一種體外分離培養人的表皮細胞的新方法
【專利摘要】本發明提供一種體外分離培養人的表皮細胞的新方法：取人的包括表皮和真皮的正常皮膚組織，進行體外消化、分離，獲得人的表皮細胞；然后將表皮細胞進行體外擴增培養。本發明方法無需去除脂肪，無需將表皮和真皮進行分離。本發明方法所取皮膚組織為所有人體正常皮膚組織包括帶毛發的頭皮、帶脂肪的組織等。該方法簡便、快速、不受時間限制，適合各種皮膚組織如帶毛發的頭皮、帶脂肪的組織等直接分離。可建立較高活力的表皮細胞庫，以利臨床移植所需。
【專利說明】一種體外分罔培養人的表皮細胞的新方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種體外進行人表皮細胞的分離、培養的新方法，屬于組織細胞學領 域。
【背景技術】
[0002] 表皮細胞是皮膚表層的上皮細胞，主要由角朊細胞、樹枝狀細胞及麥克爾細胞組 成，其在創傷愈合中起至關重要的作用，尤其是嚴重燒傷病人表皮細胞的匱乏與其病程長 短、并發癥的發生、后期瘢痕的形成均有密切關系，因此應用組織工程技術在體外進行表皮 細胞的分離、培養與保存，直接或與其他材料共同組成復合皮膚應用于臨床始終都是燒傷 工作者的一個研究熱點。
[0003] 表皮細胞的培養繁殖始于1975年Rheinwald發表的有關文獻報道，后又經過一些 學者探索，目前有多種方法如Tr法、Tr-C法、Dispase法、Lp分離法等。表皮細胞分離過程 中常見的問題如：需特殊底物、特殊培養基、易與成纖維細胞混雜生長而難以長期生存、細 胞數量少、活力低、不易貼附等一直是研究者們力求改進和克服的。另外，以目前的技術水 平，并非所有部位的皮膚組織都能成功分離出表皮細胞，對于有毛發的皮膚組織如頭皮組 織，目前還沒有成功的案例。
[0004] 表皮細胞的培養方法有滋養層培養法、無滋養層無血清培養法以及氣液界面培養 法。其中滋養層培養法是最常用的表皮細胞培養法，它常采取鼠胚胎瘤的纖維母細胞株3T3 細胞經Q60照射或絲裂霉素 C處理喪失活力后作為表皮細胞的底物，可促進表皮細胞貼附 及生長，同時可接觸性抑制人體成纖維細胞在培養中的增殖。但由于3T3細胞可能產生和 表達對人體不利的代謝產物和抗原，而且培養液中的胎牛血清蛋白可同培養的表皮細胞膜 結合，易導致植皮后的排斥反應，且含血清的培養基易腐敗，影響細胞增殖和形態的觀察， 此外此法需同時兩種培養液，培養液需添加10余種附加成分，個別成分如霍亂毒素、硒離 子、表皮生長因子等價格昂貴且難予購買；3T3細胞滅活程度難以掌握、操作復雜等均不利 于推廣應用，目前僅使用做原代培養或被淘汰；氣液界面培養法是一種較新的表皮細胞培 養方法，它是應用異體表皮或類似于真皮樣物質以增加表皮基底層細胞與培養液的接觸， 并讓淺表部大多數細胞暴露于空氣中，任培養的角質細胞在這種人工創造的生理條件下得 以完全分化。它可以培養出類似正常皮膚結構的表皮細胞，角化程度高，但操作過程相對復 雜，需真皮類似物HSE等，培養過程不易觀察，培養周期長，不利于大量培養。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術的不足，本發明提供一種體外分離培養人的表皮細胞的新方法，該 方法簡便、快速、不受時間限制，適合各種皮膚組織如帶毛發的頭皮、帶脂肪的組織等直接 分離。可建立較高活力的表皮細胞庫，以利臨床移植所需。
[0006] 為實現上述目的，本發明米用的技術方案是：一種體外分離培養人的表皮細胞的 新方法，取人的包括表皮和真皮的正常皮膚組織，進行體外消化、分離，獲得人的表皮細胞； 然后將表皮細胞進行體外擴增培養。本發明方法無需去除脂肪，無需將表皮和真皮進行分 離。本發明方法所取皮膚組織為所有人體正常皮膚組織包括帶毛發的頭皮、帶脂肪的組織 等。
[0007] 具體步驟如下：
[0008] (1)采集人的正常皮膚組織樣本（包括表皮和真皮），約〇.5-5cm2,放入準備好的 F12培養基（Gibco31765)中，冷藏保存。
[0009] (2)組織稱重。
[0010] (3)組織用70 %酒精潤洗一下，然后放入含200U/ml青鏈霉素的PBS里浸泡5分 鐘，PBS用量以淹沒過組織為準，然后換新的含青鏈霉素的PBS溶液再次浸泡5分鐘以達到 滅菌消毒的目的。
[0011] (4)將組織完全切碎成勻漿。
[0012] (5)切碎后，每lg組織加入含有20ml消化液（含2. 5mg/ml膠原酶和2. 5mg/ml分 散酶的PBS)的離心管中，混勻。37°C水浴震蕩消化90-120min，然后加入終濃度為0. 05%的 胰蛋白酶繼續消化30min，最后再加100ull0mg/ml的脫氧核糖核酸酶（DNase)消化5min。
[0013] (6)組織消化好后加相同體積的含有10 % FBS的DMEM中和消化液，反復吸打 50-100 次。
[0014] (7)組織懸液用過濾器過濾，過濾后的液體lOOOrpm離心5min，棄上清。
[0015] (8)細胞沉淀用DMEM洗一次，然后離心棄上清。
[0016] (9)細胞沉淀用表皮細胞培養基重懸，鋪在coating matrix (Gibco)預處理過的 培養瓶或皿里面37°C、5% C02培養。
[0017] 本發明方法中表皮細胞可用任何可供細胞自然生長的培養基培養，包括MEM、 DMEM、RPMI、F-12、CNT07培養基等，培養基中根據需要添加不同生長因子如表皮細胞生長因 子EGF、表皮細胞生長因子B27和血小板（PC-1)補充液等，這些生長因子對調節細胞生長、 增殖和分化起著重要作用。另外，為了更好的維持表皮細胞的多功能性，在表皮細胞的培養 基中可加入2-10 μ Μ蛋白激酶抑制劑。表皮細胞培養環境應接近人體生理環境，培養基PH 值為6-8,優選7. 4 ;細胞的培養溫度為30°C -40°C，優選為35°C -37°C。培養3天以上，即 可獲得大量表皮細胞。
[0018] 本發明所用的分離方法適合所有的人正常皮膚組織包括帶毛發的頭皮、帶脂肪的 組織的直接分離，無需去除脂肪，無需將組織的真皮和表皮分離，將胰蛋白酶的消化時間縮 短至30分鐘，并且在胰蛋白酶消化之前用分散酶進行了預消化，既降低了胰蛋白酶對細胞 的損傷程度，又可獲得高數量、高活力、高克隆形成效率的細胞，培養過程中加入了蛋白激 酶抑制劑，可以有效抑制成纖維細胞的污染，操作過程簡便易于掌握，用時短，細胞狀態好、 易于貼壁。
[0019] 本發明的有益效果如下：
[0020] 1、本發明方法適合所有的人正常皮膚組織包括帶毛發的頭皮、帶脂肪的組織的直 接分離，無需去除脂肪。填補了利用有毛發的皮膚組織如頭皮組織成功分離出表皮細胞這 一技術空白。
[0021] 2、本發明方法無需滋養層，近似于生理狀態的細胞培養條件，表皮細胞可直接附 著于培養皿底面發生增殖，操作方便，成片時間早，消除了異種蛋白的影響，較適于表皮細 胞的大量培養。
[0022] 3、本發明方法無需將組織的表皮和真皮分離開，簡單，快速，分離的人表皮細胞數 量多，生長良好，連接成片，無成纖維細胞污染，培養過程中不需要加飼養層細胞，避免了其 他細胞的污染，且在此培養條件下，細胞保持了較為旺盛的增值力，有利于進行下一步實 驗。
[0023] 4、本發明技術可以用于制作人造皮膚，也可以作為種子細胞種植于支架材料上， 并最終構建成在結構和功能上與正常皮膚類似的人工皮膚，也可以進行自體細胞移植，用 于解決深度燒傷創面皮膚修復中自體皮膚來源有限的問題。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1為用本發明方法分離的人表皮細胞。
【具體實施方式】
[0025] 結合以下實例對本發明作進一步說明：
[0026] 在以下的實例1中，我們成功地用成人胸部皮膚分離并擴大培養出了人表皮細 胞。我們取了 〇. 3g的組織（約0. 5cm2)，經過2周的培養，表皮細胞數量超過3000萬，細胞 生長狀態良好，無其他細胞污染，且細胞經過凍存復蘇后仍保持良好的增殖能力和生長狀 態。實例2中我們用該發明方法成功地從帶毛發的人皮膚組織中分離出了表皮細胞。實例 3和4舉例說明了用本發明方法分離的人的表皮細胞的應用情況。
[0027] 實例1 :用成人胸部皮膚成功分離并擴大培養出人表皮細胞
[0028] (1)材料和方法
[0029] 組織：醫院手術廢棄的成人正常胸部皮膚（包括真皮和表皮），約0. 5cm2。
[0030] 細胞培養基：CNT07
[0031] (2)細胞分離及培養：
[0032] a)組織在F12培養液中冷藏運到實驗室，稱重。用70%酒精潤洗一下，然后放入 含200U/ml青鏈霉素的PBS里浸泡5分鐘2次。
[0033] b)用手術刀將組織完全切碎，時刻觀察組織情況，如果太干，補加 PBS。每lg組織 加入含有20ml消化液（含2. 5mg/ml膠原酶和2. 5mg/ml分散酶的PBS)的離心管中，混勻， 37°C水浴震蕩消化90-120min，然后加入終濃度為0. 05%的胰蛋白酶繼續消化30min，最后 再加100ull0mg/ml的脫氧核糖核酸酶（DNase)消化5分鐘，消化過程中每隔10-15min搖 晃一下管子將組織團塊搖散。
[0034] c)酶切過程中提前用coating matrix (Gibco)孵育細胞培養瓶，室溫孵育10分鐘 即可。
[0035] d)組織消化好后加相同體積的含有10 % FBS的DMEM中和消化液，反復吸打 50-100 次。
[0036] e)用過濾器過濾，過濾后的液體lOOOrpm離心5min，棄上清。并用DMEM清洗管子 和過濾器。
[0037] f) lOOOrpm 離心 5min，棄上清。
[0038] g)細胞沉淀用DMEM洗一次，然后離心棄上清。
[0039] h)沉淀用含有lOuM蛋白激酶抑制劑的表皮細胞培養基CNT07重懸，培養基PH值 為7. 4。鋪在步驟c預處理過的培養瓶里面，37°C、5% C02培養。
[0040] (3)結果：細胞分離出時數量較多，有聚團，第2天開始逐漸貼壁，顯微鏡下可觀察 到許多表皮細胞克隆，這些克隆逐漸連接成片，呈典型的"鋪路石"狀，如附圖1所示。細胞 基本無成纖維細胞污染。傳代和凍存后仍能保持良好的狀態和增殖能力。
[0041] 實例2 :用人頭部皮膚組織，成功分離并擴大培養出人頭部皮膚表皮細胞
[0042] (1)材料和方法
[0043] 組織：醫院手術廢棄的胚胎正常頭部皮膚（包括真皮和表皮），約1cm2。
[0044] 細胞培養基：CNT07
[0045] (2)細胞分離及培養：方法與實例1相同。
[0046] (3)結果：分離到的細胞克隆較多，易于貼壁，在培養瓶中能較快連接成片，細胞 呈"鋪路石"狀，細胞較純，傳代和凍存后仍能保持良好的狀態和增殖能力。
[0047] 實例3 :用本發明方法分離的人的表皮細胞應用于制作人造皮膚
[0048] (1)材料：BD膠原蛋白
[0049] (2)細胞：人的真皮細胞和實例1中獲得的人表皮細胞
[0050] (3)方法：
[0051] a)在冰上準備不含細胞的膠原蛋白層，并鋪到6孔細胞培養板嵌套孔內，室溫靜 置20分鐘使其凝膠。
[0052] b)將培養的真皮細胞消化下來，與膠混合基質混勻，鋪到非細胞膠原層上培養30 分鐘。
[0053] c)加入真皮細胞培養液培養3天。
[0054] d)去真皮細胞培養液，將分離培養的人的表皮細胞消化下來鋪在膠原蛋白膠中 心，室溫靜置15分鐘使細胞貼壁，然后培養箱中培養30-60分鐘。
[0055] e)加入DMEM :F12 (3:1)培養基培養3天。
[0056] f)棄去培養基，于氣液界面再培養4天。
[0057] h)用手術刀將人造皮膚切下，進行組織學分析。
[0058] (4)結果：通過組織學分析，可以看到，表皮細胞會在膠質的最上面形成一層，形 態和生化結構與人體內正常表皮層相似。表皮層下面為真皮細胞層。
[0059] 實例4 :用本發明方法分離的人的表皮細胞移植到小鼠身上實現人皮膚無疤痕再 生
[0060] (1)動物：免疫缺陷的裸鼠
[0061] (2)細胞：取自人頭部皮膚組織的真皮細胞和實例2中分離獲得的表皮細胞
[0062] (3)方法：從有免疫缺陷的裸鼠背上切取全層皮膚形成開放的傷口，將附有人的 表皮和真皮細胞的硅膠膜覆蓋于鼠的傷口上，細胞面與傷口直接接觸，硅膠膜覆蓋在上面。 每只裸鼠身上可做1到2個移植，并將硅膠膜與裸鼠皮膚縫合，將涂有藥膏的消毒紗布置于 傷口上，并用消毒繃帶包裹裸鼠。移植后的裸鼠每周觀察并拍照記錄，可觀察12周到一年。
[0063] (4)結果：移植4周后，移植處的創面已完全愈合，并形成有色素的新皮膚，沒有疤 痕形成，說明可以用于無疤痕的創傷愈合。到第12周，皮膚表面產生肉眼清晰可辨的帶有 色素的毛發。因為免疫缺陷的裸鼠沒有黑色素細胞不會形成含色素的皮膚和毛發，說明新 生的皮膚和毛發是來自移植的培養的細胞。長出來的毛發可以持續增長，6個月可以達到 3cm長。6個月組織切片染色（蘇木紫-伊紅染色方法）分析顯示：再生皮膚的結構和成人 頭皮的皮膚結構非常相似，含有表皮層，真皮層和皮下組織層，再生的毛發其成熟毛干連接 至皮脂腺和真皮乳突，可循環生長。
[〇〇64] 通過以上實施例結果可以看出用本發明的分離培養和擴增技術，可以有效地從所 有的人正常皮膚組織中分離出人的表皮細胞，方法簡單，用時短，無需將組織的真皮和表皮 分開，獲得的細胞數量多，狀態好，種類純。該技術為下一步進行組織工程學方面的研究提 供了必要的前提條件并打下了堅實的基礎，也是燒傷整形臨床實驗的基礎研究不可缺少的 重大組成部分，在此基礎上，人工皮膚的研究成為可能，大面積燒傷病人無排斥的自體細胞 種植早期永久性覆蓋創面成為可能，燒傷及整形病人的手術治療由"拆東墻補西墻"的單一 模式轉變為來源豐富的異體或自體皮膚封閉修補術等多種模式成為可能，因此它有著廣闊 的應用前景。
【權利要求】
1. 一種體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，取人的包括表皮和真皮的 正常皮膚組織，進行體外消化、分離，獲得人的表皮細胞；然后將表皮細胞進行體外擴增培 養；所述方法無需去除脂肪，無需將表皮和真皮進行分離。
2. 如權利要求1所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，具體步驟 如下： (1) 采集人的包括表皮和真皮的正常皮膚組織樣本約〇. 5-5cm2,放入準備好的F12培 養基中，冷減保存； (2) 組織稱重； (3) 組織用70 %酒精潤洗一下，然后放入含200U/ml青鏈霉素的PBS里浸泡5分鐘， PBS用量以淹沒過組織為準，然后換新的含青鏈霉素的PBS溶液再次浸泡5分鐘； (4) 將組織完全切碎成勻漿； (5) 切碎后，每lg組織加入含有20ml消化液的離心管中，混勻；37°C水浴震蕩消化 90-120min ;然后加入終濃度為0. 05%的胰蛋白酶繼續消化30min，最后再加100ull0mg/ml 的脫氧核糖核酸酶消化5min ; (6) 組織消化好后加相同體積的含有10% FBS的DMEM中和消化液，反復吸打50-100 次； (7) 組織懸液用過濾器過濾，過濾后的液體lOOOrpm離心5min，棄上清； (8) 細胞沉淀用DMEM洗一次，然后離心棄上清； (9) 細胞沉淀用表皮細胞培養基重懸，鋪在coating matrix預處理過的培養瓶或皿里 面 37°C、5% C02 培養。
3. 如權利要求2所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，所述步驟 (5)的消化液為含2. 5mg/ml膠原酶和2. 5mg/ml分散酶的PBS溶液。
4. 如權利要求2所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，所述表皮 細胞培養基，可以是MEM、DMEM、RPMI、F-12、CNT07培養基中的任意一種。
5. 如權利要求2或4所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，所述表 皮細胞培養基中可以添加不同生長因子，包括表皮細胞生長因子EGF，表皮細胞生長因子 B27、血小板補充液。
6. 如權利要求2或4所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，所述培 養基中加入2-10 μ Μ蛋白激酶抑制劑。
7. 如權利要求2所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，所述表皮 細胞培養的培養基ΡΗ值為6-8 ;細胞的培養溫度為30°C -40°C。
8. 如權利要求1或2所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，所述方 法在制作人造皮膚上的用途。
9. 如權利要求1或2所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，所述方 法在構建結構和功能上與正常皮膚類似的人工皮膚上的用途。
10. 如權利要求1或2所述的體外分離培養人的表皮細胞的新方法，其特征在于，所述 方法在自體細胞移植中的用途。
【文檔編號】C12N5/071GK104087551SQ201410342022
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月17日 優先權日:2014年7月17日
【發明者】吳訓偉, 刑志青 申請人:濟南磐升生物技術有限公司