一種重組發光細菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株重組發光細菌及其應用。本發明公開的一種重組菌，該菌是將mer基因中的R基因和o/p位點組成的調控識別元件插入載體上缺乏啟動元件的發光基因上游，并導入受體菌中得到。利用本發明公開的汞特異響應的重組發光細菌作為測試菌種，可以通過發光強度的大小判定水體中可生物利用性的汞濃度范圍。與傳統的物理化學檢測方法相比，本發明提供的方法成本低、操作簡單、結果可靠性高、易于實現自動在線化、不需要特殊的高精度的分析儀器和檢測設備，可應用于環境水質監測領域，對于汞污染物質的預警監測具有非常重要的經濟和社會意義。
【專利說明】一種重組發光細菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組發光細菌及其應用；特別涉及一種重組發光細菌及其在檢測 汞含量中的應用，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 金屬冶煉、科學測量儀器制造和化石燃料燃燒等都會產生汞的污染。與其他重金 屬相似，汞污染具有持久性，在微劑量暴露的情況下，通過生物累積和生物擴大，使得含汞 的污染物對任何生態系統都會造成很大的影響。其中，對污染貢獻最大的為可生物利用組 分的汞。
[0003] 目前，我國標準化測汞的方法主要是光譜法，例如原子吸收光譜法等，而在線化的 監測方法則是以陽極溶出伏安法為主的電化學方法。這些物理化學的檢測方法雖然能夠實 現水體中汞含量的高精度和高靈敏度檢測，但難以用來評價汞對生物體造成的實際影響。 GB/T15441-1995和IS011348-2007中的發光細菌檢測方法雖然也能用于汞的生物毒性評 價，但天然發光細菌所給出的是急性綜合毒性結果，除了汞之外還有許多的污染物能引起 天然發光細菌的發光表達變化。而且，天然發光細菌所要求的3%氯化鈉可能會改變實際水 體中重金屬的生物可利用性，影響測試的準確性。重組發光細菌檢測技術是基于天然發光 細菌工作機理上發展起來的技術，該技術通過將發光基因和重金屬響應基因導入大腸桿菌 等受體細胞中得到重組發光細菌，能夠實現對水體中重金屬暴露風險的快速靈敏檢測，并 且有望實現自動在線化，在水環境的重金屬的監測預警領域有很好的應用前景。
[0004] mer基因是一類特異針對汞的拮抗基因，其基因簇組成一般為R、T、P、C、A及D基 因，其中R基因編碼能特異識別汞，并且調控整個基因表達的merR阻遏蛋白，merR蛋白正常 情況下結合在R和T基因之間的基因表達調控位點--o/p位點，merR蛋白與汞結合時構 象發生改變，使RNA聚合酶能與o/p位點結合，啟動整個mer基因的表達（Barkay T，Miller SM, Summers AO. 2003. Bacterial mercury resistance from atoms to ecosystems. Ferns Microbiology Reviews27:355-384.) 〇
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種重組發光細菌及其應用，利用本發明提供的汞特異響應 的重組發光細菌作為測試菌種，可以通過發光強度的大小判定水體中可生物利用性的汞濃 度范圍。
[0006] 本發明提供一種重組菌，該菌是將mer基因中的R基因和o/p位點組成的調控識 別元件插入載體上缺乏啟動元件的發光基因上游，并導入受體菌中得到。
[0007] 上述重組菌中，所述載體為pU⑶615質粒；
[0008] 所述插入的位點為pU⑶615質粒上的BamHI和EcoRI位點間。
[0009] 上述任一所述的重組菌中，所述調控識別元件為SEQ ID No. 3所示的DNA分子或 SEQ ID No. 3中自5'末端起第10位至第521位核苷酸所示的DNA分子；
[0010] 所述受體菌為大腸桿菌，具體為大腸桿菌E. coli DH5 α。
[0011] 上述任一所述的重組菌中，所述重組菌為保藏編號為CGMCC No. 8917的菌。
[0012] 上述任一所述的重組菌是能特異識別汞的mer重組發光細菌。
[0013] 一種判定樣品中可生物利用性的汞濃度范圍的試劑盒也屬于本發明的保護范圍， 該試劑盒包含上述任一所述的重組菌。
[0014] 一種判定樣品中可生物利用性的汞濃度范圍的方法也屬于本發明的保護范圍，包 括如下步驟：將汞特異的重組發光細菌的菌液與不同濃度的汞的水溶液混合得反應液；將 反應液置于20°c -27°c反應30min以上，測定其全波長的發光強度值，記作RLU;以不同濃 度的汞的水溶液中汞的濃度為橫坐標，RLU為縱坐標，制作標準曲線，在橫坐標箭頭所示的 方向得到標準曲線的第1、第2、第3和第4個拐點，其中第1和第2個拐點之間的曲線是標 準曲線中的RLU上升期曲線、第2和第3個拐點之間的曲線是標準曲線中的RLU平臺期曲 線，第3和第4個拐點之間的曲線是標準曲線中的RLU下降期曲線；按照上述方法分別測定 待測樣品溶液的發光強度值，記作RLUs，陽性樣品液的發光強度值，記作RLU P、陰性樣品液 的發光強度值，記作RLUN、內標液的發光強度值，記作RLR，其中僅將不同濃度的汞的水溶 液分別替換為所述的待測樣品溶液、陽性樣品液、陰性樣品液和內標液；當RLU P/RLUN > 50 時，若RLUN = RLUS < RL4 = RLUP，待測樣品溶液中的可生物利用性的汞濃度小于第1個拐 點處的汞濃度，若RLUN < RLUS < RLR = RLUP，待測樣品溶液中的可生物利用性的汞濃度大 于第1個拐點處的汞濃度且小于第2個拐點處的汞濃度，若RLU N < RLUS = RL4 = RLUP，待測 樣品溶液中的可生物利用性的汞濃度大于第2個拐點處的汞濃度且小于第3個拐點處的汞 濃度，若RLU N < RLUS = RLR < RLUP，待測樣品溶液中的可生物利用性的汞濃度大于第3個 拐點處的汞濃度且小于第4個拐點處的汞濃度，若RLU N = RLUS = RLR < RLUP，待測樣品溶 液中的可生物利用性的汞濃度大于第4個拐點處的汞濃度或待測樣品溶液具有高細胞毒 性；當RLU P/RLUN < 50時，應重新制備汞特異的重組發光細菌的菌液，使得RLUP/RLUN彡50， 再進行上述測定；
[0015] 所述汞特異的重組發光細菌為上述任一所述的重組菌；
[0016] 所述不同濃度的汞的水溶液由NaCl、HgCl2和水組成；
[0017] 所述待測樣品溶液為待測樣品中加入NaCl的溶液；
[0018] 所述陽性樣品液為含有NaCl的HgCl2的水溶液；
[0019] 所述陰性樣品液為NaCl水溶液；
[0020] 所述內標液為待測樣品中加入NaCl和HgCl2的溶液；
[0021] 所述陽性樣品液和內標液中的HgCl2的濃度相同，且為第2和第3個拐點之間的 汞濃度；
[0022] 所述不同濃度的汞的水溶液、待測樣品溶液、陽性樣品液、陰性樣品液和內標液中 NaCl的濃度均相同；
[0023] 所述 RLUS > RLUN 為 RLUS > 2 X RLUN+S (RLUN)，所述 RLUS = RLUN 為 RLUS < 2XRLUN+S(RLUN)，S(RLUN)為所述陰性樣品液發光強度的標準差；
[0024] 所述 RLUS = RLU〗為 0· 8RLU〗< RLUS < 1. 2RLU〗，所述 RLUS < RLU〗為 RLUS < 0· 8RLR ; 若RLUS > 1. 2RLR，則說明實驗有誤，需重新進行測試。
[0025] 所述 RLU〗=RLUP 為 0· 8RLUP < RLU〗< 1. 2RLUP，所述 RLU〗< RLUP 為 RLU〗< 0· 8RLUP ; 若RI^ > 1. 2RLUP，則說明試驗有誤，需重新進行測試。
[0026] 上述方法中，所述不同濃度的汞的水溶液中HgCl2的終濃度為lnmol/L-lmmol/ L，具體為 1ηΜ、3· 3ηΜ、6· 6ηΜ、10ηΜ、33ηΜ、66ηΜ、100ηΜ、330ηΜ、660ηΜ、1 μΜ、3· 3μΜ、6· 6μΜ、 10 μ Μ、33 μ Μ、66 μ Μ、100 μ Μ、330 μ Μ、660 μ Μ、ImM ;
[0027] 所述反應液中汞特異的重組發光細菌的菌液與不同濃度的汞的水溶液的體積比 為 1:1 ;
[0028] 所述不同濃度的汞的水溶液、待測樣品溶液、陽性樣品液、陰性樣品液和內標液中 NaCl 的濃度為 0· 5g/100ml-lg/100ml，具體為 lg/100ml 或 0· 5g/100ml ;
[0029] 所述反應液的反應溫度為27°C，反應時間為30min-90min，具體為30min-60min， 再具體為30min或60min ;
[0030] 所述第1個拐點處的汞濃度為10nM，第2個拐點處的汞濃度為ΙΟΟηΜ，第3個拐點 處的汞濃度為6. 6 μ M，第4個拐點處的汞濃度為33 μ M。
[0031] 上述任一所述的方法中，所述汞特異的重組發光細菌的菌液為非冷凍干燥的上述 任一所述的重組菌的對數生長期的菌液；
[0032] 或，
[0033] 所述汞特異的重組發光細菌的菌液為冷凍干燥的上述任一所述的重組菌復蘇得 到的菌液；
[0034] 所述菌液具體是將上述任一所述的重組菌在LB培養基中培養得到；
[0035] 所述菌液可以用LB培養基、lg/100ml的NaCl水溶液、以醋酸鹽、丙酮酸鹽等作為 碳源，以磷酸鹽作為緩沖體系將pH維持在中性的營養液進行稀釋。
[0036] 上述任一所述的重組菌在制備判斷樣品中可生物利用性的汞濃度的產品中的應 用也屬于本發明的保護范圍。
[0037] 上述試劑盒在制備判斷樣品中可生物利用性的汞濃度的產品中的應用也屬于本 發明的保護范圍。
[0038] 重組發光細菌檢測方法幾乎不存在假陽性問題，而本發明提供的方法，能有效避 免假陰性問題。另外，本發明提供的方法利用重組發光細菌在汞暴露情況下發光的特點，通 過簡單的發光檢測儀對不同測試樣品的發光強度進行測試，比較數值大小即可快速判斷水 樣中汞的含量。與傳統的物理化學檢測方法相比，該方法成本低、操作簡單、結果可靠性高、 易于實現自動在線化、不需要特殊的高精度的分析儀器和檢測設備，可應用于環境水質監 測領域，本發明對于汞污染物質的預警監測具有非常重要的經濟和社會意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039] 圖1為重組菌在不同汞濃度暴露下的發光強度標準曲線1。
[0040] 圖2為重組菌在不同汞濃度暴露下的發光強度標準曲線2。
[0041] 圖3為重組菌暴露于含有10 μ M HgCl2的不同濃度的CdCl2水溶液的發光強度。
【具體實施方式】
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0043] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0044] pU⑶615質粒在文獻"黃新新，何苗，羅虹，施漢昌，蔡強.pU⑶-recA重組發光 菌構建及對遺傳毒性污染物響應作用.環境科學.2009年6月，第30卷第6期."中公開 過，公眾可從清華大學獲得。
[0045] Pseudomonas putida strain SP1 在文獻"Zhang ffff，Chen LX, Liu DY. 2012. Characterization of a marine-isolated mercury-resistant Pseudomonas putida strain SPland its potential application in marine mercury reduction. Appl Microbiol Biot93:1305-1314. "中公開過，公眾可從清華大學獲得。
[0046] 實施例1、mer-萊響應重組發光細菌的構建
[0047] 構建mer重組發光細菌時，將R基因和o/p位點組成的調控識別元件插入缺乏啟 動元件的發光基因上游，并導入合適的受體細胞內便能得到能特異識別汞的mer重組發光 細菌。
[0048] 以Pseudomonas putida strain SP1 的基因組DNA為模板，設計上游引物5'_CGCQ GATCCGCATTTCTCCTTTCGA-3' (SEQ ID No. 1，下劃線所示序列為BamH I酶切識別位點）和下 游引物5'-CCGGAATTCTTACGCAACGGGAAAT-3'（SEQIDNo.2，下劃線所示序列為EcoRI酶 切識別位點）進行PCR擴增，得到基因組DNA中的merRo/p序列，該序列如SEQ ID No. 3所 示，SEQ ID No. 3中自5'末端起第10位至第80位為o/p序列，第81位至第521位為merR 蛋白的編碼基因序列，SEQ ID No. 4所不的序列為merR蛋白的氣基酸序列；
[0049] BamHI和EcoRI雙酶切SEQIDNo·3所示的DNA分子，得到基因片段；BamHI 和EcoR I雙酶切pU⑶615,得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質 粒，將重組質粒測序，結果正確。將重組質粒轉化大腸桿菌E.coli DH5a，得到重組發光細 菌 mer-pUCD615。
[0050] 重組發光細菌mer_pUO)615分類命名為大腸埃希氏菌（Escherichia coli)，該 菌已于2014年3月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱 CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號為 CGMCC No. 8917。
[0051] 實施例2、用重組發光細菌mer-pU⑶615檢測水樣中的汞
[0052] 重組發光細菌mer-pU⑶615能實現對重金屬萊的單一特異響應，不受鎘、鉛等其 他金屬污染物的干擾，不存在假陽性問題。在細胞毒性不高的條件下，只要水樣中存在可生 物利用的汞，就能使該菌株由不發光變成持續發光，進而通過現代光子檢測技術檢測發光 強度，利用該菌株判定水體中可生物利用性的汞濃度范圍的具體步驟如下：
[0053] -、制備測試用菌液
[0054] 如下（一）或（二）所示的兩種方法均可。
[0055] ( -）將重組發光細菌mer-pUCD615接種于LB培養基，置于37°C、180rpm的搖床 中培養至〇D_ = 0. 5505 (對數生長中期均可），用新鮮LB培養基進行10倍稀釋，得到測試 用菌液（測試用菌液中細菌濃度不能過低，應滿足下述的> 50的要求）。
[0056] (二）將冷凍干燥的重組發光細菌mer-pU⑶615復蘇，具體是將保存于_20°C冰箱 的冷凍干燥的重組發光細菌mer-pU⑶615取出，迅速加入lmL的4°C預冷LB培養基，室溫放 置5min，得到復蘇菌液。取復蘇菌液200 μ L，用lg/100ml的NaCl水溶液稀釋50倍，得到 10mL測試用菌液（測試用菌液中細菌濃度不能過低，應滿足下述的I max > 50的要求）。
[0057] 二、制備測試液
[0058] 汞響應劑量響應曲線測試液：用lg/100ml的NaCl水溶液制備濃度lnmol/L? lmmol/L(具體為 1ηΜ、3· 3ηΜ、6· 6ηΜ、10ηΜ、33ηΜ、66ηΜ、100ηΜ、330ηΜ、660ηΜ、1 μΜ、3· 3μΜ、 6· 6 μ Μ、10 μ Μ、33 μ Μ、66 μ Μ、100 μ Μ、330 μ Μ、660 μ Μ、ImM)的 HgCl2 標準溶液，以 lg/100ml 的NaCl水溶液作為陰性樣品液。
[0059] 三、發光強度測試
[0060] 將步驟一中（一）或（二）制備的測試用菌液與步驟二中的各濃度的汞響應劑量 響應曲線測試液按體積比1 :1比例混合，得到反應液。每個濃度設置一個平行樣，將反應液 置于27°C (20-27°C均可）反應，美國Molecular Devices公司的SpectraMax M5酶標儀測 試反應0min、30min和60min(30min以上均可，優選在30min-90min)的發光強度值（RLU)。 [0061] 四、標準曲線的制作
[0062] 以汞響應劑量響應曲線測試液中的汞濃度為橫坐標，以RLU為縱坐標，將不同汞 濃度暴露時發光強度的變化制成標準曲線，用步驟一中（一）制備的測試用菌液得到的標 準曲線如圖1所示，用步驟一中（二）制備的測試用菌液得到的標準曲線如圖2所示。按 照上述方法繪制的陰性樣品液的曲線與圖1和圖2中的Omin曲線相似。
[0063] 圖1和圖2中的30min和60min的標準曲線均可以用于判定水體中可生物利用性 的汞濃度范圍。
[0064] 五、汞響應劑量響應曲線數據整理與評價
[0065] (一）待測水樣液（待測水樣中加入NaCl，使得NaCl的濃度為lg/100ml) RLUS、陽 性樣品液（含有lg/l〇〇ml NaCl的1 μ M HgCl2的水溶液）RLUP、陰性樣品液（lg/100ml的 NaCl水溶液）RLUN、內標液（待測水樣中加入NaCl和HgCl2，使得NaCl的濃度為lg/100ml， HgCl2的濃度為1 μ M) RLU:，方法同步驟三，僅將步驟三中的各濃度的汞響應劑量響應曲線 測試液替換為上述各溶液。
[0066] 陽性樣品液和內標液中的HgCl2的濃度可以選擇圖1中平臺期（圖1中第2至第 3個拐點之間）的同一濃度。
[0067] (二）首先計算最大光增量Imax = RLUP/RLUN，Imax彡50時，可根據表1判定樣品中 的汞濃度范圍，若1_〈50,則可能是mer-pUCD615菌液放置時間過久或者測試用菌液稀釋 過度，應重新準備測試菌液，使得I max > 50。
[0068] 表1不同測試結果對應的萊濃度范圍
[0069]
【權利要求】
1. 一種重組菌，該菌是將mer基因中的R基因和o/p位點組成的調控識別元件插入載 體上缺乏啟動元件的發光基因上游，并導入受體菌中得到。
2. 根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于：所述載體為pU⑶615質粒； 所述插入的位點為PU⑶615質粒上的BamH I和EcoR I位點間。
3. 根據權利要求1或2所述的重組菌，其特征在于：所述調控識別元件為SEQ ID No. 3 所示的DNA分子或SEQ ID No. 3中自5'末端起第10位至第521位核苷酸所示的DNA分 子； 所述受體菌為大腸桿菌，具體為大腸桿菌E. coli DH5 α。
4. 根據權利要求1-3任一所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌為保藏編號為CGMCC No. 8917 的菌。
5. -種判定樣品中可生物利用性的汞濃度范圍的試劑盒，該試劑盒包含權利要求1-4 任一所述的重組菌。
6. -種判定樣品中可生物利用性的汞濃度范圍的方法，包括如下步驟：將汞特異的重 組發光細菌的菌液與不同濃度的汞的水溶液混合得反應液；將反應液置于20°C -27°C反應 30min以上，測定其全波長的發光強度值，記作RLU ;以不同濃度的汞的水溶液中汞的濃度 為橫坐標，RLU為縱坐標，制作標準曲線，在橫坐標箭頭所示的方向得到標準曲線的第1、第 2、第3和第4個拐點，其中第1和第2個拐點之間的曲線是標準曲線中的RLU上升期曲線、 第2和第3個拐點之間的曲線是標準曲線中的RLU平臺期曲線，第3和第4個拐點之間的曲 線是標準曲線中的RLU下降期曲線；按照上述方法分別測定待測樣品溶液的發光強度值， 記作RLUs，陽性樣品液的發光強度值，記作RLU P、陰性樣品液的發光強度值，記作RLUN、內標 液的發光強度值，記作RLR，其中僅將不同濃度的汞的水溶液分別替換為所述的待測樣品 溶液、陽性樣品液、陰性樣品液和內標液；當RLU P/RLUN彡50時，若RLUN = RLUS < RLUi = RLUP，待測樣品溶液中的可生物利用性的汞濃度小于第1個拐點處的汞濃度，若RLUN < RLUS < RLR = RLUP，待測樣品溶液中的可生物利用性的汞濃度大于第1個拐點處的汞濃度且小 于第2個拐點處的汞濃度，若RLU N < RLUS = RLR = RLUP，待測樣品溶液中的可生物利用性 的汞濃度大于第2個拐點處的汞濃度且小于第3個拐點處的汞濃度，若RLU N < RLUS = RLUi < RLUP，待測樣品溶液中的可生物利用性的汞濃度大于第3個拐點處的汞濃度且小于第4 個拐點處的汞濃度，若RLU N = RLUS = RLR < RLUP，待測樣品溶液中的可生物利用性的汞濃 度大于第4個拐點處的汞濃度或待測樣品溶液具有高細胞毒性；當RLU P/RLUN < 50時，應重 新制備汞特異的重組發光細菌的菌液，使得RLUP/RLUN > 50,再進行上述測定； 所述汞特異的重組發光細菌為權利要求1-4任一所述的重組菌； 所述不同濃度的汞的水溶液由NaCl、HgCl2和水組成； 所述待測樣品溶液為待測樣品中加入NaCl的溶液； 所述陽性樣品液為含有NaCl的HgCl2的水溶液； 所述陰性樣品液為NaCl水溶液； 所述內標液為待測樣品中加入NaCl和HgCl2的溶液； 所述陽性樣品液和內標液中的HgCl2的濃度相同，且為第2和第3個拐點之間的汞濃 度； 所述不同濃度的汞的水溶液、待測樣品溶液、陽性樣品液、陰性樣品液和內標液中NaCl 的濃度均相同； 所述 RLUS > RLUn 為 RLUS > 2XRLUn+S(RLUn)，所述 RLUs = RLUn 為 RLUs < 2XRLUn+S(RLUn)，S(RLUn)為所述陰性樣品液發光強度的標準差； 所述 RLUS = RLU:為 0· 8RLU: < RLUS < L 2RLU:，所述 RLUS < RLU:為 RLUS < 0· 8RLR ; 所述 RLU: = RLUP 為(λ 8RLUP < RLU: < L 2RLUP，所述 RLU: < RLUP 為 RLU: < (λ 8RLUP。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述不同濃度的汞的水溶液中HgCl2的 終濃度為 lnmol/L-lmmol/L,具體為 1ηΜ、3· 3ηΜ、6· 6nM、10nM、33nM、66nM、100nM、330nM、 660nM、1 μ Μ、3. 3 μ Μ、6. 6 μ Μ、10 μ Μ、33 μ Μ、66 μ Μ、100 μ Μ、330 μ Μ、660 μ M、ImM ; 所述反應液中汞特異的重組發光細菌的菌液與不同濃度的汞的水溶液的體積比為 1：1 ； 所述不同濃度的汞的水溶液、待測樣品溶液、陽性樣品液、陰性樣品液和內標液中NaCl 的濃度為 〇· 5g/100ml-lg/100ml，具體為 lg/100ml 或 0· 5g/100ml ; 所述反應液的反應溫度為27°C，反應時間為30min-90min，具體為30min-60min，再具 體為 30min 或 60min。
8. 根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述汞特異的重組發光細菌的菌液 為非冷凍干燥的權利要求1-4任一所述的重組菌的對數生長期的菌液； 或， 所述汞特異的重組發光細菌的菌液為冷凍干燥的權利要求1-4任一所述的重組菌復 蘇得到的菌液； 所述菌液具體是將權利要求1-4任一所述的重組菌在LB培養基中培養得到。
9. 權利要求1-4任一所述的重組菌在制備判斷樣品中可生物利用性的汞濃度的產品 中的應用。
10. 權利要求5所述的試劑盒在制備判斷樣品中可生物利用性的汞濃度的產品中的應 用。
【文檔編號】C12R1/19GK104140943SQ201410338865
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月16日
【發明者】汪用志, 何苗 申請人:清華大學