一種多基因轉染嗜熱四膜蟲細胞株的構建方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種多基因轉染嗜熱四膜蟲細胞株的構建方法及其應用。將靶基因A的同源序列克隆到打靶載體pNeo4中，經基因槍法轉化營養期四膜蟲，巴龍霉素抗性篩選獲得大核基因遺傳轉化的陽性細胞株a；將靶基因B的同源序列克隆到打靶載體pBsr中，經基因槍法轉化營養期四膜蟲細胞株a，巴龍霉素配合殺稻瘟菌素抗性篩選，獲得大核基因遺傳轉化的陽性細胞株a/b。該方法解決了現有多基因轉染技術效率低、篩選過程復雜及耗時長等問題；并克服了現有技術無法獲得必需基因缺失或突變細胞株的局限，可研究必需基因缺失或突變對相關基因表達及功能的影響。本發明可用于對兩個不同目的基因進行敲除、突變或表位標注等定向修飾，從而實現四膜蟲多基因聯合應用研究。
【專利說明】一種多基因轉染嗜熱四膜蟲細胞株的構建方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種多基因轉染嗜熱四膜蟲細胞株的構建方法，以及該方法在四膜蟲多基因聯合研究中的應用。
【背景技術】
[0002]嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)是一種單細胞真核生物,屬于纖毛類原生動物，在單個細胞內集中了維持生命和延續后代所必需的一切功能，是研究蛋白功能理想的模式體系。作為研究某些人類疾病相關基因結構和功能的生物模型，四膜蟲內已建立了一系列成熟的基因重組和轉化技術，這些技術已經成功地通過基因敲除、過表達和突變等實現基因功能研究。近年來隨著對遺傳學研究的深入，人們發現生物性狀往往不是由單一基因控制，而是多個基因相互作用的結果，單基因遺傳研究已無法滿足四膜蟲蛋白組學發展的需要。因此有必要建立簡便、有效的多基因共轉染及共表達方法，同時對兩個不同目的基因進行敲除、突變或表位標注等改造，從而通過分析被定向改造的遺傳性狀，進一步探討四膜蟲中兩目的基因間的相互作用及功能關系。
[0003]目前，四膜蟲中常用的多基因聯合研究方法是通過小核轉染及巴龍霉素或殺稻瘟菌素抗性篩選，分別獲得小核A、B基因改造純合細胞株，再將該兩純合株接合配對，獲得具有雙抗性的、純合的大核及小核A、B基因改造細胞株(Bowen Cui，Yifan Liu, andMartin A.Gorovsky.Deposit1n and Funct1n of Histone H3 Variants in Tetrahymenathermophila.Molecular and Cellular B1logy.2006，26 (20):7719-7730.) ?盡管該方法可以獲得遺傳穩定的細胞株，即小核(生殖核，傳遞遺傳信息)和大核(體核，執行轉錄功能)中的內源基因均被改造，但該方法的轉染技術復雜、耗時長且成功率低，具體應用到四膜蟲的多基因定向修飾方面難度較大。首先，轉染效率低。小核基因改造純合細胞株是通過基因槍法轉染接合生殖過程減數分裂crescent期小核來完成的，該方法需要精確配比不同交配型的四膜蟲細胞，并提供穩定的環境條件，如溫度、濕度等，以確保幾乎完全同步的接合配對。并須嚴格把握轉染時機，即在90%以上配對細胞均進入crescent期時進行轉染，盡管如此，也無法保證成功轉染。其次，篩選過程繁瑣。除須進行巴龍霉素和殺稻瘟菌素抗性篩選外，還需經過3輪與不同缺陷型細胞株的配對，并進行6-甲基嘌呤和放線菌酮抗性篩選，才可獲得純合的小核基因改造細胞株。最后，無法獲得必需基因突變細胞株。接合生殖期小核轉染獲得的是純合的小核、大核基因改造細胞株，即小核與大核所有染色體上的等位基因均被完全替換或引入突變。因而對于接合期有性生殖細胞核分化和發育所必需的基因，核發育將終止，配對細胞則分開并降解；對于營養生殖期細胞生長所必需的基因，配對細胞在核發育完成后形成的后代細胞，由于大核中必需基因缺失導致的致死性表型，將無法存活。
[0004]如何能進一步提高四膜蟲多基因轉染成功率、簡化操作步驟，并獲得必需基因突變細胞株是應用多基因定向修飾實現四膜蟲基因聯合應用研究所面臨的重大課題。大核分步轉染不同基因打靶載體獲得大核多基因改造細胞株被認為是解決該問題的有效途徑之一。本發明通過大核分步轉染及巴龍霉素和殺稻瘟菌素分步配合篩選，先后獲得大核A基因改造細胞株及大核A、B基因改造細胞株。本發明與現有技術相比轉染效率高、操作簡單，且可用于研究必需基因缺失或突變對相關基因表達及功能的影響，是四膜蟲基因聯合應用研究的有效方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提高四膜蟲多基因轉染成功率、簡化操作步驟，并獲得必需基因突變或缺失細胞株從而進一步研究必需基因缺失或突變對相關基因表達及功能發揮的影響。為實現上述目的，本發明通過pNeo4及pBsr分別介導的基因打靶，及兩種抗生素配合篩選，可快速、有效實現兩不同目的基因轉染四膜蟲細胞株的構建，具體技術方案包括:
[0006]本發明中基因打靶載體pNeo4序列包含載體骨架、可插入靶基因同源序列的多克隆位點及含巴龍霉素(Paromomycin)抗性基因的Neo4基因盒，通過同源重組使得抗性基因序列Neo4基因盒替代靶基因。本發明中基因打靶載體pBsr源自載體pNeo4，將原有載體中含巴龍霉素抗性標記的Neo4基因盒替換為Bsr基因盒。Bsr基因盒源自載體pMNBL，是由四膜蟲組蛋白H4基因啟動子序列、殺稻痕菌素抗性基因(blasticidin S resistance gene,bsr)及BTU2基因終止子序列構成的融合序列(結構示意圖見附圖1A)。所述基因打靶載體pBsr的構建包括如下步驟:
[0007](I)以四膜蟲載體pMNBL為模板，上、下游引物為:5 ' GCGGCCGCGCATCTGGTGAGATATCTTCAAAGT-3 '(下劃線部分為Not I限制性酶切位點)、5' -CTCGAGATCATGATGGAAAATAAAACCA TGCA-3'(下劃線部分為 XholI 限制性酶切位點)，PCR擴增獲得包含殺稻瘟菌素抗性基因的Bsr基因盒序列；
[0008](2)對Bsr基因盒序列及pNeo4進行Not I和XholI雙酶切，并回收酶切產物:1.1kb Bsr基因盒及3.5 kb pNeo4大片段；
[0009](3)使用T4連接酶連接以上酶切片段，得到載體pBsr。
[0010]一種由pNeo4及pBsr介導的多基因轉染嗜熱四膜蟲細胞株的構建方法，包括如下步驟:
[0011](I)將靶基因A的5'和3'同源序列通過酶切、連接的方法，分別克隆到含巴龍霉素抗性標記的打靶載體pNeo4中，經基因槍法轉化營養期四膜蟲，通過巴龍霉素抗性篩選及PCR單克隆鑒定，獲得大核基因遺傳轉化的陽性細胞株a ；
[0012](2)將靶基因B的5'和3'同源序列通過酶切、連接的方法，分別克隆到含殺稻瘟菌素抗性標記的打靶載體PBsr中，經基因槍法轉化營養期四膜蟲細胞株a ;巴龍霉素配合殺稻瘟菌素抗性篩選:巴龍霉素與殺稻瘟菌素的初始濃度均為100μ g/mL，隨著殺稻瘟菌素濃度倍性增加，巴龍霉素濃度始終保持200 μ g/mL,直至殺稻瘟菌素達到終濃度800 μ g/mL。PCR單克隆鑒定獲得大核基因遺傳轉化的陽性細胞株a/b。
[0013]在殺稻瘟菌素篩選時，隨著濃度倍性增加(初始濃度為100 μ g/mL)，大核靶基因B逐漸被Bsr基因盒替換。在此過程中，為防止A基因回復突變，應加入適當濃度的巴龍霉素；而由于殺稻瘟菌素對四膜蟲細胞增殖有抑制作用，因此，有必要確定殺稻瘟菌素和巴龍霉素的最佳濃度配比，確保A基因不回復突變及B基因被Bsr基因盒替換。
[0014]本發明對巴龍霉素的最佳初始和終濃度進行了摸索:當不加入巴龍霉素時，隨著殺稻瘟菌素達到四膜蟲可耐受的最大濃度800 μ g/mL，A基因回復突變。當巴龍霉素初始濃度為200 μ g/mL時，剛經受基因槍轟擊的四膜蟲細胞無法存活。當初始濃度為100μ g/mL時，若巴龍霉素與殺稻瘟菌素濃度同時雙倍增加，四膜蟲細胞可耐受的兩者最高濃度均為400 μ g/mL ;而若巴龍霉素濃度到200 μ g/mL即不再增加，殺稻瘟菌素可達到四膜蟲最大耐受濃度800 μ g/mL。
[0015]表1殺稻瘟菌素和巴龍霉素的濃度配比
[0016]
【權利要求】
1.一種多基因轉染嗜熱四膜蟲細胞株的構建方法，其特征在于具體構建步驟包括: (1)將靶基因A的5'和3'同源序列通過酶切、連接的方法，分別克隆到含巴龍霉素抗性標記的打靶載體pNeo4中，經基因槍法轉化營養期四膜蟲，通過巴龍霉素抗性篩選及PCR單克隆鑒定，獲得大核基因遺傳轉化的陽性細胞株a ; (2)將靶基因B的5'和3'同源序列通過酶切、連接的方法，分別克隆到含殺稻瘟菌素抗性標記的打靶載體PBsr中，經基因槍法轉化營養期四膜蟲細胞株a，巴龍霉素配合殺稻瘟菌素抗性篩選:巴龍霉素與殺稻瘟菌素的初始濃度均為100μ g/mL，隨著殺稻瘟菌素濃度倍性增加，巴龍霉素濃度始終保持200 μ g/mL,直至殺稻瘟菌素達到終濃度800 μ g/mL,PCR單克隆鑒定獲得大核基因遺傳轉化的陽性細胞株a/b。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于所述的打靶載體PBsr具體構建步驟包括: (1)以四膜蟲載體PMNBL為模板，上、下游引物為:5'GCGGCCGCGCATCTGGTGAGATATCTTCAAAGT-3'、5' -CTCGAGATCATGATGGAAAATAAAACCATGCA-3'，PCR 擴增獲得包含殺稻瘟菌素抗性基因的Bsr基因盒序列，且在其5'和3'末端分別引入限制性內切酶Not I和XholI識別位點； (2)對Bsr基因盒序列及pNeo4進行NotI和XholI雙酶切，并回收酶切產物:Bsr基因盒及pNeo4大片段； (3)使用T4連接酶連接以上酶切片段，得到載體pBsr。
3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于所述的基因槍轉化法為基因槍粒子轟擊營養期四膜蟲大核。
4.權利要求1所述一種多基因轉染嗜熱四膜蟲細胞株的構建方法在四膜蟲必需基因RANl敲減及AIF蛋白與HA標簽蛋白融合表達中的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK104130944SQ201410342717
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月12日 優先權日:2014年7月12日
【發明者】梁海霞, 許靜, 王偉 申請人:太原理工大學, 山西大學