豬胴體和肉質性狀snp遺傳標記及應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于家畜遺傳標記制備【技術領域】，具體涉及一種豬胴體和肉質性狀的SNP遺傳標記的制備與應用，從豬OLR1基因中克隆獲得一種作為遺傳標記應用的豬胴體和肉質性狀的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1和圖4所示，在圖4所示序列的408bp處有一個C/T的堿基替換，該突變導致Pst?Ⅰ-RFLP多態性。本發明還公開了制備豬胴體和肉質性狀遺傳標記的方法以及制備的遺傳標記在豬胴體和肉質性狀多態性檢測中的應用，為豬的標記輔助選擇提供了一個新的標記。
【專利說明】豬胴體和肉質性狀SNP遺傳標記及應用 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明屬于豬的遺傳標記制備【技術領域】，具體涉及一種豬0LR1基因片段作為胴 體和肉質性狀的遺傳標記及應用，所述的遺傳標記克隆自豬0LR1基因。 【背景技術】
[0002] 隨著分子生物學技術的發展，逐步出現了以分子標記為核心的分子標記輔助選擇 和分子標記滲入等分子育種技術，這些技術與常規育種技術相結合大大加速了豬育種的進 程。分子標記輔助選擇可以從分子水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，從而實現對基 因型的直接選擇，進行分子育種，是基因工程在現代家畜育種中的一項重要應用，通過分子 標記的方法，不僅能縮短育種時限，大大減少育種的人力物力消耗；另外，分子標記的多樣 性更使得分子標記在動物育種中的應用潛力大大提高（魯紹熊，吳常信.，2000)。用于 輔助選擇的分子標記包括蛋白質標記，微衛星標記，單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，簡稱 SNP)標記等。
[0003] SNP標記指由基因組單核苷酸變異引起的DNA序列多態性，包括堿基轉換、顛換、 單堿基插入或缺失等，被公認為是最新的第三代DNA分子標記。其數量多，多態性豐富。 其檢測方法包括PCR-SSCP、PCR-RFLP、測序及SNP芯片等。限制性內切酶片段長度多態性 (Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)是根據不同品種（個體）基因組 的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致 酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過瓊脂糖電泳進行檢測，從而可比較不同品種 (個體）的DNA水平的差異（即多態性）（BeuzenN. D.，et al. 2000)。
[0004] 氧化型低密度脂蛋白受體 1 (oxidized low-density lipoprotein receptorl，0LRl)是一類可以結合氧化低密度脂蛋白（oxLDL)的受體。Sawamura等（1997) 首次在牛內皮細胞上發現了 0LR1基因，并成功克隆了人內皮細胞0LR1基因，隨后相繼克 隆了大鼠、小鼠及兔子等0LR1基因的cDNA序列（Miki et al.，1998 ;Kume et al.，1998)。 這幾個物種中0LR1基因的編碼氨基酸序列比較相似。豬0LR1基因有5個內含子和6個外 顯子，編碼274個氨基酸，與人0LR1基因有79%的相似性，與牛的相似性最高，達到84% (Yamanaka et al.，1998 ;Ming et al.，2001)。0LR1基因被廣泛認為與心血管疾病的形成 密切相關，此外在脂肪代謝過程中發揮著重要的作用。Patricia等（2005)首次在脂肪細胞 中研究0LR1的作用，證明0LR1在PPAR γ和其相關抗糖尿病配體的參與下，在調控脂代謝， 從而潛在地調節胰島素抵抗方面發揮著重要作用。Juwon A等（2007)研究證明胞外信號調 節激酶（ERK)和c-Jun氨基末端激酶（JNK)通路是0LR1在脂肪細胞中發揮作用的重要作 用通路。孫超等（2009)研究表明0LR1基因在小鼠前體脂肪細胞分化過程中通過P38MAPK 通路發揮作用，對抑制脂肪細胞增殖有一定的作用。李托（2013)在秦川牛群體中分析0LR1 基因遺傳多態性與肉質性狀的相關性，發現在g. 10497位點存在C>A突變，CC純合基因型 與秦川牛眼肌面積和眼肌深度有顯著相關性。目前，0LR1基因的研究主要集中在人、小鼠、 大鼠和牛等物種，對豬0LR1基因的研究報道較少， 申請人:對該基因在豬中進行了多態性研 究和關聯分析，為豬的遺傳改良提供了重要的理論依據。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于獲得與豬胴體和肉質性狀相關的SNP遺傳標記及應用。從豬 0LR1基因克隆得到一個特異的DNA片段，通過尋找SNP位點，并建立相應的SNP檢測方法， 分析其與豬胴體性狀和肉質性狀的關系，為豬的標記輔助選擇提供一種新的遺傳標記。
[0006] 本發明通過下列技術方案實現：
[0007] 申請人:通過對豬0LR1基因的分離克隆，發現了一種與豬胴體和肉質性狀相關的 SNP分子標記，其核苷酸序列如下所示：
[0008] CGGTGGAAGAGCATTTGTTCGAGATGCAGAGTAGGTACCTGTTTTTTAGTCTGGCCTGGCCACTGATTA CATGCATGTCCTTGGATGGACAGGGTATGGTGGGTCTCTAGGCTCCAGCAGGCATGTCTATAAAACCATCCAGMGA TGGCAAAGATCCCTTTGGTTCTGTGGCTTCATGAATCTAATCTAAGATGTTCACATCAACTCTTTGATCAATTCAGA AATGTTCCTCCCTACAGGAATTCATCCAGCAAACCATCGCCCATTCCAGTTTCCCATTCTGGATGGGGTTATCTCTG AGGAAACCCAACAACTCATGGCTCTGGGAGGACGGTACTCCTTTGATGCCCCACTTGTAAGTTTCCTATTCTTTTCC TAATCTGCTGGTGAAGTTACTGCCGCATTCr(C/T)GCAGAGTGTCCTCTTCCTGCTGGAAAGAACCCTGGGAAATT TCTGAATCTCTCTCCTCAGCCCTCTCATGCAGAGGCTTGCCCCTTGACTCATTCAGACCTTCTCTTGAGTTTTCCTT CTTACATTTATTACTGATTTGAAGCTTTAAGACAAGGCCAAGTGCCTGACCCAAGGT
[0009] 上述序列中的第408bp處的r是C或T，該突變導致Pst I-RFLP多態性。
[〇〇1〇] 申請人:設計了擴增上述豬0LR1基因片段的引物對（該引物對也是檢測本發明的 遺傳標記的引物對），其DNA序列如下所示：
[0011] 正向引物：5 ' CGGTGGAAGAGCATTTGT3 '，
[0012] 反向引物：5 ' ACCTTGGGTCAGGCACTT3 '。
[0013] 本發明建立了一種篩選與豬胴體和肉質性狀相關的分子標記的方法，其步驟包 括：
[0014] 提取豬基因組DNA，根據NCBI中公布的豬0LR1基因序列信息，設計PCR擴增引物 對（其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示），用該引物對進行PCR擴 增，得到長為583bp的擴增片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :1(其第408bp處的r是 C或T，或參見圖4,其中：該序列中的r顯示堿基突變位置，即408bp處的r是C或T)、SEQ ID N0 :2 (梅山豬：其第408bp處突變的堿基是T)和SEQ ID N0 :3 (大白豬：其第408bp處 的突變的堿基是C)所示，該突變導致Pst I-RFLP多態性，進而對所獲得的PCR產物酶切分 型，進行基因型與豬胴體性狀和肉質性狀之間的關聯分析，為豬的標記輔助選擇提供一個 新的遺傳標記。
[0015] 本發明的遺傳標記可以應用于豬胴體和肉質性狀檢測中。本發明設計的引物對也 可應用于豬胴體和肉質性狀檢測中。
[0016] 更詳細的技術方案如《【具體實施方式】》所述。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 序列表SEQ ID N0 :1是本發明制備的遺傳標記的核苷酸序列，序列長度為583bp， 其中在該序列的第408bp處（即顯示r處）存在一個等位基因突變（T/C替換）。
[0018] 序列表SEQ ID NO :2是克隆的中國地方豬品種"梅山豬"的核苷酸序列。序列長 度為583bp，其中在該序列的第408bp處存在一個T/C替換（已經顯示的突變的堿基是T)。
[0019] 序列表SEQ ID N0 :3是克隆的國外豬種"大白豬"的核苷酸序列。序列長度為 583bp，其中在該序列的第408bp處存在一個C/T替換（已經顯示的突變的堿基是C)。
[0020] 序列表SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5是本發明設計的引物對的核苷酸序列。
[0021] 圖1 :分別是大白豬、長白豬、梅山豬和清平豬0LR1序列比對結果，圖中加粗的英 文字母代表SNP位點。
[0022] 圖2 :是豬0LR1基因第5內含子的擴增結果。
[0023] 瓊脂糖濃度為1. 5%;圖中標記說明：泳道M :DL2000Marker ;泳道1 - 4分別為大 白豬、長白豬、梅山豬和清平豬中的擴增片段，片段大小為583bp。
[0024] 圖3 :豬0LR1基因 Pst I-RFLP檢測結果。
[0025] 瓊脂糖濃度為1. 5% ;圖中標記說明：泳道Μ為DL2000Marker ;CC基因型，583bp ; CT 基因型，583bp，172bp，411bp ;TT 基因型，172bp，411bp。
[0026] 圖4 :是本發明克隆的豬0LR1基因第5內含子的核苷酸序列，其中第408bp處的r 是C或T突變，該突變導致Pst I-RFLP多態性。 【具體實施方式】
[0027] 實施例1豬0LR1基因片段的獲得及多態性檢測方法的建立
[0028] 本發明的試驗豬品種為國外血緣豬品種大白豬和長白豬；中國地方豬品種梅山豬 和清平豬，樣品均由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所動物胚胎與分子育種湖北省重點實 驗室提供，為常用品種。
[0029] 豬基因組DNA的提取：
[0030] 采用北京百泰克生物技術有限公司生產的基因組DNA試劑盒（按該試劑盒說明書 進行操作）提取，具體步驟如下所述：
[0031] (1)采取20-50mg豬的耳組織，用眼科手術剪剪成糊狀后放入2ml的離心管中，力口 入200 μ 1裂解液TL，用槍頭吹打均勻。
[0032] (2)加入20 μ 1蛋白酶K(20mg/ml)，劇烈顛倒充分混勻，55°C水浴鍋中消化過夜。
[0033] (3)加入200μ 1結合液CB(該試劑盒自帶），充分顛倒混勻，70°C放置10min。
[0034] (4)冷卻后加入100 μ 1異丙醇，劇烈顛倒充分混勻。
[0035] (5)用lmL的槍頭吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，lOOOOrpm離心30s，倒掉收 集管中的廢液。
[0036] (6)加入500uL抑制物去除液IR(該試劑盒自帶），12000rpm離心30s，棄廢液。
[0037] (7)加入700 μ 1漂洗液WB(該試劑盒自帶），12000rpm離心30s，倒掉廢液。
[0038] (8)重復操作步驟7。
[0039] (9)將吸附柱AC放回收集管中，12000rpm離心2min，盡量去除漂洗液，以免殘留的 乙醇抑制下游反應。
[0040] (10)取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位加 50-100 μ 1洗脫緩沖液EB，室溫放置3-5min，12000rpm離心lmin，將溶液收集到離心管中。
[0041] (11)對提取出的DNA的濃度及質量進行檢測后置于-20°c下保存備用。
[0042] 根據 0LR1 基因的基因組序列（GenBank 登陸號：NC_010447. 4, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NC_010447. 4)設計以下引物對，其DNA序列如下所不：
[0043] 正向引物：5' CGGTGGAAGAGCATTTGT3'，對應序列是SEQ ID N0 :4所示的序列。
[0044] 反向引物：5' ACCTTGGGTCAGGCACTT3'，對應序列是SEQ ID N0 :5所示的序列。
[0045] 利用上述引物對在大白豬、長白豬、梅山豬和清平豬基因組DNA中進行PCR擴增， PCR反應體系25μ L，體系中各組分的濃度為100ng模板DNA、lXTaq buffer2. 5mmol/L、 MgCl2l. 5mmol/L、dNTPs2. 5mmol/L、上述正反向引物各 0· 5mmol/L、lU TaqDNA聚合酶，PCR 的 運行程序如下：預變性94°C 4min ;然后94°C 30s，53°C 40s，72°C 50s，35個循環；最后72°C 繼續延伸l〇min。
[0046] 對上述四個豬品種的PCR產物經Gel Extraction Kit試劑盒（購自上海生工生 物工程技術有限公司，按照試劑盒說明書操作）純化、克隆測序（測序委托上海生工生物工 程技術有限公司進行），得到片段的大小為583bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2(梅 山豬）和SEQ ID NO :3(大白豬）所示。經ClusterW軟件進行序列比對，發現其中位于該 片段408bp處（第5內含子52bp處）C/T變異引起了 Pst I酶切位點（CTGCA丨G)多態性 改變。
[0047] 取5. 5 μ L PCR產物加入限制性內切酶0. 5 μ L(10U/ μ L)，lOXbufferl μ L，(ΜΗ203 μ L，置37°C恒溫反應過夜，后經1. 5%的瓊脂糖凝膠凝膠電 泳分析，在凝膠成像系統觀察并記錄酶切分型結果。當408bp處的堿基都為C時Pst I不 識別該位點，記為CC型（583bp)，當突變位點堿基都為T時Pst I酶識別該位點，記為TT 型（172bp+411bp)，當C和T都存在時記為CT型（583bp+172bp+411bp)。豬0LR1基因的 PCR-Pst I-RFLP的酶切分型結果如圖3。
[0048] 實施例2本發明的分子標記在不同豬群中的多態性分布檢測驗證
[0049] 在兩個中國地方豬品種（梅山豬、清平豬）和兩個國外豬種（大白豬、長白豬）檢 測豬0LR1基因第5內含子區PCR-Pst I -RFLP多態性分布頻率，檢測結果如表1所示。在 大白豬、長白豬中C等位基因頻率較高，在梅山豬、清平豬中，TT基因頻率占優勢，T等位基 因的頻率較高，國外血緣的豬和中國地方豬品種中存在顯著的差異。
[0050] 表1 0LR1基因第5內含子區Pst I酶切多態在不同品種中的分布結果
[0051]
【權利要求】
1. 一種豬胴體和肉質性狀SNP遺傳標記，其核苷酸序列如下所示： CGGTGGAAGAGCATTTGTTCGAGATGCAGAGTAGGTACCTGTTTTTTAGTCTGGCCTGGCCACTGATTACAT GCATGTCCTTGGATGGACAGGGTATGGTGGGTCTCTAGGCTCCAGCAGGCATGTCTATAAAACCATCCAGAAGATGG CAAAGATCCCTTTGGTTCTGTGGCTTCATGAATCTAATCTAAGATGTTCACATCAACTCTTTGATCAATTCAGAAAT GTTCCTCCCTACAGGAATTCATCCAGCAAACCATCGCCCATTCCAGTTTCCCATTCTGGATGGGGTTATCTCTGAGG AAACCCAACAACTCATGGCTCTGGGAGGACGGTACTCCTTTGATGCCCCACTTGTAAGTTTCCTATTCTTTTCCTAA TCTGCTGGTGAAGTTACTGCCGCATTCr(C/T)GCAGAGTGTCCTCTTCCTGCTGGAAAGAACCCTGGGAAATTTCT GAATCTCTCTCCTCAGCCCTCTCATGCAGAGGCTTGCCCCTTGACTCATTCAGACCTTCTCTTGAGTTTTCCTTCTT ACATTTATTACTGATTTGAAGCTTTAAGACAAGGCCAAGTGCCTGACCCAAGGT 上述序列中的第408bp處的R是C或T，導致Pst I-RFLP多態性。
2. 擴增如權利要求1所述遺傳標記的引物對，其DNA序列如下所示： 正向引物：CGGTGGAAGAGCAITTGT， 反向引物：ACCTTGGGTCAGGCACTT。
3. -種制備豬胴體和肉質性狀遺傳標記的方法，其特征在于，包括以下步驟： 從豬耳組織中提取基因組DNA，根據豬0LR1基因序列設計引物，其DNA序列如序列表 SEQ ID N0:4和5所示，用SEQ ID N0:4和5所示引物在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR 產物純化、克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO :41所示的核苷酸序列。
4. 權利要求1所述的遺傳標記在豬胴體和肉質性狀檢測中的應用。
5. 權利要求2所述的引物對在豬胴體和肉質性狀檢測中的應用。
【文檔編號】C12N15/12GK104087595SQ201410344261
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】彭先文, 喬木, 武華玉, 吳俊靜, 梅書棋, 郭咪咪, 宋忠旭, 劉貴生, 孫華, 李良華, 張華蓋 申請人:湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所