豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）分別將豬帶絳蟲重組質粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18與B.longum感受態細菌混勻，冰浴后轉移至電擊杯中，電擊完畢后立即將混合液轉入到MRS液體培養基的EP管中厭氧培養；將菌液涂布于含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，厭氧培養；（2）挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS液體培養基的EP管中，厭氧培養；將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴；抽提質粒為模板，進行PCR鑒定；（3）陽性菌株傳代培養的穩定性或陽性菌株不同保存條件的穩定性：取上述鑒定的陽性菌株在MRS培養基中傳代，每次傳代抽提質粒為模板，進行PCR鑒定；或將上述鑒定的陽性菌株分別放置不同溫度不同時間后，取出保存的菌液，抽提質粒，進行電泳鑒定。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗人工傳代后和不同保存條件下的穩定性。 豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法
【背景技術】
[0002] 豬囊尾蝴病是由豬帶絳蟲（faeflia 的中絳期幼蟲豬囊尾蝴寄生于人或 豬等引起的一種嚴重危害人類健康和畜牧業生產的人獸共患寄生蟲病。我國是高發國家之 一，豬囊尾蚴可寄生于人體皮下、肌肉、腦、眼等不同部位，其中腦囊蟲病致殘率、致死率均 較高。該病防治存在化學藥物的殘留和抗藥性問題，隨著分子生物學技術的發展，研制疫苗 防治該病已成為當前研究的熱點。
[0003] TS045W-4B和TS0L18是豬帶絳蟲六鉤蚴階段特異性表達抗原，具有良好的免疫原 性和免疫保護性，是理想的豬帶絳蟲疫苗候選抗原。重組活載體疫苗是指將編碼外源性抗 原的基因引入特定的疫苗載體，構建成能表達相應抗原而且傳遞至宿主免疫系統引起相應 免疫應答的疫苗。雙歧桿菌⑵Wo知cteri?，Bb)是人和哺乳動物腸道重要的益生菌，具 有抗菌、抑瘤、免疫調節和營養等多種生理作用。近年來，隨著基因工程技術的發展，選擇具 有益生功能的Bb作為載體傳遞系統，已在細菌、病毒、寄生蟲、腫瘤等領域構建了一系列重 組雙歧桿菌。
[0004] 然而，疫苗的穩定性是考核疫苗質量的關鍵，直接關系到疫苗的質量及生產成本， 其研究目的是為證明疫苗產品在某種保存條件下，保存某一段時間后仍然具備可接受的質 量、有效性和安全性提供科學依據。同時，傳代培養后Bb所攜帶的外源重組質粒穩定存 在有助于在體內表達足夠的抗原蛋白，經抗原提呈后產生免疫應答。而在豬帶絳蟲重組 雙歧桿菌疫苗穩定性研究方面，尚未見相關報道，因此，本研究擬分別使用豬帶絳蟲重組 質粒 PGEX-TS045W-4B、pGEX-TS0L18 和 pGEX-TS045W-4B-TS0L18 電穿孔轉化長雙歧桿菌 獲得陽性菌株，進一步研究其人工傳代后和不同保存條件下的穩定性，為豬囊 尾蚴病疫苗的研發奠定基礎。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是：分別使用重組質粒pGEX-TS045W-4B、pGEX-TS0L18 和PGEX-TS045W-4B-TS0L18轉化長雙歧桿菌（5. 腫），將獲得的陽性菌株傳代培養，抽 提質粒，使用PCR擴增TS045W-4B\TS0L18\TS045W-4B-TS0L18片段，檢測其轉化后目的基因 質粒的穩定性。同時，將獲得的陽性菌株分別分別放置不同溫度不同時間后，取出保存的菌 液，抽提質粒，電泳鑒定，檢測菌株質粒是否丟失，從而判斷其穩定性。
[0006] 本發明的技術方案是：豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法，包括以下 步驟： (1)重組質粒電轉化漢濟/? :分別將豬帶絳蟲重組質粒pGEX-TS045W-4B、 PGEX-TS0L18和pGEX-TS045W-4B-TS0L18與漢腫感受態細菌混勻，冰浴后轉移至電擊 杯中，電擊完畢后立即將混合液轉入到MRS液體培養基的EP管中厭氧培養；將菌液涂布于 含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，厭氧培養； (2) 陽性菌株的PCR鑒定：挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS液體培養 基的EP管中，厭氧培養；將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴；抽 提質粒為1?板，進行PCR鑒定； (3) 陽性菌株傳代培養的穩定性或陽性菌株不同保存條件的穩定性：取上述鑒定的陽 性菌株在MRS培養基中傳代，每次傳代抽提質粒為模板，進行PCR鑒定；或將上述鑒定的陽 性菌株分別放置不同溫度不同時間后，取出保存的菌液，抽提質粒，進行電泳鑒定。
[0007] 所述的電擊參數設置為：電壓1.25KV、場強12. 5 KV/cm、電容25yF、電阻200Ω、 轉化時間5ms。
[0008] pGEX-TS045W-4B、pGEX-TS0L18 和 pGEX-TS045W-4B-TS0L18 分別能在宿主菌 漢中穩定遺傳7代、6代和9代。
[0009] 陽性菌株 pGEX-TS045W-4B/沒 pGEX-TS0L18/沒 和 PGEX-TS045W-4B-TS0L18/漢在-20°C、_80°C、液氮中保存穩定，保存期限2個月。
[0010] 本發明達到的有益效果： (1)分別將豬帶絳蟲重組質粒pGEX-TS045W-4B、pGEX-TS0L18和 PGEX-TS045W-4B-TS0L18 電穿孔轉化漢 ?腫，獲得陽性菌株 pGEX-TS045W-4B/漢 ?腫、 PGEX-TS0L18/漢 ?應和 pGEX-TS045W-4B-TS0L18/漢 ?應，分別經人工傳代 10 次，抽 提質粒，PCR鑒定，對菌株進行遺傳穩定性試驗。結果表明，陽性菌株pGEX-TS045W-4B/ 漢 ?應、pGEX-TS0L18/漢 ?應和 pGEX-TS045W-4B-TS0L18/漢 ?應在體外傳代 10 次，分別從第8代、第7代和第10代開始出現質粒丟失現象，表明重組質粒分別能在宿主菌 中穩定遺傳7代、6代和9代，在體外具有不同程度的遺傳穩定性。
[0011] (2)分別將豬帶絳蟲重組質粒PGEX-TS045W-4B、PGEX-TS0L18和 PGEX-TS045W-4B-TS0L18 電穿孔轉化漢 ?腫，獲得陽性菌株 pGEX-TS045W-4B/漢 ?腫、 PGEX-TS0L18/漢應和pGEX-TS045W-4B-TS0L18 /漢應，分別放置不同溫度不同 時間后，取出保存的菌液，抽提質粒，電泳鑒定，對菌株穩定性進行試驗研究。結果表明，陽 性菌株 PGEX-TS045W-4B/漢 ?應、pGEX-TS0L18/漢 ?應和 pGEX-TS045W-4B-TS0L18/ 漢/〇取應在常溫下、4°C、_20°C、_80°C、_196°C (液氮中）保存48小時、1周、1月、2月，菌 株穩定性不一致，在液氮中、_80°C、_20°C中比較穩定，保存2個月也未發現質粒丟失，而在 普通的室溫環境下，在保存1個月后就開始出現質粒丟失現象，表明本研究構建的豬帶絳 蟲重組Bb疫苗低溫保存能較好保留其遺傳穩定性。
【具體實施方式】
[0012] 本發明的豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法，包括以下步驟： (1 )重組質粒電轉化長雙歧桿菌（漢7(9/7^?):分別將豬帶絳蟲重組質粒 PGEX-TS045W-4B、pGEX-TS0L18 和 pGEX-TS045W-4B-TS0L181 μ g 與漢 ?應感受態細菌 100 μ 1混勻，冰浴10?15min后轉移至至1mm的電擊杯中，電擊參數設置為：電壓1. 25KV、 場強12. 5 KV/cm、電容25 μ F、電阻200 Ω、轉化時間5ms ;電擊完畢后立即將混合液轉入到 900 μ 1MRS液體培養基的EP管中，37°C厭氧培養2h ;將菌液涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉 素的MRS瓊脂平板上，37 °C厭氧培養24?72h ;
【權利要求】
1. 豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 重組質粒電轉化長雙歧桿菌：分別將豬帶絳蟲重組質粒PGEX-TS045W-4B、 PGEX-TS0L18和pGEX-TS045W-4B-TS0L18與漢腫感受態細菌混勻，冰浴后轉移至電擊 杯中，電擊完畢后立即將混合液轉入到MRS液體培養基的EP管中厭氧培養；將菌液涂布于 含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，厭氧培養； (2) 陽性菌株的PCR鑒定：挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS液體培養 基的EP管中，厭氧培養；將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴；抽 提質粒為1?板，進行PCR鑒定； (3) 陽性菌株傳代培養的穩定性或陽性菌株不同保存條件的穩定性：取上述鑒定的陽 性菌株在MRS培養基中傳代，每次傳代抽提質粒為模板，進行PCR鑒定；或將上述鑒定的陽 性菌株分別放置不同溫度不同時間后，取出保存的菌液，抽提質粒，進行電泳鑒定。
2. 根據權利要求1所述的一種豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法，其特征 在于：所述的電擊參數設置為：電壓1.25KV、場強12. 5 KV/cm、電容25yF、電阻200Ω、轉化 時間5ms。
3. 根據權利要求1所述的一種豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法，其 特征在于：PGEX-TS045W-4B、pGEX-TSOL 18 和 pGEX-TS045W-4B-TS0L 18 分別能在宿主菌 B. longum中穩定遺傳7代、6代和9代。
4. 根據權利要求1所述的一種豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方 法，其特征在于：陽性菌株pGEX-TS045W-4B/漢/o/?·腫、pGEX-TS0L18/漢/o/?·腫和 PGEX-TS045W-4B-TS0L18/漢在-20°C、_80°C、液氮中保存穩定，保存期限2個月。
【文檔編號】C12N15/74GK104099364SQ201410334944
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】周必英 申請人:遵義醫學院