一種深層液態發酵生產烏靈參胞外多糖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種深層液態發酵生產烏靈參胞外多糖的方法。該方法是將活化好的烏靈參菌種通過接入到種子罐進行擴配，再將擴配好的液體種子接入到特制的產多糖的液態培養基中進行發酵，然后將發酵液進行分離，提取胞外多糖。本發明正是針對由小試放大到工業化生產中遇到的技術難題進行研究的，在小試和中試繼續優化發酵培養基(尤其是碳源)、提升生物量和胞外多糖的基礎上，解決了放大過程中遇到的發酵過程參數控制、提取設備選型、優化等難題，最終成功嫁接到10-20t發酵罐進行產業化生產，并順利生產出高品質的烏靈參胞外多糖，真正實現了連續、自動化、產業化的生產。
【專利說明】一種深層液態發酵生產烏靈參胞外多糖的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物【技術領域】，具體涉及一種深層液態發酵生產烏靈參胞外多糖的 方法。
【背景技術】
[0002] 烏靈參屬子囊菌綱、炭角菌科的黑柄炭角菌，是一傳統的藥用真菌，學名黑柄炭角 菌，別名烏靈參、雞縱（叢）蛋，又名震雷子，生長在地下深處黑翅土棲白蟻廢棄的蟻巢上， 被世界藥用真菌研究、應用領域均視為珍稀、名貴藥材，具有廣泛的藥用價值。
[0003] 烏靈參生長在向陽溫暖的山丘坡地或河堤土坡的白蟻廢棄菌圃上，是由菌圃上密 布的黑柄炭角菌菌絲，在其生長后期，部分密集而成的菌核，俗稱"烏靈參"，重約5 - 30克， 球形、類球形或不規則扁平條塊狀，直徑2 -12厘米，外表棕褐色或黑色，光滑或多皺，一端 有菌索（假根）或有臍狀凹陷，內部白色、肉質，堅硬或綿軟，味甘香。菌核上端有柄懸著于 菌圃上壁并與菌索相連。翌年6月至10月，當菌圃周圍土溫在20以上時（此時正值雷雨 和秋雨季節），菌核萌發菌絲，在地表形成棒狀子座，俗稱"地炭棍"，在地表呈散生或群生。 野生烏靈參主要產于四川、云南、廣東等地，浙江、江西、江蘇也有生長，烏靈參產地以四川 的灌縣、綦扛等地為上品。由于烏靈參生長于地下2米一 20米的土棲白蟻廢棄的蟻巢上， 采掘非常困難，故自然資源極為稀少。烏靈參既是藥用真菌又是食用菌，有較高營養和藥用 價值，是較理想的保健食（藥）品。
[0004] 烏靈參，性溫、味甘，具有補氣固腎、健脾除濕、鎮靜安神之功效，主治脾虛少食、產 后及術后失血過多、產后乳少、胃下垂、疝氣、心悸失眠、小兒驚風及跌打損傷等。實驗研究 表明，烏靈參的主要功效成分為多糖，其粗多糖不僅具有提高機體免疫功能和抗衰老作用， 而且經中國醫科院藥物研究所對小鼠斷頭缺血喘息時間延長影響測試表明，烏靈參粗多糖 有明顯的腦保護作用，并對電休克引起的記憶障礙也有保護作用。中國協和醫科大學基礎 所試驗表明，烏靈參粗多糖可明顯抑制小鼠腦內單胺氧化酶活性，從而提高中樞神經遞質 功能。
[0005] 由于烏靈參生長于地下2米一 20米的土棲白蟻廢棄的蟻巢上，采掘非常困難，故 自然資源極為稀少。目前國內只有少數院校展開深層液態發酵生產烏靈參的研究，并且絕 大部分都局限于小試水平，都是以獲得烏靈參的菌絲體為主要目標展開研究的，而目前國 內關于液態發酵生產烏靈參的功效成分多糖幾乎沒有相關報道，更沒有研究解決如何從小 試嫁接放大到產業化生產中遇到的培養基配方選取、發酵操作參數控制、多糖提取條件的 研究等技術難題，因此目前國內還沒有真正產業化液態發酵生產烏靈參多糖的廠家。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是為了解決工業化規模生產烏靈參多糖的技術瓶頸，采用此發明能 夠連續、自動化、產業化的生產出高品質的烏靈參多糖。
[0007] 為了實現上述目的，本發明主要按照下述步驟進行：
[0008] 本發明的產業化深層液態發酵生產烏靈參胞外多糖的方法包括下述步驟：
[0009] -種制備烏靈參發酵液的方法，包括下述步驟：將烏靈參種子培養液接入滅菌后 的液體發酵培養基進行深層液態發酵得到烏靈參發酵液，所述的深層液態發酵的接種量 為10?20%，通風比為1 :0· 3-L Ovvm，罐壓0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下培養3?5 天，；所述的液體發酵培養基配方為：葡萄糖1-3%、淀粉1-3%、蛋白胨0.1-0. 5% (v/v)、 黃豆餅粉1-3%、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%、七水硫酸鎂0. 1-0. 5%、硫酸鋅0. 1-0. 5%、消泡劑 0· 01-0. 05%、20000u/ml 的耐高溫 α -淀粉酶 〇· 001-0. 007% (v/v)，調節 pH 值 5. 0-6. 5。 以上培養基組成中除耐高溫α -淀粉酶外的" ％ "均代表g/l〇〇ml。
[0010] 所述的消泡劑可以為植物油（豆油、菜籽油）類、有機醚類等物質。
[0011] 所述的烏靈參種子培養液通過二級培養獲得，具體方法如下：
[0012] 1) 一級種子培養：將經活化搖瓶菌種接入滅菌后的液體種子培養基，接種量為 0· 1 ?2% (v/v)，通風比為 1 :0· 3 -0· 7vvm，罐壓 0· 02 ?0· 05Mpa，在 22 ?30°C下培養 3 ? 5天，得到烏靈參一級種子培養液，備用；
[0013] 2)二級種子培養：將步驟1)所得的一級種子培養液接入滅菌后的液體種子培養 基，接種量為10?20% (v/v)，通風比為1 :0.3 - LOvvm，罐壓0.02?0.05Mpa，在22? 30°C下培養2?4天，得到烏靈參二級種子培養液；
[0014] 其中所述的液體種子培養基培養基為：葡萄糖2-4%、蛋白胨0. 1-0. 5%、黃豆 餅粉1-3 %、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5 %、七水硫酸鎂0. 1-0. 5 %、硫酸鋅0. 1-0. 5 %、消泡劑 0. 01-0. 05%，調節pH值5. 0-6. 5。一級種子罐的容積為100-500L，二級種子罐的容積為 1000-5000L，裝填量為70-90% (v/v)。以上培養基組成中的"％"均代表g/100ml。
[0015] 所述的深層液態發酵的發酵罐容積為10000-20000L，裝填量為70-90% (v/v)。
[0016] 所述的深層液態發酵的終點判斷標準：發酵液呈特殊香味、菌球大量增加，濾液渾 濁；還原糖降至最低并略有波動，還原糖控制在0.5% (g/100g)以下；鏡檢菌絲細碎，無雜 菌污染。
[0017] 一種烏靈參胞外多糖的提取方法，包括下述步驟：
[0018] 1)分離：將上述所得的烏靈參發酵液分離，得到烏靈參濾液；
[0019] 2)濃縮：將步驟1)所得的濾液進行采用二級低溫濃縮，得到濃縮比重為1. 25? 1.40(50°C熱測）的濃縮漿；
[0020] 3)醇沉、烘干：加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒 精度約65-80% (v/v)，靜置8-16h，將沉淀物進行真空烘干，溫度50-75°C，真空度不低于 0· 085MPa ;烘干至干燥物水分含量為3?8% (g/100g)，即得胞外糖。
[0021] 其中，步驟1)所述的分離采用臥螺離心機進行，轉速控制在2500 - 3500r/min。
[0022] 步驟2)所述的二級低溫濃縮為：一級采用1 - 3t雙效蒸發器濃縮，將發酵液 濃縮到比重為1. 15 - 1. 20(50°C熱測），二級采用1 - 3t單效濃縮器濃縮，即將比重為 1. 1 - 1. 20 (50°C熱測）的濃縮液繼續濃縮到比重為1. 25?1. 40 (50°C熱測）的濃縮漿；濃 縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0. 085MPa。
[0023] 本發明中醇沉是采用1 _3t醇沉罐，醇沉次數越多，胞外糖的含量越高。真空烘干 采用的真空干燥箱，本發明提取的胞外糖含量在20 - 50%。
[0024] 本發明具有以下幾個突出的優點：
[0025] 本發明正是針對由小試放大到工業化生產中遇到的技術難題進行研究的，在小試 和中試繼續優化發酵培養基（尤其是碳源）、提升生物量和胞外多糖的基礎上，解決了放大 過程中遇到的發酵過程參數控制、提取設備選型、優化等難題，最終成功嫁接到10 - 20t發 酵罐進行產業化生產，并順利生產出高品質的烏靈參胞外多糖，真正實現了連續、自動化、 產業化的生產。
[0026] 為了提高目的產物胞外多糖的產量，本發明在發酵培養基的碳源進行了優化和組 合：采用短效葡萄糖和長效淀粉的復合組方。發酵前期以生長菌絲體，提高生物含量為主， 因此培養基中添加了菌體優先選用的葡萄糖碳源，迅速增殖；發酵后期要提高目的產物的 含量，因此碳源提供菌體相對利用較慢的淀粉，并在培養基中添加適量淀粉酶，控制菌體數 量在合適規模，并不斷產生代謝物胞外糖。
[0027] 為工業化規模生產提供切實可行的技術方案，解決了由小試放大到工業化生產中 遇到的技術難題。
[0028] 為了提供胞外糖的產量，本發明優化發酵培養基的配方，針對碳源部分采用了復 合組方，既保證了前期菌體的生物量，又保證后期代謝產物的產量；
[0029] 采用本發明可根據市場需求和產品標準，制得不同含量的高品質的多糖，多糖含 量可在20 - 50%。
【具體實施方式】
[0030] 以下通過具體實施例進一步說明本發明。但實施例的具體細節僅用于解釋本發 明，不應理解為對本發明總的技術方案的限定。
[0031] 以下實施例使用的烏靈參菌購買于中科院微生物研究所普通微生物中心，菌種編 碼CGMCC N0. 1038,以此株菌為例，詳細說明本發明的具體方案。但是本發明方法通用于所 有的烏靈參菌，并不僅限于該菌株。
[0032] 實施例1
[0033] 本發明產業化深層液態發酵生產烏靈參胞外多糖的方法按下述步驟進行：
[0034] 1、烏靈參發酵液的制備：將活化好的烏靈參搖瓶菌株按接種量1 %接種于種子 培養基（300L)，其中種子培養基組成為葡萄糖2 %、蛋白胨0. 2 %、黃豆餅粉1 %、磷酸二 氫鉀0. 3 %、七水硫酸鎂0. 15 %、硫酸鋅0. 10 %、豆油0. 02%，調節pH值5. 5,通風比為 1 :0. 3vvm，罐壓0. 03Mpa，26?28°C振蕩培養4天即得烏靈參一級種子液；將一級種子液 按接種量15%接入二級種子培養基（3000L)，其中二級種子培養基組成為葡萄糖2%、蛋 白胨0.2 %、黃豆餅粉1 %、磷酸二氫鉀0.3 %、七水硫酸鎂0. 15 %、硫酸鋅0. 10 %、消泡 劑0. 02%，調節pH值5. 5,通風比為1 :0. 3vvm，罐壓0. 03Mpa，26?28°C培養3天即得烏 靈參二級種子液；將二級種子液按接種量18%接入發酵培養基（7500L)，其中發酵培養基 組成為葡萄糖2 %、淀粉2 %、蛋白胨0. 3 %、黃豆餅粉1. 5 %、磷酸二氫鉀0. 2 %、七水硫酸 鎂0.2%、硫酸鋅0. 10%、豆油0.03%、耐高溫α -淀粉酶（棗莊杰諾酶生物有限公司， 20000u/ml) 0· 002 % (ν/ν)，調節 pH 值 5. 5 ;通風比為 1 :0· 5vvm，罐壓 0· 03Mpa，26 ?28°C培 養4天，發酵至發酵液有特殊香味、菌球大量增加，濾液渾濁；還原糖降至最低0. 3%并略有 波動；鏡檢菌絲細碎，無雜菌污染，即得烏靈參發酵液8850Kg。
[0035] 2、烏靈參發酵液分離：將上述烏靈參發酵液8850Kg通過臥螺離心機進行分離，轉 速控制在3000r/min，分離時間在2h，得到烏靈參濾液8000Kg和660Kg的濕菌絲體（含水 量為80% )，濕菌絲體可直接低溫干燥粉碎制得發酵烏靈參菌粉。
[0036] 4、二級低溫濃縮：將上一步所得的烏靈參濾液8000Kg真空轉移至3t雙效蒸發器， 在真空度為-0. 〇85MPa，濃縮溫度為65°C條件下濃縮至比重為1. 20(50°C熱測）濃縮液，再 將濃縮液真空轉移至1. 5t單效球型濃縮器，在真空度為0. 09MPa，濃縮溫度為60°C條件下 繼續濃縮至比重為1. 30 (50°C熱測）的濃縮漿280kg。
[0037] 5、醇沉、烘干：向盛有280kg濃縮漿的醇沉罐中加入重量1000kg的95%酒精，用 酒精計檢測混合液酒精度72 % (v/v)，靜置12h，將底部沉淀物分離用真空干燥箱進行烘 干，溫度60°C，真空度0. 09MPa ;烘干15h得胞外糖100kg。檢測水分含量為3. 5%，多糖含 量為33%。
[0038] 實施例2
[0039] 1、烏靈參發酵液的制備：將活化好的烏靈參搖瓶菌株按接種量1. 5%接種于種 子培養基（300L)，其中種子培養基組成為葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母粉1 %、磷酸二 氫鉀0. 3%、七水硫酸鎂0. 15%、硫酸鋅0. 10%、菜籽油0. 02%，調節pH值5. 5,通風比為 1 :0. 3vvm，罐壓0. 03Mpa，26?28°C振蕩培養3天即得烏靈參一級種子液；將一級種子液 按接種量15%接入二級種子培養基（3000L)，其中二級種子培養基組成為葡萄糖2%、蛋 白胨0. 2%、黃豆餅粉1%、磷酸二氫鉀0. 3%、七水硫酸鎂0. 15%、硫酸鋅0. 10%、消泡劑 0. 02%，調節pH值5. 5,通風比為1 :0. 3vvm，罐壓0. 03Mpa，26?28°C培養3天即得烏靈 參二級種子液；將二級種子液按接種量18%接入發酵培養基（15000L)，其中發酵培養基組 成為葡萄糖1. 8 %、淀粉2. 2 %、蛋白胨0. 3 %、黃豆餅粉2 %、磷酸二氫鉀0. 2 %、七水硫酸 鎂0.2%、硫酸鋅0. 10%、菜籽油0.03%、耐高溫α -淀粉酶（棗莊杰諾酶生物有限公司， 20000u/ml)0. 002% (ν/ν)，調節 pH值 5. 8 ;通風比為 1 :0· 3vvm，罐壓 0· 04Mpa，26 ?28°C培 養4天，發酵至發酵液香有特殊香味、菌球大量增加，濾液渾濁；還原糖降至最低0. 4%并略 有波動；鏡檢菌絲細碎，無雜菌污染，既得烏靈參發酵液17700Kg。
[0040] 2、烏靈參發酵液的分離：將上述烏靈參發酵液17700Kg通過臥螺離心機進行分 離，得到烏靈參濾液16250Kg和1180Kg的濕菌絲體（含水量為77% )，濕菌絲體可直接低 溫干燥粉碎制得發酵烏靈參菌粉。具體工藝條件是：轉速控制在3200r/min，分離時間在 4. 5h〇
[0041] 4、二級低溫濃縮：將上一步所得的烏靈參濾液16250Kg真空轉移至3t雙效蒸發 器，在真空度為-0. 〇9MPa，濃縮溫度為63°C條件下濃縮至比重為1. 18(50°C熱測）濃縮液， 再將濃縮液真空轉移至1. 5t單效球型濃縮器，在真空度為0. 09MPa，濃縮溫度為65°C條件 下濃縮至比重為1. 35 (50°C熱測）的濃縮漿500kg。
[0042] 5、醇沉、烘干：向盛有500kg濃縮漿的醇沉罐中加入重量2200kg的95%酒精，用 酒精計檢測混合液酒精度70 % (v/v)，靜置10h，將底部沉淀物分離用真空干燥箱進行烘 干，溫度65°C，真空度0. 09MPa ;烘干18h得胞外糖210kg。檢測水分含量為4. 5%，多糖含 量為30%。
[0043] 實施例3
[0044] 為更好驗證本發明中短效葡萄糖和長效淀粉的復合組方在產業化生產烏靈參多 糖的優越性，又做了幾個對比試驗。試驗中只調整了液體發酵培養基中碳源葡萄糖或（和）
【權利要求】
1. 一種制備烏靈參發酵液的方法，其特征在于該方法包括下述步驟：將烏靈參種子培 養液接入滅菌后的液體發酵培養基進行深層液態發酵得到烏靈參發酵液，所述的深層液 態發酵的接種量為10?20% (v/v)，通風比為1 :0. 3-1.0vvm，罐壓0. 02?0. 05Mpa，在 22?30°C下培養3?5天，；所述的液體發酵培養基配方為：葡萄糖1-3%、淀粉1-3%、蛋 白胨0. 1-0. 5%、黃豆餅粉1-3%、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%、七水硫酸鎂0. 1-0. 5%、硫酸鋅 0· 1-0. 5%、消泡劑 0· 01-0. 05%、20000u/ml 的耐高溫 α -淀粉酶 〇· 001-0. 007% (v/v)，調 節 pH 值 5. 0-6. 5。
2. 根據權利要求1所述的制備烏靈參發酵液的方法，其特征在于所述的烏靈參種子培 養液通過二級培養獲得，具體方法如下： 1) 一級種子培養：將經活化搖瓶菌種接入滅菌后的液體種子培養基，接種量為〇. 1? 3% (v/v)，通風比為1 :0· 3 -0· 7vvm，罐壓0· 02?0· 05Mpa，在20?30°C下培養3?5天， 得到烏靈參一級種子培養液； 2) 二級種子培養：將步驟1)所得的一級種子培養液接入滅菌后的液體種子培養基，接 種量為10?20% (v/v)，通風比為1 :0· 3 -1. Ovvm，罐壓0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下 培養2?4天，得到烏靈參二級種子培養液。
3. 根據權利要求2所述的制備烏靈參發酵液的方法，其特征在于所述的液體種子培養 基為：葡萄糖2-4%、蛋白胨0. 1-0. 5%、黃豆餅粉1-3%、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%、七水硫酸 鎂 0· 1-0. 5%、硫酸鋅 0· 1-0. 5%、消泡劑 0· 01-0. 05%，調節 pH 值 5. 0-6. 5。
4. 根據權利要求1所述的一種制備烏靈參發酵液方法，其特征在于所述深層液態發酵 的終點為：發酵液特殊香味、菌球大量增加，濾液渾濁；還原糖降至最低并略有波動，還原 糖要求在0.5% (g/100g)以下；鏡檢菌絲細碎，無雜菌污染。
5. -種烏靈參胞外多糖的提取方法，其特征在于該方法包括下述步驟： 1) 分離：將權利要求1所得的烏靈參發酵液經分離，得到烏靈參上清液； 2) 濃縮：將步驟1)所得的濾液進行采用二級低溫濃縮，得到濃縮比重為1. 25?1. 40 的濃縮漿； 3) 醇沉、烘干：加入濃縮漿重量3-5倍量的95 %酒精，用酒精計檢測混合液酒精 度為65-80 % (v/v)，靜置8-16h，將沉淀物進行真空烘干，溫度50-75°C，真空度不低于 0· 085MPa ;烘干至干燥物水分含量為3?8% (g/100g)，即得胞外糖。
6. 根據權利要求5所述的烏靈參胞外多糖的提取方法，其特征是步驟1)中所述的分離 采用臥螺離心機進行，轉速控制在2500 - 3500r/min。
7. 根據權利要求5所述的烏靈參胞外多糖的提取方法，其特征是步驟2)中所述的二 級低溫濃縮為：一級采用雙效蒸發器濃縮，將發酵液濃縮到比重為1. 15 -1. 20,二級采用單 效濃縮器濃縮，即將比重為1. 1 -1. 20的濃縮液繼續濃縮到比重為1. 25?1. 40的濃縮漿； 濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0. 085MPa。
【文檔編號】C12P19/04GK104099384SQ201410336263
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】王文風, 龔勁松, 徐國華, 王英燕, 張芙蓉, 楊亞威, 高巖 申請人:江蘇神華藥業有限公司