獲得人源OPCs的方法和OPCs培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及獲得人源OPCs的方法和OPCs培養基。本發明將神經干細胞作為分選來源，通過免疫磁珠的方法分離得到人源OPCs，并找到了適合OPCs體外培養和傳代的較經濟型的培養基，可以在短時間內獲得大量的高純度的人源OPCs，為臨床應用提供了新的選擇。
【專利說明】獲得人源OPCs的方法和OPCs培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及獲得人源OPCs的方法和OPCs培養基。
【背景技術】
[0002]腦白質損傷、脊髓損傷、多發性硬化等髓鞘相關疾病由于神經元的髓鞘化障礙或脫髓鞘化，導致了神經元不能正常傳遞電興奮，從而導致機體運動等功能失能。由于目前還沒有任何一種藥物可以有效地治療這些髓鞘相關疾病，這給這些疾病的患者及家庭帶來了極大的傷害，這使得有效治療髓鞘相關疾病成為當今急待解決的社會和醫學難題。
[0003]不論是髓鞘化障礙還是脫髓鞘病變，其根源都是神經元軸突髓鞘程度減少或丟失，因此如果能夠恢復神經元軸突的髓鞘化程度，使得神經元電流得以穩定快速地傳導，理論上這些疾病就可以被治愈。研究發現，少突膠質前體細胞(oligodendrocyte progenitorcells, OPCs)是負責中樞神經系統髓鞘化的關鍵細胞，在中樞神經系統中，OPCs可以分化為少突膠質細胞(oligodendrocyte, 0L), OL進一步包繞神經元軸突形成完整的髓鞘結構，從而保證神經元電流的穩定快速傳導。髓鞘相關的疾病一方面是因為疾病破壞了已經形成的髓鞘結構；另一方面更是由于神經系統中OPCs受到了損傷，使得OL失去了源泉。少突膠質細胞減少，導致腦白質髓鞘化延遲或被破壞，從而使得神經電信號傳導異常或者軸突受損，導致神經功能損傷。
[0004]對脫髓鞘病變患者來說，由于內源性OPCs大量丟失，要促進腦中髓鞘的再生，植入外源成髓鞘細胞是一個有希望的治療方法。由于OPCs是中樞神經系統中成髓鞘細胞的天然來源，OPCs移植可能對治療脫髓鞘病變起到很好的療效。實驗發現，將嚙齒類動物的OPCs移植到新生的嚙齒類動物腦內，植入細胞能在宿主腦內廣泛遷移、增殖并分化為成熟0L，形成包繞軸突的髓鞘結構并恢復神經功能，表明外源植入OPCs能發揮與內源OPCs同樣的功能，OPCs移植可能是治療髓鞘損傷疾病的一個新的方向，這對脫髓鞘病變治療具有積極的意義。
[0005]盡管嚙齒類動物的OPCs很容易獲得，人源OPCs獲得卻相當困難。依賴于免疫表型，通過流式細胞術或是免疫磁珠技術從胎兒中樞神經系統組織或是成人腦白質組織中分選可以得到OPCs。Windrem等從胎兒或是成人腦組織中分離出了型的細胞，認為該細胞即為OPCs，將該細胞移植入先天脫髓鞘的小鼠內，可以形成髓鞘。然而由于人源的供體組織較少，分離得到的OPCs數量相當有限，且其存在倫理學問題，因此距離臨床應用還非常遙遠。另一種可以通過胚胎干細胞或是神經干細胞定向誘導分化獲得人源OPCs0美國的Hans等人研究發現，胚胎干細胞體外可以分化為OPCs，且OPCs移植有助于脊髓損傷的神經功能恢復，該方法在美國進入了臨床I期的治療研究。但胚胎干細胞的全能性是把雙刃劍，既能分化為各種細胞，也有致瘤的風險，因此該方法獲得的OPCs在臨床應用上還存在一定的致瘤風險。神經干細胞是一種成體干細胞，由于成體干細胞分化能力受到限制，在一定程度上避免了致瘤的風險，臨床應用上更為安全。但這兩種細胞的誘導過程都需要較長時間及多種細胞因子的共同作用，這必然導致培養的費用增加，限制細胞的產量。
[0006]因此，臨床的治療研究需要一種簡單獲得且經濟培養人源OPCs的方法。神經干細胞體外有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力，且約有16%的細胞表達A2B5+PSA-NCAM_表型，同時由于是成體干細胞又在一定程度上避免了致瘤的風險。神經干細胞還可以在體外大量擴增，可以說神經干細胞是很好的分選OPCs的來源。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是解決上述問題，提供一種獲得人源OPCs的新方法。為此， 申請人:經過深入研究，將神經干細胞(不論是低代數還是較高代數)作為分選來源，通過免疫磁珠的方法分離得到人源OPCs，并找到了適合OPCs體外培養和傳代的較經濟型的培養基，可以在短時間內獲得大量的高純度的人源OPCs，為臨床應用提供了新的選擇。
[0008]本發明提供的獲得人源OPCs的方法為，將神經干細胞作為分選來源，通過免疫磁珠的方法分離得到人源OPCs，采用的磁珠為Ant1-PSA-NCAM磁珠。
[0009]優選地，包括以下步驟:
[0010]①神經干細胞在胰蛋白酶溶液中被消化成單個細胞，過篩網；
[0011]②離心收集細胞，去上清；
[0012]③細胞重懸在磁珠分選緩沖液中，混勻后在2_8°C中溫育；
[0013]④加入Ant1-PSA-NCAM磁珠，混勻后在2_8°C中溫育；
[0014]⑤加入磁珠分選緩沖液，離心；
[0015]⑥離心過程中，將分選柱放入磁珠分離器中，加入磁珠分選緩沖液平衡分選柱；
[0016]⑦離心后，完全棄去上清液，重懸于磁珠分選緩沖液，將細胞懸液加入到分選柱內，收集流出液體，此為未標記的細胞；
[0017]⑧加入磁珠分選緩沖液洗分離柱，離心收集細胞；
[0018]⑨加入Ant1-A2B5磁珠，溫育，重復⑤_⑧步驟,此次收集細胞應為柱內集合上的細胞，緩沖液洗柱后，將分選柱從磁珠分離器內取出放置在離心管內；
[0019]⑩加入磁珠分選緩沖液后，立即推壓活塞洗脫掉結合上的細胞，離心，收集到的細胞為A2B5+PSA-NCAM_表型的亞細胞群，即為OPCs。
[0020]更優選地，各步驟的具體操作方法如下:
[0021 ] ①神經干細胞在0.025%胰蛋白酶溶液中被消化成單個細胞，過40 μπι尼龍篩網以濾除細胞團塊，臺酚藍計算細胞總數；以上“ ”是“g/100ml ”的慣常簡略表示方式，
0.025%即為 0.025g/100ml。
[0022]②取17細胞，300g離心10分鐘收集細胞，去上清；
[0023]③17細胞重懸在60 μ I的磁珠分選緩沖液中，混勻后在2_8°C中溫育10分鐘；
[0024]④加入20 μ I的Ant1-PSA-NCAM磁珠，混勻后在2_8°C中溫育15分鐘；
[0025]⑤加入1ml磁珠分選緩沖液，300g離心10分鐘；
[0026]⑥離心過程中，將MS分選柱放入磁珠分離器中，加入0.5ml的磁珠分選緩沖液平衡分選柱；
[0027]⑦離心后，完全棄去上清液，重懸于0.5ml的磁珠分選緩沖液，將細胞懸液加入到分選柱內，收集流出液體，此為未標記的細胞；
[0028]⑧加入0.5ml的磁珠分選緩沖液洗分離柱，共三次，離心收集細胞；
[0029]⑨加入20 μ I的Anti_A2B5磁珠，溫育，重復上面⑤_⑧的步驟,此次收集細胞應為柱內集合上的細胞，緩沖液洗柱三次后，將分選柱從磁珠分離器內取出放置在1.5ml的離心管內；
[0030]⑩加入1ml磁珠分選緩沖液后，立即推壓活塞洗脫掉結合上的細胞，300g離心10分鐘，收集到的細胞為a2b5+psa-ncam_表型的亞細胞群，即為OPCs。
[0031 ] 優選地，利用OPCs培養基對分離得到的人源OPCs進行體外擴增培養，所述培養基由 Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin 組成，Neurobasal A medium、B27和L-glutamin的體積比為97: 2: 1，bFGF的含量為20_40ng/ml，肝素的含量為5 μ g/ml ο
[0032]更優選地，體外擴增培養的具體操作方法為:磁珠分選后得到的細胞按照4X 14/cm2密度接種至培養器皿內，在OPCs培養基中培養，置于37°C、5% CO2培養箱內，每3_4天，更換2/3培養基為新鮮OPCs培養基，細胞達到80% -90%的融合度時，傳代培養，傳代培養的次數為2-4次。
[0033]優選地，所述神經干細胞采用神經干細胞培養基進行體外擴增而得，所述神經干細胞培養基由 DMED/F12、N2、bFGF、EGF、肝素和 L-glutamin 組成，DMED/F12、N2 和L-glutamin 的體積比為 98: I: 1，bFGF 的濃度為 10_30ng/ml，EGF 的濃度為 10_30ng/ml ο
[0034]更優選地，神經干細胞體外擴增的操作步驟如下:
[0035]①10g離心5分鐘收集神經干細胞；
[0036]②將上清轉移入離心管內，為舊培養基；
[0037]③向收集好的神經干細胞內加入1ml由0.01M dPBS稀釋得到的0.025%胰蛋白酶，混勻，置37°C培養箱孵育5-7min至細胞球松散；
[0038]④加入1.2mg/ml胰酶抑制劑100 μ 1，200 μ I移液器吸管輕輕吹打成單細胞懸液；
[0039]⑤加入15ml dPBS,細胞計數，10g離心5min ；
[0040]⑥棄上清，加入2/3新鮮神經干細胞培養基和1/3舊培養基，以2 X 106/mL密度接種于T25ml培養瓶，置細胞培養箱內培養；
[0041]⑦每3-4天更換2/3培養基為新鮮培養基，每10天傳代一次。
[0042]本發明提供的獲得人源OPCs的方法也包括利用OPCs培養基對其它方式獲得的人源OPCs進行體外擴增培養，所述培養基由Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和L-glutamin 組成，Neurobasal A medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2:1,bFGF的含量為20-40ng/ml,肝素的含量為5 μ g/ml。
[0043]優選地，其它方式獲得的人源OPCs體外擴增培養的具體操作方法為:人源OPCs按照4X 1Vcm2密度接種至培養器皿內，在OPCs培養基中培養，置于37°C、5% CO2培養箱內，每3-4天，更換2/3培養基為新鮮OPCS培養基，細胞達到80% -90%的融合度時，傳代培養，傳代培養的次數為2-4次。
[0044]OPCs培養基也是本發明的保護內容，其由Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin 組成，Neurobasal A medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2:1,bFGF的含量為20-40ng/ml，肝素的含量為5μ g/ml。
[0045]本發明提供的獲得人源OPCs的方法易于操作，可以在短時間內獲得大量的高純度的人源OPCs，為臨床應用提供了新的選擇。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0046]圖1顯示為流式分析分選得到的細胞純度到達85%以上。
[0047]圖2顯示為分選細胞表達了多種特異OPCs標志:A為分選三天后，細胞為典型的雙極或三極形態；B_D分別為免疫熒光染色表明分選細胞表達OPCs特異標志04、PDGF a R和SoxlO ；Ε為星形膠質細胞標志GFAP陽性細胞；F為神經元標志Tuj-1陽性細胞。比例尺:50 μ m (A-E)，100 μ m (F)。
[0048]圖3顯示為分選得到的OPCs可以體外至少培養四代:顯微鏡觀察第二代到第四代OPCs，均為典型的雙極或三極形態；免疫熒光染色表明各代數OPCs均高表達少突膠質前體細胞標志04。比例尺:50 μ m。
[0049]圖4顯示為分選得到的第四代OPCs免疫熒光染色結果:0PCs高表達少突前體細胞標志F1DGF a R和SoxlO、極低表達星形膠質細胞標志GFAP和神經元標志Tuj-1。比例尺:50 μ m(PDGFa R、SoxlO 和 GFAP)，100 μ m(Tuj-1)。
[0050]圖5顯示為第一代到第四代OPCs增殖曲線:經過四代的體外擴增，細胞增殖14倍以上。
[0051]圖6顯示為OPCs分化為少突細胞。A:顯微鏡下觀察分化后的細胞形態，細胞呈復雜多分枝結構:免疫熒光染色結果表明分化細胞可以表達多分枝的04 ；C:免疫熒光染色結果表明分化細胞表達Gale。比例尺:25 μ m。
【具體實施方式】
[0052]下面為本發明的具體的實施方式。
[0053]I從神經干細胞中分選獲得OPCs
[0054]1.1人神經干細胞體外擴增
[0055]①10g離心5分鐘收集神經干細胞；
[0056]②將上清轉移入離心管內，為舊培養基；
[0057]③向收集好的神經干細胞內加入1ml0.025%胰蛋白酶(0.01M dPBS稀釋)，混勻，置37°C培養箱孵育5-7min至細胞球松散；
[0058]④加入1.2mg/ml胰酶抑制劑100 μ 1，200 μ I移液器吸管輕輕吹打成單細胞懸液；
[0059]⑤加入15ml dPBS,細胞計數，10g離心5min ；
[0060]⑥棄上清，加入2/3新鮮神經干細胞培養基和1/3舊培養基，以2 X 1fVmL密度接種于T25ml培養瓶，置細胞培養箱內培養。
[0061]⑦每3-4天更換2/3培養基為新鮮培養基，每10天傳代一次。
[0062]神經干細胞培養基:
[0063]
【權利要求】
1.獲得人源OPCs的方法，其特征在于，將神經干細胞作為分選來源，通過免疫磁珠的方法分離得到人源OPCs，采用的磁珠為Ant1-PSA-NCAM和Anti_A2B5磁珠。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: ①神經干細胞在胰蛋白酶溶液中被消化成單個細胞，過篩網； ②離心收集細胞，去上清； ③細胞重懸在磁珠分選緩沖液中，混勻后在2-8°C中溫育； ④加入Ant1-PSA-NCAM磁珠，混勻后在2_8°C中溫育； ⑤加入磁珠分選緩沖液，離心； ⑥離心過程中，將分選柱放入磁珠分離器中，加入磁珠分選緩沖液平衡分選柱； ⑦離心后，完全棄去上清液，重懸于磁珠分選緩沖液，將細胞懸液加入到分選柱內，收集流出液體，此為未標記的細胞； ⑧加入磁珠分選緩沖液洗分離柱，離心收集細胞； ⑨加入Ant1-A2B5磁珠，溫育，重復⑤-⑧步驟，此次收集細胞應為柱內集合上的細胞，緩沖液洗柱后，將分 選柱從磁珠分離器內取出放置在離心管內； ⑩加入磁珠分選緩 沖液后，立即推壓活塞洗脫掉結合上的細胞，離心，收集到的細胞為A2B5+PSA-NCAM_表型的亞細胞群，即為OPCs。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，各步驟的具體操作方法如下: ①神經干細胞在0.025%胰蛋白酶溶液中被消化成單個細胞，過40 μ m尼龍篩網以濾除細胞團塊，臺酚藍計算細胞總數； ②取17細胞，300g離心10分鐘收集細胞，去上清； ③17細胞重懸在60μ I的磁珠分選緩沖液中，混勻后在2-8°C中溫育10分鐘； ④加入20μ I的Ant1-PSA-NCAM磁珠，混勻后在2_8°C中溫育15分鐘； ⑤加入1ml磁珠分選緩沖液，300g離心10分鐘； ⑥離心過程中，將分選柱放入磁珠分離器中，加入0.5ml的磁珠分選緩沖液平衡分選柱； ⑦離心后，完全棄去上清液，重懸于0.5ml的磁珠分選緩沖液，將細胞懸液加入到分選柱內，收集流出液體,此為未標記的細胞； ⑧加入0.5ml的磁珠分選緩沖液洗分離柱，共三次，離心收集細胞； ⑨加入20μ I的Ant1-A2B5磁珠，溫育，重復上面⑤-⑧的步驟,此次收集細胞應為柱內集合上的細胞，緩沖液洗柱三次后，將分選柱從磁珠分離器內取出放置在1.5ml的離心管內； ⑩加入1ml磁珠分選緩沖液后，立即推壓活塞洗脫掉結合上的細胞，300g離心10分鐘，收集到的細胞為A2B5+PSA-NCAM_表型的亞細胞群，即為OPCs。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用OPCs培養基對分離得到的人源OPCs進行體外擴增培養，所述培養基由Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和L-glutamin組成，Neurobasal A medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2:1, bFGF 的含量為20-40ng/ml,肝素的含量為5μg/ml。
5.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,體外擴增培養的具體操作方法為:磁珠分選后得到的細胞按照4 X 1Vcm2密度接種至培養器皿內，在OPCs培養基中培養，置于37°C、.5% CO2培養箱內，每3-4天，更換2/3培養基為新鮮OPCs培養基，細胞達到80% -90%的融合度時，傳代培養，傳代培養的次數為2-4次。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經干細胞采用神經干細胞培養基進行體外擴增而得，所述神經干細胞培養基由DMED/F12、N2、bFGF、EGF、肝素和L-glutamin組成，DMED/F12、N2 和 L-glutamin 的體積比為 98: I: l，bFGF 的濃度為 10_30ng/ml，EGF的濃度為10-30ng/ml。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，神經干細胞體外擴增的操作步驟如下: ①10g離心5分鐘收集神經干細胞； ②將上清轉移入離心管內，為舊培養基； ③向收集好的神經干細胞內加入1ml由0.01M dPBS稀釋得到的0.025%的胰蛋白酶，混勻，置37°C培養箱孵育5-7min至細胞球松散； ④加入1.2mg/ml胰酶抑制劑100 μ I, 200 μ I移液器吸管輕輕吹打成單細胞懸液； ⑤加入15mldPBS,細胞計數，10g離心5min ； ⑥棄上清，加入2/3新鮮神經干細胞培養基和1/3舊培養基，以2X 106/mL密度接種于T25ml培養瓶，置細胞培養箱內培養； ⑦每3-4天更換2/3培養基為新鮮培養基，每10天傳代一次。
8.獲得人源OPCs的方法，其特征在于，利用OPCs培養基對人源OPCs進行體外擴增培養，所述培養基由 Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin 組成，NeurobasalA medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2: 1，bFGF 的含量為 20_40ng/ml，肝素的含量為Sμg/ml。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，體外擴增培養的具體操作方法為:人源OPCs按照4X 104/cm2密度接種至培養器皿內，在OPCs培養基中培養，置于37°C、5% CO2培養箱內，每3-4天，更換2/3培養基為新鮮OPCS培養基，細胞達到80% -90%的融合度時，傳代培養，傳代培養的次數為2-4次。
10.0PCS 培養基，其特征在于，由 Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin組成，Neurobasal A medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2:1，bFGF 的含量為.20-40ng/ml,肝素的含量為5μg/ml。
【文檔編號】C12N5/0797GK104073468SQ201410336947
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月16日
【發明者】欒佐 申請人:欒佐