一種篩選病毒毒種的方法
【專利摘要】本發明提供了一種篩選用于制備疫苗的病毒毒種的方法，包括：(a)提供一培養細胞；(b)將待篩選的病毒毒種與所述培養細胞相接觸一定時間；(c)對在步驟(b)中接觸過所述待篩選的病毒毒種的培養細胞，通過蝕斑克隆法分離出不同的病毒克隆，篩選出適于制備疫苗的第一輪病毒毒種，該方法還包括：(d)用在步驟(c)中收獲的第一輪病毒毒種，重復步驟(a)-(c)，篩選出適于制備疫苗的第二輪病毒毒種，(e)用在步驟(d)中收獲的第二輪病毒毒種系列稀釋，獲得一系列病毒濃度遞減的稀釋物，(f)將步驟(e)中的每一份稀釋物與培養細胞相接觸一定時間，(g)取步驟(f)中最高倍稀釋物的病變病毒克隆，繼續培養，篩選出適于制備疫苗的第三輪病毒毒種。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明的領域涉及一種篩選病毒毒種的方法，尤其涉及一種篩選優勢毒種，提高 細胞培養的病毒滴度及免疫原性的方法。 一種篩選病毒毒種的方法
【背景技術】
[0002] 病毒收獲液的病毒滴度，是病毒性疫苗產品的一項關鍵質量指標。以人用Vero狂 犬病疫苗為例，《中國藥典三部（2010版）》規定，狂犬病毒收獲液的病毒滴度> 6. 0LgLD50/ ml方可用于疫苗生產，通常仍需要將其超濾濃縮10?20倍以上才能用于制備成品疫苗。 超濾濃縮步驟不僅需要投入大量人力物力，增加成本，而且，有可能使濃縮后的成品苗的宿 主蛋白殘留物、DNA殘留物以及牛血清殘留物含量超標，影響疫苗質量。WHO建議狂犬病疫 苗的生產企業，當病毒滴度達到7. 5LgLD50/ml時，可以不必濃縮。因此高滴度的病毒收獲 液對于疫苗的質量和產量至關重要。
[0003] 采用高毒力、高效力的優勢毒種是獲得高滴度病毒收獲液的關鍵。然而，病毒性 疫苗生產中，疫苗毒株的毒力和效力下降，是比較普遍的現象。疫苗毒株毒力和效力下降 會導致疫苗生產過程中濃縮倍數的進一步提高，從而致使疫苗制作過程中成本提高、殘余 物質含量提高，導致生產出高質量的病毒性疫苗變的更加困難。造成這一現象的原因并 不完全清楚，一種可能的解釋是，疫苗毒株在多次傳代過程中，會產生缺損干擾病毒顆粒 (Defective Interfering Particles),簡稱DI顆粒。通常認為，DI顆粒含有正常的病毒 結構蛋白，但其內部包裹的核酸基因組有缺損。當病毒毒株中含有一定數量的DI顆粒時， DI顆粒會干擾正常病毒顆粒（又稱為標準病毒顆粒、親代病毒顆粒）在宿主體內的增值， 造成病毒毒株毒力和效力的下降。盡管某些病毒種類，例如脊髓灰質炎病、水泡性口膜炎病 毒及流感病毒的DI顆粒有較多的研究，但關于狂犬病毒DI顆粒的研究仍然不充分。而且， 疫苗毒株的毒力和效力下降，也可能包括其他的未知原因。
[0004] 因此，本領域迫切需要對毒力、效力下降的病毒毒株進行篩選，獲得高毒力、高效 力的優勢毒株。
【發明內容】
[0005] 本發明針對毒力、效力較低的病毒毒株，利用蝕斑克隆及有限稀釋2種方法通過3 次篩選獲得了高滴度、高免疫原性的病毒。本發明可用于實驗室新病毒的分離和篩選，也可 用于生產用毒株的優化。
[0006] 本發明提供了一種篩選用于制備疫苗的病毒毒種的方法，包括：
[0007] (a)提供一培養細胞；
[0008] (b)將待篩選的病毒毒種與所述培養細胞相接觸一定時間；
[0009] (c)對在步驟（b)中接觸過所述待篩選的病毒毒種的培養細胞，通過蝕斑克隆法 分離出不同的病毒克隆，篩選出適于制備疫苗的第一輪病毒毒種，該方法還包括：
[0010] ⑷用在步驟（c)中收獲的第一輪病毒毒種，重復步驟（a)?（c)，篩選出適于制 備疫苗的第二輪病毒毒種，
[0011] (e)用在步驟（d)中收獲的第二輪病毒毒種系列稀釋，獲得一系列病毒濃度遞減 的稀釋物，
[0012] (f)將步驟（e)中的每一份稀釋物與培養細胞相接觸一定時間，
[0013] (g)取步驟（f)中最高倍稀釋物的病變病毒克隆，繼續培養，篩選出適于制備疫苗 的第三輪病毒毒種。
[0014] 其中，該培養細胞為任何允許病毒生長的宿主細胞，具體可為任何哺乳動物細胞。 通常，該宿主細胞適合排除外源因子，具有可根據WHO對疫苗生產的要求確認的傳代數。很 多細胞系可用于分離和繁殖病毒。已使用的一些細胞系包括傳代細胞和二倍體細胞：MDCK 細胞系、MDBK細胞系、vero細胞系、BHK-21細胞系、CEF細胞系、Marc-145細胞系、PER-C6 細胞系、或FRhk-4細胞系。
[0015] 其中，用于本發明方法的病毒來源可從感染的動物或患者分離得到；也可從適當 的組織（如，ATCC)購買得到；或從科研實驗室得到。具體的病毒毒種可為狂犬病毒、乙腦病 毒、流感病毒、甲肝病毒，乙肝病毒，單純皰疹病毒，呼吸道合胞病毒，細小病毒，諾如病毒， 人乳頭瘤病毒，鼻病毒，黃熱病毒，登革熱病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，風疹病毒，水 痘-帶狀皰疹病毒，腸道病毒埃博拉病毒，或牛性腹瀉病毒。
[0016] 其中，本發明的方法特別適用于狂犬病毒CTN-1V株和其敏感細胞vero細胞系。
[0017] 其中，步驟（b)中的一定時間為1?2小時。
[0018] 其中，步驟（c)中的篩選出的克隆，在單層細胞上可見明顯的蝕斑形成，斑呈圓 型，蝕斑大小不同，但邊緣清晰，相互之間不融合，適于制備疫苗的第一輪病毒毒種，通過毒 力檢測及效力檢測，篩選出毒力高于6. 5LgFFU/ml，效力高于1. 5IU/ml的病毒毒種。
[0019] 其中，步驟（d)中的篩選出的克隆，在單層細胞上可見明顯的蝕斑形成，斑呈圓 型，蝕斑形狀大小基本一致，且邊緣清晰，相互之間不融合，適于制備疫苗的第二輪病毒毒 種，通過毒力及效力檢測，篩選出毒力高于7. OLgFFU/ml，效力高于1. 8IU/ml的病毒毒種。
[0020] 其中，步驟（e)中的所述的系列稀釋為ΚΓ5?ΚΓ7稀釋。
[0021] 其中，步驟（f)中的一定時間為7?9天。
[0022] 其中，所述步驟（f)中所述的篩選出適于制備疫苗的第三輪病毒毒種，是指通過 毒力及效力檢測，篩選出毒力高于7. 5LgFFU/ml，效力高于1. 8IU/ml的病毒毒種。
[0023] 其中，前述步驟（c)，（d)，（f)毒力及效力檢測通過直接免疫熒光試驗（FAT法）和 改良抗體結合試驗（M-ABT法）實行。
[0024] 本發明有以下特點：
[0025] 1、本發明通過將兩種常見的篩選方式相結合，二者結合能夠優勢互補，篩選出較 為理想的、均一的優勢克隆株。首先采用空斑克隆篩選，能夠觀察到不同形態的空斑以及 CPE發生時間和空間上的差異，在蝕斑克隆培養階段容易觀察到克隆感染能力的強弱和速 度，進一步對克隆進行毒力和效力檢測后可以挑選出優勢克隆。本發明在采用瓊脂糖蝕斑 克隆法后，繼續采用了有限稀釋法對克隆進行了進一步的篩選，選擇最高稀釋度進行培養 可進一步保證病毒克隆的純度和單一。其后采用有限稀釋法，將稀釋后的病毒接種至多孔 板，通過顯微鏡下對細胞的直接觀察也可以迅速看到該毒株在不同孔細胞的病變情況，主 要包括病變產生的時間、病變的強度和進展；通過多個平行孔的觀察，也能從側面反映出毒 株群體的均一度。兩種常規方法的組合而成的篩選方法，操作簡單、難度小、成功率高，可利 用簡便的操作技術解決疫苗研發過程中的難點問題。
[0026] 2、本發明特別是適用于狂犬病毒毒株的篩選，提供了每輪篩選的試驗參數和篩選 指標。
[0027] 3、本發明通過將兩種常見的篩選方式相結合，起到了出乎預料的技術效果，所取 得的病毒毒株的毒力產生了顯著增強，且病毒的免疫原性也有明顯提高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖1所示，為本發明狂犬病毒株三輪篩選示意圖。
[0029] 圖2a_c所示，為通過第一輪蝕斑克隆法所獲得的三種不同病變克隆在光學顯微 鏡下放大1〇〇倍的典型形態照片，分別記為IPUIIP1和IIIP1，而附圖2d則為空白細胞放 大1〇〇倍的典型形態照片；
[0030] 圖3a-C所示，分別為IP1、IIP1和IIIP1經過毒力及效力篩選后，所獲得的三 種不同病變克隆在光學顯微鏡下放大100倍的典型形態照片，分別記為IP1F3、IIP1F3、 IIIP1F3,而附圖3d則為空白細胞放大100倍的典型形態照片；
[0031] 圖4a_c所示，分別為1?1?3、11?1?3、111?1?3，二次克隆后優選高毒力高效力的克 隆連續在vero細胞上傳代3代之后的克隆，在光學顯微鏡下放大100倍的典型形態照片， 而附圖4d則為空白細胞放大100倍的典型形態照片。
【具體實施方式】
[0032] 以下通過實施例進一步說明本發明的內容，但本發明并不局限于實施例。本領域 技術人員也可以根據需要選擇其它的病毒毒株和敏感細胞，選擇適宜的病毒毒力和效力測 定方法實施本發明。
[0033] 病毒株與細胞株
[0034] 本發明實施例采用的病毒株為狂犬病毒CTN-1V株，由中國藥品生物制品檢定所 提供，其基因序列參見Genebank序列fj959397。采用的細胞為Vero細胞（非洲綠猴腎細 胞），來源于美國ATCC，由中國藥品生物制品檢定所提供。
[0035] 篩選方法
[0036] 本發明通過將常見的蝕斑克隆法、有限稀釋法進行特定的組合，用于篩選優勢病 毒株。本發明實施例優選的篩選方法包括2次蝕斑克隆法篩選、1次有限稀釋法篩選，本發 明實施例的篩選過程參見圖1。
[0037] 蝕斑形態觀察：本發明的發明人發現，篩選前的病毒株在進行蝕斑試驗時可產生 形態不同的蝕斑。本發明將蝕斑分為三類，其形態特征描述如下：
[0038] I型：其形態特征是：斑呈圓型，蝕斑相對比較大，肉眼可見，邊緣整齊清晰，蝕斑 相互獨立不融合，出斑時間較早；該型蝕斑對應的病毒克隆稱為IP1，經擴增三代后檢測， 其毒力和效力較高。
[0039] II型：其形態特征是：蝕斑形態小，邊緣較清晰，出斑時間較遲；該型蝕斑對應的 病毒克隆稱為IIP1，經擴增三代后其毒力和效力較低。
[0040] III型：其形態特征是：蝕斑形態較小，邊緣模糊，出斑時間遲；該型蝕斑對應的病 毒克隆稱為ΠΙΡ1，經擴增三代后其毒力和效力較低。
[0041] 經第一輪篩選后，挑選毒力和效力較高的I型蝕斑的克隆進行第二輪蝕斑篩選， 蝕斑形態趨于均一。
[0042] CPE觀察：又稱為致細胞病變效應（CPE)，指病毒感染敏感細胞后，引起敏感細胞 形態及代謝變化，這些效應包括但不限于：細胞變圓，脫落，退化，凋亡，活性氧物質（R0S) 誘導等。本發明著重觀察病毒感染后敏感細胞后出現典型病變效應的時間，作為衡量病毒 樣品毒力和效力的先彳丁指標。
[0043] 檢測方法
[0044] 毒力測定：本發明實施例采用兩種毒力測定方法，小鼠滴定法和細胞法（FAT法）。
[0045] 小鼠滴定法：將病毒樣品在冰浴中用含2%牛血清的PBS作10倍系列稀釋，顱內 注射小鼠0. 03ml/只，每個稀釋度4只，逐日觀察并于第4天后記錄小鼠發病及死亡數至第 14天，Reed和Muench法計算每批病毒的LD50值，單位以LgLD50/ml表示，具體參見《中國 藥典三部》2010版，111-113。
[0046] 細胞法（直接免疫熒光試驗法，FAT法）：在96孔微量培養板中3倍系列稀釋病毒 樣品，即100ul培養液中加50ul樣品，之后加入BSR單細胞懸液，細胞濃度為5X10 5/孔，同 時設2孔細胞對照，混勻后置37°C，5% C02孵箱中培養24h。棄培養液，PBS洗板孔1次，晾 干后加入80%冷丙酮固定-，2〇1：，1〇1^11后，棄丙酮，待揮發干燥后，加入工作濃度的？11^ 標記的狂犬病毒NP熒光抗體50ul/孔，37°C孵育60min，PBS洗板孔3次，于熒光顯微鏡下 觀察結果并計數每孔中熒光灶數，取〈20個熒光灶的兩個稀釋度的數據進行計算，單位用 FFU/ml表示。具體方法參見《中國生物制品雜志》，2006, Voll9(l) : 87-88。
[0047] 效力測定：本發明實施例采用兩種效力測定方法，分別是NIH法和M-ABT法。NIH 效力測定方法參見《中國藥典三部》，2010版，附錄80-81。M-ABT法效力測定方法參見《國 際檢驗醫學雜志》，2011年，第9期，第923-924頁，單位以IU/ml表示。
[0048] 免疫原性測定：將待測病毒經BPL滅活后免疫動物（免疫2次，間隔7天），檢測 中和抗體水平，單位以Π /ml表示。具體按《中國藥典三部》，2010版，111頁。
[0049] 以下實施例采用的方法如無特殊說明，均為常規方法，按照《中國藥典》（三部）中 "凍干人用狂犬病疫苗（Vero細胞）"中的相關要求進行。以下實施例中所用的實驗材料或 生物制劑，如無特殊說明，均為可從市場上購得的常規試劑。以下實施例中的定量實驗，均 設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0050] 實施例1.獲得利于組織培養的待篩選病毒
[0051] 取凍存的狂犬病毒CTN-1V株按0. 1M0I接種于T25細胞瓶，37°C吸附1小時后棄 毒，加入維持液（DMEM+1%牛血清），34. 5°C、5% C02的培養箱培養，8-10天后病變（++- +++)時收獲，記為CTN-1V-F1。將CTN-1V-F1在vero細胞上連續傳3代，從而獲得利于組 織培養的待篩選病毒，記為CTN-1V-F4(F4)，并用FAT法和M-ABT法檢測毒力效力（毒力 7. OLgFFU/ml，效力 1. 8IU/ml)，分裝 1. 5ml 離心管備用。
[0052] 實施例2.通過蝕斑克隆法篩選待篩選病毒狂犬病毒CTN-1V株
[0053] 2. 1第1輪克隆：
[0054] 將實施例1中收獲的狂犬病毒F4收獲液稀釋至1(Γ4-1(Γ6,每個稀釋度以4ml vero(2-3X10 5)細胞和0. 4ml稀釋病毒混種于6孔板，每個稀釋度接種2孔，同時以4ml vero (2-3X105)細胞和0. 4ml稀釋液混種6孔板作為細胞對照，2孔，37°C培養24小時。
[0055] 吸取上清棄去，每孔加2. 5mll %的營養瓊脂糖，34. 5°C培養3天。
[0056] 每孔補加含有0· 1M Η印es的1%的營養瓊脂糖lml，34. 5°C培養3天，顯微鏡下 觀察蝕斑，依據蝕斑大小分別挑出蝕斑接種至24孔板，同時加入lml細胞混種34. 5°C培養。
[0057] 如附圖2a_c所示，為通過蝕斑克隆法所獲得的三種不同病變克隆在光學顯微鏡 下放大100倍的典型形態照片，分別記為IPUIIP1和IIIP1，而附圖2d則為空白細胞放大 100倍的典型形態照片。
[0058] 在IP1、IIP1和IIIP1中，選取不同克隆在細胞上連續傳3代后收獲，并通過一段 時間的培養，以空白細胞作為參照，觀察其CPE (致細胞病變效應）以及通過FAT法和M-ABT 法進行毒力和效力檢測（表1)，選取可作為后續篩選的理想病毒毒株，記為IP1F3、IIP1F3、 IIIP1F3。附圖3a-c所示，分別為IP1F3、IIP1F3、IIIP1F3在光學顯微鏡下放大100倍的典 型形態照片，而附圖3d則為空白細胞放大100倍的典型形態照片。表1為IP1F3、IIP1F3、 IIIP1F3的毒力和效力檢測數據。
[0059] 表1. IP1F3、IIP1F3、IIIP1F3的毒力和效力檢測數據
[0060]
【權利要求】
1. 一種篩選用于制備疫苗的病毒毒種的方法，包括： (a) 提供一培養細胞； (b) 將待篩選的病毒毒種與所述培養細胞相接觸一定時間； (c) 對在步驟（b)中接觸過所述待篩選的病毒毒種的培養細胞，通過蝕斑克隆法分離 出不同的病毒克隆，篩選出適于制備疫苗的第一輪病毒毒種，該方法還包括： (d) 用在步驟（c)中收獲的第一輪病毒毒種，重復所述步驟（a)?（c)，篩選出適于制 備疫苗的第二輪病毒毒種， (e) 用在步驟（d)中收獲的第二輪病毒毒種系列稀釋，獲得一系列病毒濃度遞減的稀 釋物， (f) 將步驟（e)中的每一份所述稀釋物與所述培養細胞相接觸一定時間， (g) 取步驟（f)中最高倍稀釋物的病變病毒克隆，繼續培養，篩選出適于制備疫苗的第 三輪病毒毒種。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養細胞為哺乳動物細胞。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞為MDCK細胞系、MDBK細 胞系、vero細胞系、BHK-21細胞系、CEF細胞系、Marc-145細胞系、PER-C6細胞系、或FRhk-4 細胞系。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒毒種為狂犬病毒、乙腦病毒、流感 病毒、甲肝病毒，乙肝病毒，單純皰疹病毒，呼吸道合胞病毒，細小病毒，諾如病毒，人乳頭瘤 病毒，鼻病毒，黃熱病毒，登革熱病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，風疹病毒，水痘-帶狀 皰疹病毒，腸道病毒埃博拉病毒，或牛性腹瀉病毒。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞為vero細胞系，所述的病毒毒株 為狂犬病毒毒株。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（b)中的一定時間為1?2小時。
7. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（c)中的所述的篩選出適于制備疫 苗的第一輪病毒毒種，是指通過毒力及效力檢測，篩選出毒力高于6. 5LgFFU/ml，效力高于 1. 5IU/ml的病毒毒種。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟（d)中的所述的篩選出適于制備疫 苗的第二輪病毒毒種，是指通過毒力及效力檢測，篩選出毒力高于7. OLgFFU/ml，效力高于 1. 8IU/ml的病毒毒種。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟（e)中的所述的系列稀釋為ΚΓ5? 10_7稀釋。
10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟（f)中的一定時間為7?9天。
11. 如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述步驟（f)中所述的篩選出適于制備疫 苗的第三輪病毒毒種，是指通過毒力及效力檢測，篩選出毒力高于7. 5LgFFU/ml，效力高于 1. 8IU/ml的病毒毒種。
12. 如權利要求7, 8, 11所述的方法，其特征在于，所述毒力及效力檢測通過直接免疫 熒光試驗和改良抗體結合試驗實行。
【文檔編號】C12N7/00GK104109654SQ201410341791
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月17日 優先權日:2014年7月17日
【發明者】李薇, 李建強, 陳軍 申請人:蘭州生物制品研究所有限責任公司