一種特異識別t-2毒素的寡核苷酸適配體的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種特異結合T-2毒素的小分子寡核苷酸適配體，該單鏈DNA適配體的序列為SEQ ID NO:1。通過基于氧化石墨烯分離的指數富集配體系統進化技術，體外篩選獲得了高親和力且特異識別T-2毒素的單鏈寡核苷酸適配體。該適配體具有廣闊的應用前景，既可以用于分離富集樣品中的痕量T-2毒素，也可以通過標記功能基團手段轉化為報告適配體用于分析檢測食品中的T-2毒素。
【專利說明】-種特異識別T-2毒素的寡核苷酸適配體
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種經SELEX技術（指數富集的配體系統進 化技術）制備而得的高親和力特異性結合Τ-2毒素的寡核苷酸適配體，為快速分離富集及 分析檢測Τ-2毒素奠定了基礎。
【背景技術】
[0002] Τ-2毒素（T-2toxin)是A類單端孢霉烯族真菌毒素中毒性最強的一種，是一種倍 半萜烯化合物。T-2毒素可由多種真菌產生，主要產自如三線鐮刀菌、枝孢鐮刀菌和梨孢鐮 刀菌等鐮刀菌屬，分布極廣，嚴重危害人畜健康。T-2毒素毒性作用包括急性毒性作用、亞急 性毒性、慢性毒性、三致作用、免疫毒性以及對血液系統和軟組織的損害作用。T-2毒素的 毒性較為穩定，室溫放置6?7年或在100-120°C加熱lh，其毒性依然不減。由于其毒性劇 烈，國際上非常重視T-2毒素對人畜的危害，早在1973年，FA0/WH0就將單端孢霉烯族T-2 毒素列為最危險的天然存在的食品污染源之一；"黃雨中毒"事件發生之后，關于T-2毒素 的研究更為廣泛和深入。
[0003] 目前，T-2毒素的測定方法主要有薄層色譜法（TLC)、氣相色譜法（GC)、液相色譜 法（LC)、液相色譜質譜聯用法（LC-MS)和酶聯免疫法（ELISA)等免疫學檢測法。TLC法雖 然分析成本較低，但操作過程煩瑣，重復性差。GC法和LC法都不能直接測定樣品中的T-2 毒素，通常需要衍生，GC法的衍生主要基于三甲硅烷基化作用和氟酰基化作用，LC法使用 的衍生化試劑為氰酸蒽，在測定過程中使用了有毒化學試劑。LC-MS法靈敏度高，樣品制備 相對簡便，不需要衍生化處理，但成本較高。依賴抗體的免疫學檢測法操作簡單、靈敏度高， 適用于檢測大量樣品，無需大型昂貴儀器設備的優點，但假陽性率比較高，定量不夠準確； 且T-2作為一種分子量466g/mol的小分子半抗原，不具備免疫原性，需將其與大分子載體 蛋白結合制備完全抗原后才能刺激動物分泌抗體，這個過程不僅繁瑣耗時而且成本昂貴， 且制得的抗體批次間穩定性不如寡核苷酸，抗體的儲存條件也較寡核苷酸嚴苛。
[0004] 近些年來，寡核苷酸適配體作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注 目。寡核苷酸適配體是通過 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指數富集的配體系統進化）技術篩選的與祀物質特異性結合的一簇小分子 DNA或RNA片段。SELEX技術是20世紀90年代發展起來的一種新的組合化學技術，具有經 濟、簡便、快速、適用范圍廣等特點。SELEX技術利用分子生物學技術，構建人工合成的隨機 寡核苷酸文庫，其中隨機序列長度一般在20-40nt左右，兩端引物序列一般在20nt左右，文 庫容量大約在IO 13-IO15范圍內。由于單鏈寡核苷酸隨機序列，容易凸環、發卡、假節、G-四 聚體等二級結構，故能與蛋白質、肽段、藥物、氨基酸、有機化合物，甚至是金屬離子相結合， 形成很強結合力的復合體。
[0005] 至今報道的真菌毒素適配體，主要是通過將靶標固定在親和層析柱或磁珠上進行 SELEX篩選制備的,前者有赭曲霉毒素 A,后者有伏馬毒素 BI,也有報道不同實驗室分別用 層析柱及磁珠篩選獲得了玉米赤霉烯酮適配體。但目前尚無有關T-2毒素寡核苷酸適配體 及其制備方法的研究報道。本發明以食品或飼料中常見的T-2毒素為靶標，利用基于氧化 石墨烯（GO)分離的SELEX技術制備獲得了與Τ-2毒素高親和力特異性結合的寡核苷酸適 配體。該寡核苷酸適配體可用于分離富集樣品中的痕量T-2毒素，也可經特殊基團修飾后 用于分析檢測T-2毒素以豐富實驗室檢測手段，并可用于開發試紙條或便攜式小型儀器以 實現家庭、農田、工廠快速檢測，因此該發明可以在真菌毒素檢測領域得到廣泛應用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種能與T-2毒素特異性結合的寡核苷酸適配體，為開發 T-2毒素的新型分離富集或分析檢測工具奠定良好基礎。
[0007] 本發明的另一目的是提供一種制備T-2毒素寡核苷酸適配體的方法，它可以方 便、準確地獲取T-2毒素的高親和力單鏈DNA適配體，效果顯著。
[0008] 本發明方法利用基于氧化石墨烯分離的SELEX技術，以T-2毒素為靶標，無需將小 分子靶標固定在載體上，通過10輪的SELEX反復篩選后，對富集文庫進行克隆測序，并分析 代表序列的親和力和特異性，最終獲得與T-2毒素高親和性特異結合的最佳寡核苷酸適配 體。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009] 圖1是全長序列Seq. 2、Seq. 6、Seq. 16及截短序列Tc. 2、Tc. 6、Tc. 16的模擬二級 結構圖。
[0010] 圖2是Seq. 2、Seq. 6、Seq. 16及Tc. 6寡核苷酸適配體的飽和結合曲線圖。
[0011] 圖3是Seq. 2、Seq. 6及Seq. 16寡核苷酸適配體的特異性試驗結果。
【具體實施方式】：
[0012] 以下結合說明書附圖和實施例對本發明作進一步的說明，但不是限制本發明。
[0013] 實施例I :T-2毒素特異性結合寡核苷酸適配體的GO-SELEX篩選
[0014] 1、體外化學合成初始隨機單鏈DNA (ssDNA)文庫及引物（由美國Integrated DNA Technologies公司完成），序列如下：
[0015] 5' -CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-N40-GACTCGAAGTCGTGCATCTG-3'（40N 代表 40 個隨機 核苷酸）；
[0016] 上游引物：5'-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-3'
[0017] 下游引物：5'-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3'
[0018] 5'磷酸化下游引物：5'-P-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3'
[0019] 將隨機ssDNA文庫和引物均用TE緩沖液配制成100 μ M貯存液存于-20°C備用。
[0020] 2、PCR擴增條件及Lambda核酸外切酶消化制備單鏈次庫的條件
[0021] 將合成的隨機單鏈文庫（ssDNA)稀釋作為PCR模板擴增出磷酸化的雙鏈 DNA(dsDNA)產物，研究Lambda核酸外切酶消化磷酸化反義鏈制備單鏈次庫的影響因素，最 終確定制備單鏈次庫的最佳條件。
[0022] PCR反應體系為：稀釋隨機文庫作為模板DNAl μ L(IOOng)，上游引物及磷酸化下 游引物（20μΜ)各lyL，dNTPmdeact^SmDlyLaOXPCR擴增緩沖液5yL，滅菌超純水 40 μ L，Taq酶1 μ L，總體積為50 μ L。PCR擴增程序：94°C預變性5min ;94°C變性30s ;53°C 退火30s ;72°C延伸30s ;循環20次；最后72°C延伸5min。通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠 電泳驗證擴增效果。
[0023] 將電泳條帶位置正確且單一的PCR擴增產物用PCR產物純化試劑盒（Generay Biotech. Co.，Ltd.)純化，重溶于適當體積的滅菌超純水中，通過Thermo NanoDrop2000超 微量分光光度計測定dsDNA濃度。取確定濃度的純化PCR產物溶液，加入1/10體積的10 X 反應液混合均勻，按說明書加入所需核酸外切酶（5U/μ L)，在37°C下反應30min?60min， 75°C水浴IOmin使酶失活終止反應。通過7M尿素變性的8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，確 定最佳酶切條件后再進行放大酶切。將酶切產物匯集在一個I. 5mL離心管中，加入等體積 的酚：氯仿：異戊醇（V:V:V = 25:24:1)，旋渦混勻管內容物使呈乳狀，12000印111，41：離心 15s，將上層液體小心移入另一離心管，棄去兩相界面和有機相。重復操作一次，直至兩相界 面上見不到蛋白質為止。向含樣品的離心管中加入1/10體積的3M醋酸鈉（pH5. 2)溶液及2 倍體積的無水乙醇，充分混勻后放_20°C冰箱內過夜。取出平衡，12000rpm，4°C離心15min。 吸棄上清，用4°C預冷的70%乙醇0. 5-lmL上下顛倒洗滌白色固體沉淀，12000rpm，4°C離心 15min。棄上清，風干沉淀后，重溶于適當體積的緩沖液中，通過Thermo NanoDrop2000超微 量分光光度計測定ssDNA濃度。
[0024] 3、體外 GO-SELEX 篩選：
[0025] 第一輪篩選時，取溶解在結合緩沖液（BB，IOmM Tris-HCl，150mM NaCl，IOmM KCl, and2. 5mM MgCl2, ρΗ7· 4)中的 Inmol 隨機 ssDNA 文庫（第 2-10 輪 ssDNA 文庫投入量減 少為200, IOOpmol)，經94°C水浴加熱5min，立即冰浴15min后室溫放置lOmin。然后，將此 ssDNA文庫與游離靶標T-2毒素混合均勻，并使其在含1. 0%甲醇的特殊結合緩沖液（總體 積為500 μ L)中孵育2h，期間不停地輕柔晃動。孵育結束后，將混合液轉移到加入事先離心 洗滌好的GO片層中，25°C孵育40min。與T-2靶標結合的ssDNA序列被保留在上清液中， 而不結合的ssDNA序列被GO吸附。通過13000rpm/min離心IOmin,收集上清液，得到了與 T-2毒素結合的ssDNA適配體庫。將此上清液作為擴增模板進行PCR擴增，其純化產物用 λ核酸外切酶消化磷酸化反義鏈制備獲得單鏈次級文庫。經Thermo NanoDrop2000超微量 分光光度計測定純化后的ssDNA濃度，以此計算下一輪文庫投入體積。
[0026] 為了提高適配體的特異性，第6-10輪采用了 Counter G0-SELEX。首先將ssDNA次 庫與FBp ZENaFB1及OTA的混合物孵育60min，然后加入GO片層混合均勻孵育40min。在 這個過程中，不與反篩靶標結合的寡核苷酸通過作用被吸附到GO表面，而與反篩靶 標結合的潛在適配體序列被保留在溶液中。離心分離，棄上清，將得到的G0/ssDNA沉淀物 用BB離心洗滌多次。為了從GO表面解離恢復ssDNA序列，往重懸于特殊結合緩沖液的GO/ ssDNA復合物中加入靶標T-2毒素，室溫孵育2h。孵育結束后，離心收集上清液并PCR擴增。 經純化后的PCR產物，用λ核酸外切酶消化磷酸化反義鏈制備下一輪的單鏈文庫。
[0027] 4、克隆測序及序列分析
[0028] 將第10輪篩選得到的寡核苷酸適配體富集庫用無修飾的引物擴增，PCR產物經純 化后用pMD_19T Cloning Vector(Takara Biotech. Co. ,Ltd)克隆并轉化到氯化|丐感受態 細胞E. Coli DH5a中。在含50 μ g/mL氨芐青霉素的固體培養基上培養18小時后，通過 "藍-白斑篩選"，隨機挑選30個白色陽性克隆于LB液體培養基中培養，并用質粒MiniPrep 試劑盒（Generay Biotech. Co. ,Ltd.)提取質粒，送至上海生工生物技術公司測序。對測序 成功獲得的27條寡核苷酸適配體序列，采用DNAMN軟件對寡核苷酸適配體序列進行一級 結構分析，獲得多條序列的同源性信息；并用RNA Structured 6軟件對寡核苷酸適配體序 列的二級結構進行分析。根據T-2毒素寡核苷酸適配體的一、二級結構特征，將27條序列 分為3個家族。從每個家族中選出1條能級較低、結構穩定的序列為代表，圖1所示為3條 代表序列Seq. 2、Seq. 6、Seq. 16以及截短序列Tc. 2、Tc. 6、Tc. 16的二級結構模擬圖，由上 海生工合成并標記5' FAM基團以作進一步的親和力和特異性分析。
[0029] 5、T-2毒素適配體的親和力和特異性分析
[0030] 5.1親和力分析
[0031] 為了分析三條代表序列及其截短序列的親和力，將固定濃度的T-2毒素（ΙμΜ)與 一系列不同濃度（5,10, 25, 50,100, 200ηΜ)的適配體序列進行孵育，總體積為500 μ L，避光 孵育2h。然后，加入與適配體濃度成比例的G0,繼續避光孵育40min。離心后，用日立F-7000 熒光光譜儀檢測490nm激發下的熒光值。同時，設置不加入T-2毒素的陰性對照以排除非 特異性結合。利用GraphPad Prism5軟件計算各寡核苷酸適配體的解離常數Kd值（見表 D
[0032] 表1.全長序列及截短序列的解離常數Kd值
[0033]
【權利要求】
1. 一種特異識別T-2毒素的寡核苷酸適配體，其特征在于該寡核苷酸適配體的序列如 SEQ ID Ν0:1 所示。
2. 如權利要求1中所述的寡核苷酸適配體，其特征在于其5'端或3'端可以進行 FITC、氨基、生物素或地高辛化學修飾。
3. 如權利要求1中所述的寡核苷酸適配體在分離富集及分析檢測Τ-2毒素中的應用。
【文檔編號】C12N15/115GK104293793SQ201410357649
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】王周平, 陳秀娟, 顧華杰, 夏雨, 吳世嘉, 段諾, 馬小媛 申請人:江南大學