:
菌落顏色:乳白色。
[0007]需氧方式:需氧生長。
[0008]菌落大小:1.9 X0.8 μ m 適宜生長溫度:34-40°C。
[0009]適宜生長pH: 6-8
菌體形態:短桿狀、鐮刀彎曲狀。
[0010]革蘭氏染色:陰性。
[0011] 耐鹽生長范圍:0%_1% NaCl。
[0012]UChitinibacters^.GC72篩選方法,具體包括如下步驟:
(一)樣品米集
我們從安徽阜陽市、江蘇南京市兩地獲得土壤、腐爛蝦殼共27份樣品，及時存于4°C保藏備用。
[0013](二)富集培養
取50 mL肉湯培養基裝于500 mL三角瓶中，滅菌后接入待篩樣品0.1 g，37°C、200 r/min條件下搖瓶培養24 h,得到富集的菌液。
[0014](三)平板透明圈篩選
用無菌單層濾紙將富集培養液過濾，梯度稀釋至適當濃度，吸取約0.2 mL稀釋液涂布于篩選培養基平板，37°C培養5 d，觀察、挑取產透明圈菌株(見附圖1)將篩選獲得的菌株點樣于篩選培養基平板上復篩，37°C培養5 d，以菌體生長速度和透明圈大小為標準，擇優菌株做斜面保藏。
[0015](四)搖瓶復篩
50 mL搖瓶篩選培養基裝于500 mL三角瓶中，每瓶接入I環復篩菌株斜面菌種，37°C、200 r/min振蕩培養3 d，發酵液離心得粗酶液，測定酶活力，最終保留產酶活力最高的菌株，其中一株細菌幾丁質酶活達0.57 U/mL，命名為如ciersp.GC72。
[0016]其中各培養基成分如下:
富集培養基:腦心浸液肉湯(BHI)；
篩選培養基:20%濃度為0.5%的膠體幾丁質、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L ；
發酵培養基:葡萄糖I g/L、粉粒幾丁質2 g/L、蛋白胨I g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。
[0017]本發明的第二個目的是提供上述菌株在發酵產幾丁質酶中的應用。
[0018]優選的,所述菌株的培養條件為葡萄糖I~4 g/L、蛋白胨2~10 g/L、酵母膏2~10 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。培養溫度為20~37°C，200 rpmο
[0019]優選的，所述菌株發酵產酶的條件為培養基組分為菊芋粉I~8 g/L、蛋白胨2~8g/L、牛肉膏2~10 g/L、粉粒幾丁質I~10 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。初始pH:6~8，發酵溫度30°C。轉速:200 rpm,通氣量:0.5~I wm。
[0020]本發明的第三個目的是提供利用本發明菌株所產幾丁質酶酶解幾丁質生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖的應用。
[0021]優選的，所述的酶解條件為酶解溫度20~40°C，進一步的，酶解溫度為40°C。
[0022]優選的，所述的酶解條件為適宜的酶解pH值6.0~8.0，進一步的酶解pH值為
6.8_7.2 ο
[0023]優選的，所述的酶解條件為向酶解體系中加入Ca2+、Mg2+、Fe2+，進一步的為加入Ca2+。
[0024]優選的，所述的Ca2+濃度為10 mmol/L。
[0025]對該菌的培養條件和產酶條件進行研究的基礎上提純發酵培養基酶液，利用制備的粗酶液進行幾丁質水解實驗。以不同類型、濃度的幾丁質作為底物，通過液相、質譜分析酶解產物。
[0026]本發明的有益效果:
本發明菌株菌所分泌的幾丁質酶可降解幾丁質獲得N-乙酰-D-氨基葡萄糖，經發酵培養基組分及培養條件的優化，在I L發酵體系下，該菌粗酶液的酶活高達0.9 U/mL，所產幾丁質酶可迅速降解幾丁質，其中，降解0.5%濃度膠體幾丁質2 h的產物收率達86.16%，降解粉粒幾丁質(粒徑150 nm)12 h的產物收率達65.36%，且降解產物純度高，經液相和質譜分析0.5%膠體幾丁質的酶解產物主要成分為N-乙酰-D-氨基葡萄糖，無幾丁二糖。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]風\為Chitinibacter sw GC72單菌落在篩選培養基上所產透明圈情況。
[0028]圖2為提純后的粗酶液適宜的酶解pH圖。
[0029]圖3為粗酶液降解幾丁質產物的液相分析圖。
[0030]圖4為粗酶液降解幾丁質產物的質譜分析圖。
[0031]本發明的菌株,其分類命名為CXiiifliAacier sp.GC72,已于2014年4月I日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址，中國.武漢.武漢大學，保藏編號=CCTCC NO:M 2014113。

【具體實施方式】
[0032]下面列舉實施例對本發明進行進一步說明，但并不因此限制本發明的內容。
[0033]實施例以培養基內菌體干重(DCW)作為菌體對不同碳氮源嗜好性的評價指標，以酶活(U/mL)高低表征菌體產酶適宜的碳氮源。研究結果表明最適該菌生長的碳源、有機氮源、無機氮源分別是葡萄糖、酵母提取物、硝酸銨；最適該菌產酶的碳源、有機氮源、無機氮源分別是菊芋粉、牛肉膏和尿素。另外以酶活高低為指標表示該菌所產幾丁質酶最適酶解溫度、酶解體系pH、貯藏穩定性以及金屬離子對酶的影響。
[0034]實施例1:本實施例說明CXiiifliAaciersp.GC72的篩選方法 Chitinibacters1Q.GC72篩選方法,具體包括如下步驟:
(一)樣品米集
我們從安徽阜陽市、江蘇南京市兩地獲得土壤、腐爛蝦殼共27份樣品，及時存于4°C保藏備用。
[0035](二)富集培養
取50 mL肉湯培養基裝于500 mL三角瓶中，滅菌后接入待篩樣品，37°C、200 r/min條件下搖瓶培養24 h，得到富集的菌液。
[0036](二)平板透明圈篩選
用無菌單層濾紙將富集培養液過濾，梯度稀釋至適當濃度，吸取約0.2 mL稀釋液涂布于篩選培養基平板，37°C培養5 d，觀察、挑取產透明圈菌株(見附圖1)。將篩選獲得的菌株點樣于篩選培養基平板上復篩，37°C培養5 d，以菌體生長速度和透明圈大小為標準，擇優菌株做斜面保藏。
[0037](四)搖瓶復篩
50 mL搖瓶篩選培養基裝于500 mL三角瓶中，每瓶接入I環復篩菌株斜面菌種，37°C、200 r/min振蕩培養3 d，發酵液離心得粗酶液，測定酶活力，最終保留產酶活力最高的菌株，其中一株細菌幾丁質酶活達0.57 U/mL，命名為如ciersp.GC72。
[0038]其中各培養基成分如下:
富集培養基:腦心浸液肉湯(BHI)；
篩選培養基:20%濃度為0.5%的膠體幾丁質、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L ；
發酵培養基:葡萄糖I g/L、粉粒幾丁質2 g/L、蛋白胨I g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。
[0039]實施例2:本實施例說明CXiiifliAaciersp.GC72鑒定方法
該菌株的鑒定:提取該菌基因組后設計引物對其16S rDNA進行擴增并測序，將測序結果與GeneBank中的序列進行比較，發現該菌與其同源性最高的模式式菌株均屬于Chitinibacter菌屬。判斷該菌為變形菌綱、奈瑟菌目、奈瑟菌科、Chitinibacter屬，命名為CXiiifliAaciersp.GC72。該菌株的形態、生理生化特征如下:
菌落形態及顏色:圓形，乳白色。菌體形態:短桿狀彎曲狀。革蘭氏染色:陰性。菌落大小:1.9 X0.8 μπι。需氧方式:好氧生長。生長溫度:35-40 °C。生長pH: 6_10。耐鹽生長范圍:0%-1% NaCl。
[0040]實施例3:本實施例說明CXiiifliAaciersp.GC72在發酵產幾丁質酶中的應用種子培養基:葡萄糖4 g/L、蛋白胨4 g/L、酵母膏4 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀 0.7 g/L、硫酸鎂 0.5 g/L。
[0041]產酶培養基:菊芋粉2 g/L、蛋白胨4 g/L、牛肉膏4 g/L、粉粒幾丁質3 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。
[0042]產酶條件:1L發酵罐體系下，接種量5%，初始ρΗ:7.5，溫度:30°C、發酵周期:96h,轉速:200 rpm,通氣量:I vvm。
[0043]在以上實施條件下進行發酵，并進行酶活測定:取發酵液上清酶液100 uL，l%膠體幾丁質500 uL, pH 7.0的磷酸緩沖液1.4 mL，按上述體系加樣并混勻，加入磁力攪拌轉子后置于37°C恒溫水浴條件下攪拌30 min。酶解結束后立刻沸水浴5 min，待體系冷卻后加入DNS試劑2 mL,混勻后沸水浴5 min。冷卻至室溫后5000 rpm離心5 min,取上清液在535 nm處檢測吸光度值,重復實驗二次獲得平均值,并以N-乙酸-D-氨基匍萄糖標準曲線為依據計算還原糖含量。同時以高溫滅菌的發酵液上清酶液做對照實驗，酶活的定義為37°C條件下每分鐘釋放相當于I μπιο?所需的酶量為一個酶活單位(U)。
[0044]經測定所得的粗酶液酶活可達0.9 U/mL。
[0045]實施例4:本實施例說明CXiiifliAaciersp.GC72在發酵產幾丁質酶中的應用種子培養基:葡萄糖I g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏10 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀 0.7 g/L、硫酸鎂 0.5 g/L。
[0046]產酶培養基:菊芋粉8 g/L、蛋白胨2 g/L、牛肉膏2 g/L、粉粒幾丁質I g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。
[0047]產酶條件:IL發酵罐體系下，接種量5%，初始pH:8，溫度:37°C、發酵周期:96 h,轉速:200 rpm,通氣量:1 vvm。
[0048]在以上實施條件下進行發酵，并進行酶活測定，所用方法同實施例3。
[0049]經測定所得的粗酶液酶活可達0.66 U/mL。
[0050]實施例5:本實施例說明如ctersp.GC72在發酵產幾丁質酶中的應用種子培養基:葡萄糖4 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏2 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀 0.7 g/L、硫酸鎂 0.5 g/L。
[0051]產酶培養基:菊芋粉8 g/L、蛋白胨8 g/L、牛肉膏10 g/L、粉粒幾丁質10 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。
[0052]產酶條件:IL發酵罐體系下，接種量5%，初始pH:6，溫度:37°C、發酵周期:96 h,轉速:200 rpm,通氣量:1 vvm。
[0053]在以上實施條件下進行發酵，并進行酶活測定，所用方法同實施例3。
[0054]所得的粗酶液酶活可達0.78 U/mL。
[0055]實施例6:本實施例說明本發明菌株所產幾丁質酶酶解幾丁質生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖的應用
本發明菌株所產幾丁質酶可迅速降解幾丁質，其中，降解0.5%濃度膠體幾丁質2 h的產物收率達86.16%，降解100目篩粉粒幾丁質12 h的產物收率達65.36%，且降解產物純度高，經液相和質譜分析0.5%膠體幾丁質的酶解產物主要成分為N-乙酰-D-氨基葡萄糖，無幾丁二糖(見附圖2、4)。
[0056]實施例7:本實施例說明本發明菌株所產幾丁質酶酶解幾丁質生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖的應用(PH值對酶解過程的影響)。
[0057](I)粗酶的制備:
離心發酵液保留上清，采用飽和硫酸銨分級沉淀法沉淀目標蛋白并利用透析法去除過量鹽離子，獲得粗酶液后經真空冷凍干燥獲得粗酶。
[0058](2) pH值對酶解過程的影響:
分別向轉化體系內加入不同PH值的磷酸緩沖液，在相同的條件下進行轉化實驗，以獲得體系PH值對酶解過程的影響結果，最終研究表明該酶適宜的酶解pH為6.8-7.2(見附圖3)。
[0059]實施例8:本實施例說明本發明菌株所產幾丁質酶酶解幾丁質生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖的應用(溫度對酶解過程的影響)。
[0060]在相同的轉化條件下(同實施例7)，變量改為溫度，通過調節轉化溫度發現隨著溫度的升高，酶活持續上升，最適的酶解溫度為40°C，當溫度升高到45°C時，酶活會迅速下降。
[0061] 實施例9:本實施例說明本發明菌株所產幾丁質酶酶解幾丁質生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖的應用(金屬離子對酶解過程的影響)。
[0062]對該幾丁質酶的研究表明Ca2+、Mg2+、Fe2+對酶解過程有促進作用，向酶解體系內加入終濃度為10 mmol/L的Ca2+可提高43%的酶活，Mg2+、Fe2+則分別提高酶活37.82%和33.07%。而Al3+、Cu2+、Zn2+強烈抑制該酶解過程，向酶解體系內加入10 mmol/L的Al3+可完全抑制該酶的酶解過程，Cu2+、Zn2+則分別抑制了 65.36%,62.04%酶活。
[0063]實施例10:本實施例說明本發明菌株所產幾丁質酶貯藏穩定性
在4°C條件貯藏粗酶液，每24 h檢測一次酶活以檢測該酶的貯藏穩定性。實驗表明貯藏216 h后，該酶仍保持92%的酶活，具有良好的貯藏穩定性。
[0064]雖然結合具體實施例對本發明的具體內容進行了詳細的說明，但并非是對本專利保護范圍的限定。在權利要求書所限定的范圍內，本領域的技術人員不經創造性勞動即可做出的各種修改和調整仍受本專利保護。
【權利要求】
1.一株產幾丁質酶的菌株，其特征在于，其分類命名為CXiiifliAaciersp.GC72,已于2014年4月I日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號:CCTCC NO:M 2014113。
2.上述權利要求1所述的菌株在發酵產幾丁質酶中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述菌株的培養條件為葡萄糖I~4g/L、蛋白胨2~10 g/L、酵母膏2~10 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂 0.5 g/L, 培養溫度為20~37°C，200 rpm。
4.根據權利要求2-3所述的應用，其特征在于，所述菌株發酵產酶的條件為培養基組分為菊芋粉I~8 g/L、蛋白胨2~8 g/L、牛肉膏2~10 g/L、粉粒幾丁質I~10 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.7 g/L、硫酸鎂0.5 g/L，初始pH:6~8，發酵溫度30°C，轉速:200 rpm,通氣量:0.5~I vvm。
5.利用上述權利要求2-4所產幾丁質酶酶解幾丁質生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的酶解條件為酶解溫度為20~400C，優選的酶解溫度為40°C。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的酶解條件為適宜的酶解pH值為.6.0~8.0，優選的為6.8-7.2。
8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的酶解條件為向酶解體系中加入Ca2+、Mg2+、Fe2+，優選加入終濃度為 10 mmol/L Ca2+。
【文檔編號】C12N9/42GK104130961SQ201410361719
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】陳可泉, 高聰, 何珣, 張阿磊, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學