牛重大病原菌―多殺性巴氏桿菌基因診斷試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種牛重大病原菌－多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida）的基因診斷試劑盒及檢測方法，屬于生物科學【技術領域】。該試劑盒及檢測方法是以多殺性巴氏桿菌基因保守區序列設計的一對引物為主體而設計的。本發明采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術，對牛的病原菌－多殺性巴氏桿菌的特異性DNA片斷進行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用于牛巴氏桿菌病的臨床檢測，也用于牛各時期養殖過程中的細菌跟蹤檢測，還可以用于牛養殖環境監測，避免病菌傳播流行，具有很高的實用價值。
【專利說明】牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌基因診斷試劑盒及檢測方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于生物科學【技術領域】，具體涉及牛重大病原菌的診斷試劑盒及檢測方法，主要是針對多殺性巴氏桿菌基因診斷的試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0003]牛巴氏桿菌病又稱為牛出血性敗血癥，是牛的一種急性、熱性傳染病，以發生高熱、肺炎和內臟器官廣泛出血為特征。病原為多殺性巴氏桿菌，菌體為細小、兩端鈍圓的球桿狀或短桿狀菌，大小為1_1.5μπιΧ0.3-0.6 μ m，多散在、無運動性、不形成芽胞，革蘭氏染色陰性。多殺性巴氏桿菌對各種畜禽和野生動物都有致病性，不分年齡均可發生。牛群以黃牛、奶牛易感，其中青、壯年奶牛最易感，牦牛發病較少見。根據臨床癥狀可分為敗血型、浮腫型和肺炎型。但敗血型以猝死為特征，而水腫型和肺炎型是在敗血型的基礎上發展而來的，因此在臨床上以肺炎型為主的混合型最為常見。
[0004]敗血型病牛常突然發病而死亡。表現體溫升高，達41°C~42°C，心跳加快，精神沉郁，食欲減退或廢絕，隨后開始腹瀉，呈粥樣或水樣，糞中混有粘液或血液，并有腹痛，不久體溫下降而迅速死亡。病程很短，為12~24 h。常來不及查清病因和治療，牛就死亡。
[0005]水腫型常發熱，精神沉郁，反芻停止，流涎，流淚，流粘液樣鼻汁，下頜和頸部發生炎性水腫，水腫還可蔓延到前胸、舌及周圍組織。常伴有咳嗽，呼吸困難。后期倒地，體溫下降，最后窒息死亡。病程為數小時至2d。
[0006]肺炎型主要是纖維素性胸膜肺炎癥狀。表現體溫升高，呼吸促迫，繼而呼吸困難，嚴重的頭頸前伸，張口呼吸，黏膜發紺；流泡沫樣鼻汁，有時帶血，后變粘液膿性；咳嗽，胸部聽診有啰音，有時聽到摩擦音，叩診有濁音區，觸診有痛感。病初便秘，后期腹瀉，糞中有血，有惡臭味。病程為3~7d左右。病死率高達80%以上。
[0007]可以說多殺性巴氏桿菌是細菌中對牛健康安全危害最大的種類之一，給牛養殖業帶來較大的危害。多殺性巴氏桿菌引起的牛出血性敗血癥具有暴發快、流行廣、死亡率高等特點，由于細菌極易對抗生素產生抗藥性，因此對多殺性巴氏桿菌病應以預防為主，而這主要依賴于早期的快速檢測。目前對多殺性巴氏桿菌的檢測技術主要包括傳統的TCBS培養及進一步的形態及生理生化鑒定法、免疫學方法(主要有單克隆抗體技術、酶聯免疫檢測法(ELISA)),免疫電鏡技術、分子生物學方法(主要有分子雜交技術、限制性內切酶長度多態(RELP))等。但是這些檢測方法有些對技術條件要求高，檢測時間長。有些所需的材料制備麻煩，費用高，有些方法靈敏度不高，特異性不強，因此廣大獸醫和牛養殖業主掌握的技術難度很大，很難推廣，限制了這些技術的應用和發展。
[0008]早期快速診斷牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌是目前預防牛出血性敗血癥暴發流行的主要措施和牛養殖業減少損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好又靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法是廣大獸醫工作者和牛養殖者急切盼望的。
[0009]多聚酶鏈式反應(polymerase chain react1n,簡稱PCR技術),是上世紀80年代發展起來的一種體外擴增特異DNA片斷的技術，由于具有快速、敏感、特異性強等特點，所以這種方法建立后，很快就被應用于實踐中。
【發明內容】
[0010]本發明的目的是利用多殺性巴氏桿菌毒素基因(toxA)保守序列設計的一對引物，建立多殺性巴氏桿菌PCR反應體系，在此基礎上優化和設計，提供牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒可批量生產，操作簡單，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用于牛出血性敗血癥的臨床檢測，也可用牛養殖過程中的細菌跟蹤檢測，也還可以用于養殖環境監測，避免病菌傳播流行，具有很高的實用價值。
[0011]本發明采用的技術方案如下:.牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的基因診斷試劑盒，該試劑盒包括A液、B液、C液、盒子和泡沫板；
所述的A液為樣品稀釋液，內裝無菌生理鹽水，5管，每管5mL ;
所述的B液為PCR反應液，I管，內裝192μ1 PCR擴增反應液，包括168μ1 ddH20、14.4μ1含Mg2+ 的 1XBuffer [Tris-HCl 10mmoI/L、pH為 9.0，KCl 500mmol/L, MgCl2 15mmol/L,
Triton-XlOO 1%]、3.2μ1 濃度為 250 μ mol/L 的 dNTP、2.4μ1 濃度為 0.5 μ mol/L 引物PmF,2.4μ1濃度為0.5 μ mol/L引物PmR和1.6μ1酶活單位為8U的TaqE ；PmF為:5’-ACGCTTTGCCTT GCAAGATAC-3’，PmR 為:5’-GATTCACGTAACAAACCAGGC-3’ ；所述的 C 液為陽性對照液，I管，內裝50μ1多殺性巴氏桿菌陽性模板；
所述泡沫板裝于盒子中，其大小與盒子的底面相同；泡沫板上有不少于上述小管數量的小孔，上述各小管分別對應放置于這些小孔中。
本發明還提供一種牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，使用上述試劑盒，按下列步驟進行:
步驟(I )，取被檢標本的新鮮含DNA樣品，加入樣品稀釋液，稀釋10~20倍，冰浴勻漿； 步驟(2)，將勻漿后的樣品下離心，得到離心后樣品的上層清液；
步驟(3)，將200μ1離心后樣品的上層清液煮沸lOmin，然后立刻放于冰上5~1min冷卻；
步驟(4)，將冷卻后的樣品離心，取上層清液作為PCR模板；
步驟(5)，分別取體積比為1:1的PCR模板和C液，各加入到PCR反應液中，PCR模板與PCR反應液的體積比為1:24，C液與PCR反應液的體積比為1:24，混勻后2000r/min離心5秒，置于PCR儀上；
步驟(6)，按下列條件擴增:95°C預變性3min，94°C變性lmin，55°C退火45sec，72°C延伸lmin，34個循環，72°C延伸lOmin，保存于4°C，得到擴增產物；
步驟(7)，反應結束后取5~10μ1擴增產物，加2μ1溴酚藍混勻，經I %瓊脂糖凝膠電泳20~30分鐘后于紫外儀上觀察，若在300bp處出現明亮的反應條帶，則為多殺性巴氏桿菌陽性；若無反應條帶顯示則為陰性。
[0012]本發明技術方案中所述的新鮮含DNA樣品為新鮮鼻腔拭子液。
[0013]本發明技術方案中所述的冰浴勻漿是在無菌勻漿器中。
[0014]本發明技術方案中所述的步驟(2)勻漿后的樣品離心的速度為3000~4000r/min,時間為5~lOmin。
[0015]本發明技術方案中所述的步驟(4)冷卻后的樣品離心的速度為3000~4000r/min,時間為5~lOmin。
[0016]本發明與現有技術相比，其有益效果為:
本發明的牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的基因診斷試劑盒及檢測方法，是以根據多殺性巴氏桿菌毒素基因(ToxA)保守區序列設計的一對引物為主體而設計的。利用該對引物，可以特異性地擴增攜帶多殺性巴氏桿菌的待測樣品的有關基因片斷，所建立的優化的PCR體系保證檢測結果的快速性、準確性和穩定性。因此，使用本發明的試劑盒及檢測方法，可以簡便、快速、靈敏而特異的地檢測感染多殺性巴氏桿菌的患牛鼻腔拭子液，大大高于傳統和常規的生物學方法，可運用于牛烈性傳染病一出血性敗血癥的臨床檢測，也可用于肉牛或奶牛各時期養殖過程中的細菌跟蹤檢測，還可以用于牛養殖環境監測，避免病菌傳播流行，具有很高的實用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是感染多殺性巴氏桿菌的病牛鼻腔拭子液樣品的PCR擴增結果；其中M =DNA分子量標準；1:多殺性巴氏桿菌陽性對照；2:多殺性巴氏桿菌陰性對照；3:檢測樣品；
圖2是因出血性敗血癥死亡的西門塔爾牛肺部組織樣品的PCR擴增結果；其中M =DNA分子量標準；1:多殺性巴氏桿菌陽性對照；2:多殺性巴氏桿菌陰性對照；3:檢測樣品；
圖3是急性病死牛的的血液組織樣品的PCR擴增結果；其中M:DNA分子量標準；1:多殺性巴氏桿菌陽性對照；2:多殺性巴氏桿菌陰性對照；3:檢測樣品。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。文中所述的較佳條件實施方法僅作示范之用。
[0019]實施例1
牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的基因診斷試劑盒，該試劑盒包括A液、B液、C液、盒子和泡沫板；
所述的A液為樣品稀釋液，內裝無菌生理鹽水，5管，5ml/管；
所述的B液為PCR反應液，I管，內裝192μ1 PCR擴增反應液，包括168μ1 ddH20、14.4μ1含Mg2+ 的 1XBuffer [Tris-HCl 10mmoI/L、pH為 9.0，KCl 500mmol/L, MgCl2 15mmol/L,
Triton-XlOO 1%]、3.2μ1 濃度為 250 μ mol/L 的 dNTP、2.4μ1 濃度為 0.5 μ mol/L 引物PmF,2.4μ1濃度為0.5 μ mol/L引物PmR和1.6μ1酶活單位為8U的TaqE ；PmF為:5’-ACGCTTTGCCTT GCAAGATAC-3’，PmR 為:5’-GATTCACGTAACAAACCAGGC-3’ ；所述的 C 液為陽性對照液，I管，內裝50μ1多殺性巴氏桿菌陽性模板；所述的C液為陽性對照液，I管，內裝50μ1多殺性巴氏桿菌陽性模板；
所述的盒子為長方體盒子，8.5X5.8X6.2cm3。
[0020]所述泡沫板裝于盒子中，其大小與盒子的底面相同，高2.2cm,有三排孔，第一排五個孔，孔徑1.3cm,第二排五個孔，孔徑1.0cm,第三排六個孔，孔徑0.6cm。上述各小瓶和小管分別對應放置于這些小孔中，裝于長方體盒子中。
[0021]該試劑盒中的一對引物的DNA序列如下:
PmF:5’-ACGCTTTGCCTT GCAAGATAC-3'；
PmR:5，-GATTCACGTAACAAACCAGGC-3，
PCR擴增反應液體系(25μ1體系)如下: ddH202?μ1
1XBuffer1.8μ1
dNTP0.4μ1
引物 PmF0.3μ1 引物 PmR0.3μ1
TaqE0.2μ1
實施例2
一種牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，使用實施例1試劑盒，按下列步驟進行:
步驟(1)，取0.05g被檢標本的急性病死牛的的肺部組織，加入樣品稀釋液，稀釋10倍，在無菌勻漿器中冰浴勻漿；
步驟(2)，將勻漿后的樣品下離心，離心的速度為3000r/min，時間為5min，得到離心后樣品的上層清液；
步驟(3)，將200μ1離心后樣品的上層清液煮沸lOmin，然后立刻放于冰上5min冷卻；步驟(4)，將冷卻后的樣品離心，離心的速度為3000r/min，時間為5min，取上層清液作為PCR模板；
步驟(5)，分別取體積比為1:1的PCR模板和C液，各加入到PCR反應液中，PCR模板與PCR反應液的體積比為1:24，C液與PCR反應液的體積比為1:24，混勻后2000r/min離心5秒，置于PCR儀上；
步驟(6)，按下列條件擴增:95°C預變性3min，94°C變性lmin，55°C退火45sec，72°C延伸lmin，34個循環，72°C延伸lOmin，保存于4°C，得到擴增產物；
步驟(7)，反應結束后取5μ1擴增產物，加2μ1溴酚藍混勻，經I %瓊脂糖凝膠電泳20分鐘后于紫外儀上觀察，在300bp處出現一明亮的反應條帶，與陽性對照在同一位置，則為多殺性巴氏桿菌陽性，說明檢測樣品中攜帶多殺性巴氏桿菌；若無反應條帶顯示，則為陰性，表明檢測樣品中不含多殺性巴氏桿菌，如圖1所示。
[0022]實施例3
一種牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，使用實施例1試劑盒，按下列步驟進行:
步驟(I )，取0.05g被檢標本的新鮮鼻腔拭子液，加入樣品稀釋液，稀釋20倍，在無菌勻漿器中冰浴勻漿；步驟(2)，將勻漿后的樣品下離心，離心的速度為4000r/min，時間為lOmin，得到離心后樣品的上層清液；
步驟(3)，將200μ1離心后樣品的上層清液煮沸lOmin，然后立刻放于冰上1min冷卻；
步驟(4)，將冷卻后的樣品離心，離心的速度為4000r/min，時間為lOmin，取上層清液作為PCR模板；
步驟(5)，分別取體積比為1:1的PCR模板和C液，各加入到PCR反應液中，PCR模板與PCR反應液的體積比為1:24，C液與PCR反應液的體積比為1:24，混勻后2000r/min離心5秒，置于PCR儀上；
步驟(6)，按下列條件擴增:95°C預變性3min，94°C變性lmin，55°C退火45sec，72°C延伸lmin，34個循環，72°C延伸lOmin，保存于4°C，得到擴增產物；
步驟(7)，反應結束后取ΙΟμΙ擴增產物，加2μ1溴酚藍混勻，經1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘后于紫外儀上觀察，在300bp處出現一明亮的反應條帶，與陽性對照在同一位置，則為多殺性巴氏桿菌陽性，說明檢測樣品中攜帶多殺性巴氏桿菌；若無反應條帶顯示，則為陰性，表明檢測樣品中不含多殺性巴氏桿菌，如圖2所示。
[0023] 實施例4 一種牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，使用實施例1試劑盒，按下列步驟進行:
步驟(1)，取0.1g被檢標本的急性病死牛的的血液組織，加入樣品稀釋液，稀釋15倍，在無菌勻漿器中冰浴勻漿；
步驟(2)，將勻漿后的樣品下離心，離心的速度為3600r/min，時間為7min。得到離心后樣品的上層清液；
步驟(3)，將200μ1離心后樣品的上層清液煮沸lOmin，然后立刻放于冰上8min冷卻；
步驟(4)，將冷卻后的樣品離心，離心的速度為3200r/min，時間為9min，取上層清液作為PCR模板；
步驟(5)，分別取體積比為1:1的PCR模板和C液，各加入到PCR反應液中，PCR模板與PCR反應液的體積比為1:24，C液與PCR反應液的體積比為1:24，混勻后2000r/min離心5秒，置于PCR儀上；
步驟(6)，按下列條件擴增:95°C預變性3min，94°C變性lmin，55°C退火45sec，72°C延伸lmin，34個循環，72°C延伸lOmin，保存于4°C，得到擴增產物；
步驟(7)，反應結束后取6μ1擴增產物，加2μ1溴酚藍混勻，經I %瓊脂糖凝膠電泳25分鐘后于紫外儀上觀察，在300bp處出現一明亮的反應條帶，與陽性對照在同一位置，則為多殺性巴氏桿菌陽性，說明檢測樣品中攜帶多殺性巴氏桿菌；若無反應條帶顯示，則為陰性，表明檢測樣品中不含多殺性巴氏桿菌，如圖3所示。
【權利要求】
1.牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的基因診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒包括A液、B液、C液、盒子和泡沫板； 所述的A液為樣品稀釋液，內裝無菌生理鹽水，5管，每管5mL ; 所述的B液為PCR反應液，I管，內裝192μ1 PCR擴增反應液，包括168μ1 ddH20、14.4μ1含Mg2+ 的 1XBuffer [Tris-HCl 10mmoI/L、ρΗ為 9.0，KCl 500mmol/L, MgCl2 15mmol/L, Triton-XlOO 1%]、3.2μ1 濃度為 250ymol/L 的 dNTP、2.4μ1 濃度為 0.5ymol/L 引物PmF,2.4μ1濃度為0.5 μ mol/L引物PmR和1.6μ1酶活單位為8U的TaqE ；PmF為:5’-ACGCTTTGCCTT GCAAGATAC-3’，PmR 為:5’-GATTCACGTAACAAACCAGGC-3’ ；所述的 C 液為陽性對照液，I管，內裝50μ1多殺性巴氏桿菌陽性模板； 所述泡沫板裝于盒子中，其大小與盒子的底面相同；泡沫板上有不少于上述小管數量的小孔，上述各小管分別對應放置于這些小孔中。
2.一種牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，其特征在于使用權利要求1所述試劑盒，按下列步驟進行: 步驟(I )，取被檢標本的新鮮含DNA樣品，加入樣品稀釋液，稀釋10~20倍，冰浴勻漿； 步驟(2)，將勻漿后的樣品下離心，得到離心后樣品的上層清液； 步驟(3)，將200μ1離心后樣品的上層清液煮沸lOmin，然后立刻放于冰上5~1min冷卻； 步驟(4)，將冷卻后的樣品離心，取上層清液作為PCR模板； 步驟(5)，分別取體積比為1:1的PCR模板和C液，各加入到PCR反應液中，PCR模板與PCR反應液的體積比為1:24，C液與PCR反應液的體積比為1:24，混勻后2000r/min離心5秒，置于PCR儀上； 步驟(6)，按下列條件擴增:95°C預變性3min，94°C變性lmin，55°C退火45sec，72°C延伸lmin，34個循環，72°C延伸lOmin，保存于4°C，得到擴增產物； 步驟(7)，反應結束后取5~10μ1擴增產物，加2μ1溴酚藍混勻，經I %瓊脂糖凝膠電泳20~30分鐘后于紫外儀上觀察，若在300bp處出現明亮的反應條帶，則為多殺性巴氏桿菌陽性；若無反應條帶顯示則為陰性。
3.根據權利要求2所述的牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，其特征在于所述的新鮮含DNA樣品為新鮮鼻腔拭子液。
4.根據權利要求2所述的牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，其特征在于所述的冰浴勻漿是在無菌勻漿器中。
5.根據權利要求2所述的牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，其特征在于所述的步驟(2)勻漿后的樣品離心的速度為3000~4000r/min，時間為5~lOmin。
6.根據權利要求2所述的牛重大病原菌一多殺性巴氏桿菌的檢測方法，其特征在于所述的步驟(4)冷卻后的樣品離心的速度為3000~4000r/min，時間為5~lOmin。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073567SQ201410343467
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】鄧先余, 林連兵, 夏雪山 申請人:昆明滇龍生物醫藥科技有限公司