一種增強植物耐鹽性的擬南芥AtPGK2基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明克隆了一種增強植物耐鹽性的擬南芥3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2，并公開了其應用。該基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，也包括與SEQIDNO:1核苷酸序列同源性在90～100%之間的基因。本發明同時還提供了重組載體的構建和轉基因的方法以應用上述基因，可培育耐鹽性更強的轉基因植物新品種，具有廣泛的應用價值。
【專利說明】-種增強植物耐鹽性的擬南芥基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物基因工程領域，具體說是利用分子生物學技術獲得一種能夠增強 植物耐鹽性的基因及其在轉基因植物中的應用。
【背景技術】
[0002] 土壤鹽漬化在全世界都十分嚴重，鹽脅迫是影響全球農作物產量的重要非生物脅 迫之一（Parvaiz and Satyawati, 2008)。我國鹽漬土面積大、分布廣、類型多，約占國土 面積的10%，而且每年鹽堿化和次生鹽堿化都在不斷加重，使農業生產的可持續發展受到威 脅，嚴重影響植物的生長發育和經濟作物的產量與品質(孫建昌等，2008)。因此，培育耐鹽 性增強的轉基因農作物新品種是一項十分迫切的任務。
[0003] 植物基因工程是指在生物體外，利用工具酶對DNA分子進行"剪接"和"拼接"形 成重組的DNA分子，將其轉化植物細胞并使其表達。目前，利用植物基因工程培育耐鹽性 增強的轉基因植物新品種已取得一定的進展。許多研究表明，將植物的耐鹽相關基因導入 自身或者其他物種的細胞并產生轉基因植株，可以顯著增強轉基因植物的耐鹽能力。如在 擬南芥中過量表達玉米的基因能夠提高轉基因植株在萌發期和幼苗期對鹽脅迫的 耐受性（Wang et al.，2007);Chen等（2008)利用組成型啟動子dKJ仍驅動擬南芥 基因在蕎麥中過量表達，轉基因蕎麥植株中主要營養成分的含量未受高鹽脅迫的影 響；Liang等（1997)利用dK J仍啟動子驅動菠菜的似Μ基因在煙草植株中過量表達， 轉基因煙草的耐鹽性顯著提高。
[0004] 植物的3_磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase, PGK)作為重要的酶催 化3-磷酸甘油酸和1，3-二磷酸甘油酸之間的互變，在碳固定、糖酵解和糖異生代謝中具 有重要功能（Blake and Rice, 1981; Watson et al·，1982)。目前，許多編碼 PGKs 的 基因在植物、動物和微生物中被克隆（Watson and Littlechild，1990)。在植物中，如豌 豆（Pacold and Anderson, 1975)、小麥（Longstaff et al·，1989)、大麥（McMorrow and Bradbeer, 1990)、疲菜（Kopke-Secundo et al·，1990)和番爺（Rao et al·，1995)等 的PGKs先后被分離和克隆，并且其編碼的蛋白多數被純化用于酶活性研究。序列分析表 明，高等植物的PGKs由兩個細胞核基因編碼，其編碼蛋白的氨基酸序列具有較高的同源 性，其中，一個基因編碼的氨基酸序列在N-末端有一段大約由70個氨基酸組成的定位于 葉綠體的轉運肽，相反，另一個基因編碼的氨基酸序列在N-末端并無轉運肽序列。因此， 推測由高等植物細胞核編碼的兩個PGKs分別定位于葉綠體和細胞質（Longstaff et al.， 1989; Kitayama and Togasaki, 1995)。以上所述對高等植物PGKs基因的分離、克隆、序 列分析和其編碼蛋白的酶活性研究多數集中在上世紀后期。進入本世紀，雖然近期有研究 表明在鹽脅迫條件下，植物體內PGK蛋白的含量顯著增加 （Kosova et al.，2011; Wang et al.，2013)，但是對于其生理功能特別是參與植物響應鹽脅迫的功能尚不清楚。
[0005] 植物為適應鹽脅迫，以最大限度減少鹽脅迫對自身的傷害，從對鹽脅迫信號的感 知、胞間信號傳遞和胞內信號轉導到最終調控脅迫響應基因的表達，使植物產生一系列形 態、生理和生化的變化來抵御鹽脅迫（Zhu, 2002; Jiang and Deyholos, 2006; Radi et al.，2013)。為了挖掘植物耐鹽基因并培育耐鹽性增強的轉基因植物，本發明克隆了擬南 芥編碼3-磷酸甘油酸激酶基因將該基因轉化模式植物擬南芥，發現轉基因擬南芥 植株對鹽脅迫的耐受性明顯增強。
【發明內容】
[0006] 本發明目的是分離和克隆植物的耐鹽基因，并對其參與鹽脅迫響應的功能進行鑒 定，提供一種分子生物學模式植物擬南芥3-磷酸甘油酸激酶基因及其在轉基因植 物中的應用。
[0007] 本發明提供了一種新的、1437 bp的擬南芥3-磷酸甘油酸激酶基因序列， 該基因的核酸序列選自： (a) 如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； (b) 在（a)限定的核酸序列中具有90?100%之間的同源性核苷酸序列。作為具體應 用的實例，本發明提供了一種擬南芥編碼3-磷酸甘油酸激酶基因的克隆方法，具體 操作步驟如下： (1) 提取擬南芥植株的總RNA并反轉錄為cDNA ; (2) 以cDNA為模板，用PCR方法擴增Ji/^似基因的⑶S序列； (3) 回收PCR擴增產物。
[0008] 本發明同時提供了擬南芥3-磷酸甘油酸激酶基因植物耐鹽性脅迫的應 用，即：利用克隆的基因的CDS序列，構建的融合基因，進行植 物轉化，從而獲得在擬南芥中組成型表達目的基因的轉基因植物。其中所述的融合 基因中的目的基因可以是任何針對基礎研究、轉化技術、花卉或者農作物耐鹽性狀改良需 要的目的基因。
[0009] 作為具體應用的實例，本發明提供了一種"dK "融合基因的構建及 其在轉基因擬南芥參與鹽脅迫的應用。具體操作過程如下： (1) 用Afco I/fc仿11雙酶切通過PCR擴增的J ?/^尤?基因的⑶S序列片段； (2) 用Afco I/fc仿II雙酶切pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司）質粒，回收大的載體 片段； (3) 混合上述第一步得到的^#6尤?基因的⑶S序列片段和第二步得到的pCAMBIA 1301載體大片段，在連接酶催化下進行連接反應，完成在pCAMBIA 1301載體上的"dK "融合基因的構建。
[0010] 其中所設計的J 基因的⑶S序列的PCR擴增引物如下，其中上游引物引入了 Afco I酶切位點，下游引物引入了 仿II酶切位點： 上游引物：5 ' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3 ' 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3，。
[0011] 所述應用中的"dK "融合基因的構建在轉基因擬南芥中組成型表達 表達，操作過程如下： 擬南芥轉化的具體方法，采用農桿菌介導的Floral dip的方法（Clough and Bent, 1998)，獲得的種子經過50 mg Γ1潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉土培養，利用50 mg Γ1的潮霉素進行抗性篩選獲得轉化4^6尤?基因的純合轉基因擬南芥株系，然后檢測轉 基因擬南芥株系的耐鹽性。
[0012] 本發明的積極效果： 試驗結果表明，將克隆的編碼3-磷酸甘油酸激酶基因轉化模式植物擬南芥，可 以顯著提高轉基因植株的耐鹽性。本發明的融合基因構建"dK "可作為基因 資源在農業生產上使用或選育轉基因植物以提高耐鹽性，具有廣泛的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1是轉化"dK 融合基因的轉基因擬南芥株系中目的基因 的表達分析，#P < 0. 01。
[0014] 圖2是轉化"dK "融合基因的轉基因擬南芥株系幼苗期的耐鹽性 分析。
[0015] 圖3是轉化"dK J"融合基因的轉基因擬南芥株系成苗期的耐鹽性 分析。*Ρ < 0.05。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1 :擬南芥編碼3-磷酸甘油酸激酶基因的克隆 (1)利用異硫酸腈胍-酚法提取擬南芥植株的總RNA，藥品的使用、配制以及具體操作 步驟參考黃培堂等（2002)的方法。
[0017] (2 )根據已知的擬南芥J 基因的⑶S序列設計特異引物，在上游引物中引入 Afco I酶切位點，在下游引物中引入仿11酶切位點。
[0018] h游引物：5' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3' (引入 Afco I 酶切位點） 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3' (引入仿 II 酶切位點） (3)取1 mg RNA作反轉錄的模板，以P2853為引物利用Promega的反轉錄酶ImProm-II ?進行反轉錄，P2853引物序列、反轉錄程序和反轉錄體系如下。
[0019] P2853 引物序列：5' -GCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' 反轉錄程序： 72°C 5分鐘；25°C 5分鐘；42°C 60分鐘；80°C 20分鐘；4°C保溫。
[0020] 反轉錄體系：
【權利要求】
1. 一種增強植物耐鹽性的擬南芥基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一： (a) 如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； (b) 在（a)限定的核酸序列中具有90?100%之間的同源性核苷酸序列。
2. 如權利要求1所述增強植物耐鹽性的擬南芥基因的克隆方法，具體操作步驟 如下： (1) 提取擬南芥植株的總RNA并反轉錄為cDNA ; (2) 以cDNA為模板，用PCR方法擴增Ji/^似基因的⑶S序列； (3) 回收PCR擴增產物。
3. 如權利要求1所述的增強植物耐鹽性的擬南芥基因的應用，它是利用克隆 的基因的CDS序列，構建" dK "的融合基因，進行植物轉化，從而獲 得在擬南芥中組成型表達目的基因的轉基因植物，其中所述的融合基因中的目的 基因可以是任何針對基礎研究、轉化技術、花卉或者農作物耐鹽性狀改良需要的目的基因； "dK 融合基因的構建及其在轉基因擬南芥參與鹽脅迫的應用，具體操作過 程如下： (1) 用Afco I/fc仿11雙酶切通過PCR擴增的J ?/^尤?基因的⑶S序列片段； (2) 用Afco I/fc仿II雙酶切pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司）質粒，回收大的載體 片段； (3) 混合上述第一步得到的^#6尤?基因的⑶S序列片段和第二步得到的pCAMBIA 1301載體大片段，在連接酶催化下進行連接反應，完成在pCAMBIA 1301載體上的"dK "融合基因的構建； 其中所設計的基因的CDS序列的PCR擴增引物如下，其中上游引物引入了 Afco I酶切位點，下游引物引入了辦仿Π 酶切位點： 上游引物：5 ' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3 ' 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3' ； 所述應用中的" dK "融合基因的構建在轉基因擬南芥中組成型表達，操 作過程如下：擬南芥轉化的具體方法，采用農桿菌介導的Floral dip的方法，獲得的種子 經過50 mg Γ1潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉土培養，利用50 mg Γ1的潮霉素 進行抗性篩選獲得轉化基因的純合轉基因擬南芥株系，然后檢測轉基因擬南芥株 系的耐鹽性； 所述植物為小麥、大麥、水稻、玉米、大豆、花生、棉花、馬鈴薯、油菜、番茄、黃瓜、苜蓿或 擬南芥。
【文檔編號】C12N15/54GK104120138SQ201410358406
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月26日 優先權日:2014年7月26日
【發明者】劉棟, 李衛春, 馬利霞, 程建峰 申請人:江西農業大學