一種鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子及其應用。它從模式植物擬南芥中克隆了AtPGK2基因的啟動子序列，隨后在轉基因擬南芥中證實，該啟動子能夠驅動GUS報告基因以鹽脅迫誘導的形式在植物葉片中特異性表達。應用本發明的啟動子，構建獲得“啟動子-目的基因”融合基因，將其轉化植物可獲得鹽脅迫誘導的植物葉片特異性表達目的基因的轉基因植物。這不僅有助于研究植物響應鹽脅迫的分子機制，并應用于植物基因工程中使外源基因以鹽脅迫誘導的形式調控目的基因在植物葉片中特異性表達，同時有針對性地提高植物的耐鹽性，具有廣泛的應用價值。
【專利說明】一種鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物基因工程領域，具體說涉及一種鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟 動子及其應用。
【背景技術】
[0002] 鹽脅迫是植物遭受的非生物脅迫之一，嚴重影響了植物的生長發育和農作物的產 量及品質（Parvaiz and Satyawati, 2008)。我國鹽漬土分布廣、面積大、類型多，約占國土 面積的10%，而且每年鹽漬土壤的面積不斷擴展，使農業生產的可持續發展受到威脅(孫建 昌等，2008)。因此，培育耐鹽性強的農作物新品種具有重要的實際意義。
[0003] 啟動子是位于結構基因上游的調控序列，它像"開關"一樣，能夠調控其下游基因 表達的時空特異性。高等植物的啟動子分為三類：組成型啟動子、組織器官特異性啟動子和 誘導型啟動子(王穎等，2003)。組成型啟動子調控的目的基因可以在所有組織中表達，不表 現時空特異性；組織器官特異性啟動子所調控結構基因的表達僅局限在某些特定的器官或 組織中；誘導型啟動子是在某些外源或內源特定的物理和化學等信號的誘導下，啟動目的 基因的表達(王穎等，2003 ;路靜等，2004)。
[0004] 在組成型啟動子中，目前使用最廣泛的是花椰菜花葉病毒的ηκ 啟動子(王 穎等，2003 ;李杰等，2006)。如Tsuchiya等（1996)發現dK J仍啟動子和水稻JcW啟動子 在百合的基因轉化中具備高效的轉錄調控活性；Sunilkumar等（2002)以dK 啟動子 驅動綠色熒光蛋白（GFP)基因在轉基因棉花中表達。雖然利用組成型啟動子驅動目的基因 在轉基因植物中表達對于研究基因的功能和改變農作物的農藝性狀取得了一定的進展，但 是由于在植物基因工程中利用組成型啟動子會導致外源基因在所有組織中過度的表達，大 量消耗細胞內的物質和能量，在改變植物目的農藝性狀的同時也影響了植物正常生長發育 的進程，因此在應用中存在很多弊端（Gittins et al.，2000)。如在轉基因植物中組成型 表達外源目的基因，產生大量的代謝產物，阻礙了植物的正常生長發育，不利于產量和品質 的提高；有些外源基因的表達產物甚至有毒，導致植株的死亡（Robinson, 1996; Gilmour et al·，2004; Qin et al·，2004; Savitch et al·，2005; Thomashow, 2010)。因此， 在植物的基因工程領域中，亟待獲得有效的組織器官特異性或誘導型啟動子代替組成型啟 動子，以更好地調控外源基因的表達，從而為農業生產服務。如Gan等（1995)將衰老相關基 因的啟動子與目的基因構成的融合基因，使基因在轉基因煙草的衰老葉片 中特異表達，合成較多的細胞分裂素以延緩轉基因煙草的延緩；Mariani等（1990; 1992) 將煙草花藥絨氈層特異表達基因的啟動子以激與基因融合后轉化植物核酸酶基 因在花藥中特異表達，獲得了煙草和油菜的雄性不育材料，并進行了商業化應用。
[0005] 擬南芥屬于十字花科，由于其基因組小、生長周期短、生物信息資源豐富和繁殖能 力強等特點，已成為分子生物學研究的模式植物(張振楨等，2006)。葉片是植物重要的器 官之一，在植物的生長和發育的整個生命周期中特別是對于光合作用具有重要的作用。在 農業生產中，葉片的光合作用是作物產量形成的基礎。許多研究表明，葉片的葉綠體對環 境變化尤為敏感，當植物受到鹽脅迫后，葉綠體的類囊體膜解體、葉綠體的功能紊亂和光合 能力急劇下降，嚴重影響作物的產量和品質（Qiu et al·，2003; Chavels et al·，2009; Ashraf and Harris 2013)。因此，如果在葉片中特異性表達植物的耐鹽基因，一方面可避 免耐鹽基因表達的產物在植物組織和細胞中過度的積累引起毒害，另一方面使轉基因植物 在鹽脅迫下如鹽漬土中生長少受或不受鹽害的影響，將會顯著增加作物的產量和提高其品 質。
[0006] 目前還沒有一種兼具鹽脅迫誘導和鹽脅迫誘導后在植物葉片中特異性表達的啟 動子，因此本領域迫切需要篩選和開發在鹽脅迫誘導下植物葉片特異性的啟動子。獲得并 有效利用兼具鹽脅迫誘導和葉片特異性的啟動子不僅有助于研究植物響應鹽脅迫的分子 機制，并應用于植物基因工程中使外源基因以鹽脅迫誘導的形式調控目的基因在植物葉片 中特異性表達，同時有針對性地提高植物的耐鹽性，具有廣泛的應用價值。
【發明內容】
[0007] 本發明目的是解決現有植物基因工程技術中，因使用組成型啟動子使外源基因在 轉基因植物中過量表達異源蛋白或代謝產物，使植物原有的代謝失衡，阻礙了植物的正常 生長發育，甚至導致死亡。同時為深入研究植物響應鹽脅迫的分子機制，并應用于植物基因 工程中使外源基因以鹽脅迫誘導的形式調控目的基因在植物葉片中特異性表達，同時有針 對性地提高各種植物的耐鹽性，提供一種鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子及其在轉基 因植物中的應用。
[0008] 本發明提供了一種新的、1444 bp的鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子，該啟動 子核酸序列選自： (a) 如序列表1所示的核酸序列； (b) 在（a)限定的核酸序列中至少具有80%以上的同源性的核酸序列。
[0009] 作為具體應用的實例，本發明提供了一種鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子的 克隆方法，具體操作步驟如下： 第一、以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴增鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動 子； 第二、回收PCR擴增產物； 第三、將上述第二步回收的擴增產物，與pMD-18載體(購自TaKaRa公司)在連接酶催化 下進行連接反應； 第四、將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞； 第五、通過氨芐霉素抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。
[0010] 本發明同時提供了鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子的應用，即：利用獲得的 鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子，構建"啟動子-目的基因"的融合基因，進行植物轉 化，從而獲得基因組中含有以上所述啟動子核酸序列的、以鹽脅迫誘導的形式在植物葉片 特異表達目的基因的轉基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何針對基礎 研究、轉化技術、提高各種植物耐鹽性所需的目的基因。
[0011] 作為具體應用的實例，本發明提供了一種"啟動子-GUS報告基因"融合基因的構 建及其在轉基因擬南芥中以鹽脅迫誘導的形式在植物葉片特異性表達。具體操作過程如 下： 第一、用I /Afco I雙酶切含有鹽脅迫誘導的擬南芥葉片特異性啟動子的ΤΑ克隆 質粒，回收該特異性啟動子片段； 第二、用I /Afco I雙酶切pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司）質粒，回收大的載 體片段(其中含有報告基因的編碼序列）； 第三、混合上述第一步獲得的鹽脅迫誘導的擬南芥葉片特異性啟動子片段和第二步獲 得的pCAMBIA 1301載體大片段，在連接酶催化下進行連接反應，完成在pCAMBIA 1301載體 上的"鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子-GUS"融合基因的構建。
[0012] 其中所設計的鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子的PCR擴增引物如下，其中上 游引物引入了 I酶切位點，下游引物引入了 Afco I酶切位點： 上游引物：5 ' -CGCGGATCCAATATCACACCACGGATTGGG-3 ' 下游引物：5' -CATGCCATGGGTGAAGTCAACAGATAGTGA-3' 所述應用中的"啟動子-GUS報告基因"在轉基因擬南芥中以鹽脅迫誘導的形式在植物 葉片特異表達，操作過程如下： 擬南芥轉化的具體方法，采用農桿菌介導的Floral dip的方法（Clough and Bent, 1998)，獲得的種子經過50 mg Γ1潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉土培養，利用組 織化學染色的方法（Blume and Grierson, 1997)，檢測轉基因擬南芥鹽脅迫條件下⑶S報 告基因表達的特異性。
[0013] 本發明利用有效的鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子代替組成型啟動子，可以 用于構建在植物葉片中以鹽脅迫誘導的形式特異性表達目的基因的融合基因。利用遺傳轉 化技術將其轉入植物的基因組中，可以實現對目的基因的定向操作，獲得兼具鹽脅迫誘導 和植物葉片特異性表達目的基因的轉基因植物。不僅有助于研究植物響應鹽脅迫的分子機 制，并應用于植物基因工程中使外源基因以鹽脅迫誘導的形式調控目的基因在植物葉片中 特異性表達，同時有針對性地提高各種植物的耐鹽性，具有廣泛的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1是鹽脅迫誘導的擬南芥葉片特異性啟動子克隆的電泳檢測圖。泳道1 : DL2000 DNA Marker ;泳道2 :鹽脅迫誘導的擬南芥葉片特異性啟動子克隆的PCR產物；泳道 3 :以水為模板的PCR負對照。
[0015] 圖2是擬南芥"鹽脅迫誘導的擬南芥葉片特異性啟動子-GUS"轉基因擬南芥植株 的PCR鑒定圖。泳道1:DL2000 DNA Marker;泳道2-4:以轉化"鹽脅迫誘導的擬南芥葉片 特異性啟動子-GUS報告基因"融合基因的轉基因擬南芥植株DNA為模板的PCR產物；泳道 5 :以"鹽脅迫誘導的擬南芥葉片特異性啟動子-GUS報告基因"融合基因的質粒為模板的 PCR正對照；泳道6 :以水為模板的PCR負對照。
[0016] 圖3是因在正常生長(對照）和鹽脅迫處理后擬南芥幼苗的表達水平， 林P < 0· 01。
[0017] 圖4是轉化"鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子-GUS報告基因"融合基因的轉 基因擬南芥植株在正常和鹽脅迫生長條件下的GUS染色結果。a :在1/2 MS培養基正常條 件下生長3天的擬南芥；b :在含有125 mM NaCl的1/2 MS培養基生長3天的擬南芥；a :在 1/2 MS培養基正常條件下生長5天的擬南芥；b :在含有125 mM NaCl的1/2 MS培養基生 長5天的擬南芥。標尺=1 mm。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1 :鹽脅迫誘導的擬南芥葉片特異性啟動子的克隆 第一、以擬南芥基因組DNA為模板，利用PCR方法擴增1444 bp的鹽脅迫誘導的擬南芥 葉片特異性啟動子，回收擴增產物并進行TA克隆。
[0019] (l)PCR擴增目的片段： ① 根據已知的擬南芥基因啟動子區的序列設計特異引物，在上游引物中引入 I酶切位點，下游引物中引入了 Afco I酶切位點： 上游引物：5 ' -CGCGGATCCAATATCACACCACGGATTGGG-3 ' 下游引物：5' -CATGCCATGGGTGAAGTCAACAGATAGTGA-3' ② 按常規方法提取擬南芥基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴 增，制備鹽脅迫誘導的擬南芥葉片特異性啟動子片段。
[0020] PCR反應程序： 94 °C 3分鐘； 94°C 30 秒，56°C 30 秒，72°C 2 分，32 個循環； 72 °C 10 分鐘； 4 C保溫。
[0021] PCR反應體系：
【權利要求】
1. 一種鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子，其核酸序列選自： (a) 如序列表1所示的核酸序列； (b) 在（a)限定的核酸序列中至少具有80%以上的同源性的核酸序列。
2. -種權利要求1所述鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子的克隆方法，具體操作步 驟如下： 第一、以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴增鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動 子； 第二、回收PCR擴增產物； 第三、將上述第二步回收的擴增產物，與pMD-18載體(購自TaKaRa公司)在連接酶催化 下進行連接反應； 第四、將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞； 第五、通過氨芐霉素抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。
3. 根據權利要求1所述的鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子，其特征在于，所設計 的鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子的PCR擴增引物如下，其中上游引物中引入了 I酶切位點，下游引物中引入了 Afco I酶切位點： 上游引物：5 ' -CGCGGATCCAATATCACACCACGGATTGGG-3 ' 下游引物：5' -CATGCCATGGGTGAAGTCAACAGATAGTGA-3'。
4. 根據權利要求1所述的鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子的克隆方法，其特征在 于，從擬南芥基因組DNA中克隆獲得鹽脅迫誘導的葉片特異性啟動子，具體操作步驟如下： (1) 以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴增鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動 子； (2) 回收PCR擴增產物； (3) 將上述（2)步回收的擴增產物，與pMD-18T在連接酶催化下進行連接反應； (4) 將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞； (5) 通過抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。
5. -種權利要求1所述的鹽脅迫誘導的植物葉片特異性啟動子的應用，其特征在于， 利用該啟動子構建獲得"啟動子-目的基因"的融合基因，將其轉化擬南芥或其他植物，從 而獲得基因組中含有權利要求1所述啟動子核酸序列的、可在植物的葉片組織中以鹽脅迫 誘導的形式特異性表達相應目的基因的轉基因植物。
【文檔編號】C12N15/10GK104120130SQ201410358405
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月26日 優先權日:2014年7月26日
【發明者】劉棟, 李衛春, 馬利霞, 程建峰 申請人:江西農業大學