一種過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體及應用。包括篩選標記基因表達盒及目的基因表達盒；所述的篩選標記基因表達盒包括抗性篩選基因，在抗性篩選基因的上游融合了大腸桿菌P1啟動子，抗性篩選基因的下游融合了大腸桿菌ccdB終止子；所述的目的基因表達盒包括三角褐指藻fcpC基因啟動子、6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因、三角褐指藻fcpA基因終止子及一個Omega?leader序列，所述的Omega?leader序列在三角褐指藻fcpC基因啟動子的下游。本發明的重組載體比較小，適合轉化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表達。通過過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因能夠顯著地提高微藻細胞內的脂質含量，為生物能源的研究奠定了基礎。
【專利說明】一種過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體及應用
【技術領域】
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[0001]本發明屬于微藻基因工程領域，具體涉及一種過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體及應用。
【背景技術】
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[0002]傳統能源的不可再生性決定了其日益枯竭的趨勢，且造成環境問題日益嚴重。能源危機和環境污染的日益嚴峻激起了人們的能源憂患意識及污染物零排放觀念，加強了對廢油脂及工業下腳料的回收處理及科學利用，推動清潔新型能源的開發利用。尋求一種安全可靠的、清潔的可再生能源已成為當今世界共同關注的焦點。生物能源是指利用生物可再生原料及太陽能生產的能源，包括生物質能生物液體燃料及利用生物質生產的能源如燃料酒精、生物柴油、生物質氣化及液化燃料、生物制氫等(譚天偉，等，2003)。其中，生物柴油是采用來自動物或植物脂肪酸單酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯及脂肪酸丙酯等與甲醇(或乙醇)經酯交換反應而得到的長鏈脂肪酸甲(乙)酯，是一種可以替代普通石油柴油的可再生的清潔燃料，相較于其它種類的生物能源，生物柴油具有原料廣泛、生產高效、環境友好、凈化環境等突出特點(譚天偉，等，2002)。
[0003]Chisti通過建立數學模型和工程計算指出微藻生物能源是唯一可以取代石化油的生物柴油(Chisti，et al.,2007 ；Chisti, et al.，2008)。因具有清潔、高效、環保、產油量大等優點，微藻生物能源被視為最具有發展潛力的生物柴油的資源(Metting，etal., 1996 ；Spolaore, et al.，2006 ；ffeers, et al.，1977 ；Hu et al., 2008)。娃藻是海洋浮游生物最重要的組成成分，在提供海洋初級生產力方面發揮著重要的作用。它們是研究發現新穎的在其他經常研究的生物體中不存在的代謝路徑的主要研究對象，因為在它們進化過程中形成一系列新穎的代謝路徑(Armbrust, et al.，2004)。由于三角褐指藻具有生長周期短、生長快、脂質含量高等優點，成為最具潛力的產油微藻(Yang, et al.，2013 ；Niu, etal.，2012)。因此，通過遺傳學改造提高三角褐指藻的脂質含量與生物量是提高工業化生產產量的重要途徑。
[0004]海洋硅藻三角褐指藻，一種廣泛使用的餌料藻，其快速增長和高脂肪含量已成為有吸引力和有前途的，作為生物柴油的新來源，它的基因組在2008年已被測序(http://genome, jg1-psf.0rg/Phatr2/Phatr2.home, html),使得它也成為研究功能基因組學一個模型微藻。
[0005]載體兀件是決定微藻表達系統中DNA表達穩定性的關鍵部件之一。隨著基因組測序技術的快速進步，基因測通技術和序列信息注釋已被開發用于傳輸序列功能性信息的渠道。通常，研究基因的功能可以使用各種的方法，如異位表達，基因沉默，蛋白質亞細胞定位，啟動子活性分析，結構一功能分析，并在體內或體外用生物化學測定基因表達模式分析。然而，對基于限制性內切酶/連接酶克隆方法工程表達構建體的常規方法是非常費力和耗時的，并且經常受到限制性酶切位點的阻礙。在模型藻萊茵衣藻和三角褐指藻甚至大多數高等植物中載體構建是功能基因分析的主要障礙，因此，迫切需要創新和有效的技術手段克服以上困難。最近的通路克隆系統用兩步驟的位點特異性重組快速大規模克隆研究一個或者多個基因進入載體(G andj, 2004)。需連入載體的DNA片段，首先克隆到一個普通供體載體。然后，由兩個位點特異性重組位點(attBl和attB2位)中的供體質粒側翼的DNA片段可以被精確地轉印到各種表達載體中，通過位點特異性重組反應。一旦DNA產物被靶向到供體載體中，無需傳統的限制性內切酶和連接酶克隆的簡單反應。將重組克隆系統，DNA的轉移構建體整合到表達目的載體所介導Gateway技術，和許多開放閱讀框條目(供體)的克隆的集合和表達質粒已被廣泛用于功能基因組學中的許多生物創建(Aliverti etal.，2008)。然而，在這種方式中使用的酶的成本相對昂貴，特別是相關技術幾乎沒有在硅藻三角褐指藻中報道，并且轉化效率不高，因此通過利用選擇標記基因構造微藻的遺傳轉化的零背景的TA克隆載體。此外，該技術可靈活地適應用于PCR擴增的基因或片段開發專門的表達載體的單步裝配(Chen et al.，2009)。通過限制性內切酶XcmI的高效酶切，該質粒可以形成兩個3’的T突出端以便用于TA克隆，我們這次構建的T載體基于限制性內切酶XcmI的靈活運用(Chen et al.，2009)，T載體連接方式幾乎適用于所有的基因克隆連接工作，使得未來都省時省力連接目的基因到在三角褐指藻表達的載體。
[0006]用于遺傳轉化的關鍵步驟是有一個包含所有表達基因元件的載體，該載體包含選擇標記(通常是抗生素抗性基因)的表達盒或者選擇質粒在細菌或選擇在宿主生物體中的基因轉移，以及用于表達的宿主生物體中另一個靶基因表達盒的操作。然而，所生產的選擇標記蛋白的獲得轉基因生物體后不想要的。構建生產轉基因細胞異源蛋白質有時是有問題的，因為一些蛋白質可能會影響轉基因細胞或細胞的生長，一個可行的選擇是使用誘導型啟動子來限制選擇標記蛋白在轉基因生物體的表達。誘導型啟動子的發展也是必不可少的轉化載體允許選擇標記物的表達，以及是在細胞中表達感興趣的基因的設計思路。
[0007]某些廣泛用于植物轉化的異源啟動子已被用于在微藻的基因轉化中。如在甲藻Amphidinium中，花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子和pI’2’農桿菌啟動子啟動了報告基因⑶S的表達(Leon and Fernandez, 2007)。然而，由于這些微細藻類的獨特的核特性,異源啟動子表達量的影響，而不是如預期在高等植物中表達量高，在藻類中表現出相對低的表達水平，且通常為瞬時表達。與此相對，單細胞綠藻萊茵衣藻的RBCS2啟動子比在轉基因鹽藻中使用35S啟動子表現出更高的效率(Sun et al.，2005)。在羽狀娃藻Cylindrothecafusiformis和中心娃藻海鏈藻(Poulsen and Kriigcr.2005)中用內源的巖藻黃素葉綠素a/c結合蛋白(fcp)啟動子和硝酸還原酶(NR)啟動子呈現相對較高的轉化效率(Poulsenet al.，2006)。從娃藻Cylindrotheca fusiformis中克隆的啟動子在娃藻三角褐指藻中呈現相對較高效率的表達(Miyagawa et al.，2009)。此外和羽狀娃藻Cylindrothecafusiformis和中心娃藻Thalass1sira pseudonana相比，三角褐指藻遺傳轉化方法的技術限制，其轉換效率都比較低。因此，新型和有效的內源性啟動子的功能研究是外源基因在三角褐指藻高效表達的重要因素。
[0008]綠色熒光蛋白是真核細胞中基因表達的定量基因(Soboleski，2004)。含綠色熒光蛋白(GFP)標記基因的質粒DNA可通過蛋白免疫印跡法和細胞熒光來檢測該蛋白質的表達(Tolonen et al.，2006)。Scott等人已成功將綠色突光蛋白報告基因在衣藻Chlamydomonas reinhardtii 葉綠體中表達(Scott Franklin, 2002)。Li 等人在轉基因鹽藻成功表達硝酸還原酶誘導的綠色突光蛋白表達(Li et al.，2007)。Niu等人在三角褐指藻中成功建立誘導表達綠色熒光蛋白表達系統(Niu et al.，2012)。
[0009]目前微生物油脂的高額生產成本阻礙了其大規模產業化.提高產油微生物中的油脂含量是解決成本問題的一個關鍵。然而，無論是在微生物還是植物中，油脂含量的提高都是一個具有較大難度的工作。研究者曾采取各種各樣的方法，包括基因修飾等方法來去除可能對油脂積累有阻礙作用的物質，但這些嘗試都失敗了，或者說油脂產量的提高不顯著(10%~15% ) (Rafledge et al.2010)。近年來研究證實，油脂積累期間6_磷酸葡萄糖脫氫酶活力的降低和油脂積累程度有直接的聯系.因此研究6-磷酸葡萄糖脫氫酶在產油藻類中的調控作用，對于實現提高產油生物中的油脂含量具有重大意義。
[0010]近年來6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)受到普遍關注，在動物、酵母、人類、植物中做了很多研究來探究G6PD 的功能(Zhang, 2008#93).(Lojudice, 2001#102) (Legan, Rebrin etal.2008)(Wang, 2012#90)。
[0011]G6ro還參與脂肪酸的生物合成。Gero催化磷酸戊糖途徑的第一個反應并產生NADPH和磷酸戊糖。G6H)是該途徑的限速酶，反應產物NADPH通過提供還原力促進脂肪酸的合成(Salati and Amir-Ahmady2001)。有研究表明，在此反應過程中，NADPH不斷生成，能夠提供肝臟中脂肪酸合成所必須的50-75%的還原力(R.Rognstadl979)。G6H)基因在受到外界刺激如激素、生長因子、營養條件以及氧化應激的調節時，會進行轉錄以及轉錄后水平的調節(Kletzien，1994#86)。有研究表明，在受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制時，脂肪合成酶包括Gero同樣受到調節，但是不同的脂肪合成酶受到的調節不同。G6ro是唯一一個可以在轉錄后水平調節的酶，所以能夠有效地調節脂肪合成(Kohan，2009#50)。
[0012]G6H)是眾多參與脂肪生物合成的酶中唯—個參與多個代謝路徑的酶，目前許多關于該酶的研究表明 G6ro與細胞生長、抵抗胰島素、高脂血、心血管疾病、糖尿病以及動物體內的氧化應激等相關。(Batetta, Bonatesta et al.2002) (Park, Rho et al.2005)(Gupte2008, Legan, Rebrin et al.2008, Schneider, Rawat et al.2012)。在調控NADPH的生成及氧化還原平衡中起著重要的作用，還能夠有效地調控細胞分化，細胞生長以及物質代謝。G6TO在G6TO缺陷的人纖維細胞中的異位表達能夠有效地阻止缺陷細胞的生長遲緩以及細胞早衰。(Ho，2000#83)。G6H)基因的上調與黑腹果蠅的壽命延長以及腫瘤性轉化包括胃癌(Wang, 2012#103)腎細胞癌，(Langbein，2008#106)，纖維肉瘤(Frederiks, 2006#105)等顯著相關。同樣，還有報道稱在G6H)缺陷的外周血淋巴細胞及單核細胞中，G6H)的低表達能夠抑制膽固醇代謝和細胞生長(Batetta, Bonatesta etal.2002) 0這些研究能夠充分說明G6H)對于細胞生長的重要作用。另外還有研究表明胚外組織的Gero活性的嚴重缺陷能夠導致氧化還原平衡的混亂，導致細胞生長的調劑異常最終胚胎死亡(Longo，2002#80)。由以上研究可知G6H)對于機體的正常生長以及適應外界環境有重要的作用。
[0013]研究表明提高G6H)的表達量，提高G6ro的酶活，可提高NADPH的合成，還有研究報道提高G6ro的表達能夠促進大部分脂肪基因的表達。G6ro在脂質的生物合成路徑中發揮顯著的作用，在人類肝臟中過表達Gero基因能夠提高細胞內甘油三酯和游離脂肪酸的含量并能促進脂肪細胞中游離脂肪酸的釋放，并能增加脂肪細胞因子的表達、刺激胰島素抵抗。盡管脂質生物合成的增加與Gero活性的增加緊密相關，但是具體的相互作用機制相當復雜至今還未能完全研究清楚(Schneider, Rawat et al.2012)。在動物中，G6PD的過表達同樣能夠刺激肥胖動物的脂肪生成，G6PD的過表達與脂肪酸代謝物包括游離脂肪酸(FFAs)和甘油三酯(TAG)的增加相關。與正常的脂肪細胞相比，過表達G6H)基因的3T3-L1細胞中的G6H)活性提高了 1.4倍，使得過表達G6H)基因的細胞中脂肪滴變多變大(Park, Rho et al.2005)。通過基因改造可以啤酒酵母菌也能夠產生高水平的G6H)活性以及G6H)基因的表達量。(Lojudice, 2001#102)。有研究表明G6H)基因的過表達與血脂異常相關，在過表達Gero的肥胖小鼠中，游離脂肪酸達到了相當高的水平。與正常的小鼠心臟相比，過表達G6H)的小鼠心臟G6H)基因的表達量增加了 10倍，G6PD活性增加了 2倍(Gupte2008)。在另外的研究中也表明在患有糖尿病的肥胖小鼠肝臟中G6H)也明顯增加(Gupte, Floyd et al.2009)。相應的，敲除G6H)基因能夠抑制肥胖小鼠的脂肪生成。G6ro缺陷的細胞中脂肪細胞的分化減弱，脂肪滴積累的數量變少，脂肪滴變小，細胞內游離脂肪酸以及甘油三酯的積累水平明顯降低(Park，Rho et al.2005)。G6H)缺陷的個體同樣表現出β -羥_β -甲戊二酸單酰輔酶a以及3—羥基一3甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性相應的降低，從而導致膽固醇以及低密度脂肪酸合成減少(Meloni，Manca etal.2008)., (Batetta, Bonatesta et al.2002)。酵母水解產物的補充能夠通過下調肥胖小鼠肝臟中G6H)的活性從而抑制脂肪酸的合成，使得小鼠脂肪積累減(Jung，2012#40)。通過小干擾RNA敲除G6ro基因會降低細胞內脂質積累、阻礙重要的脂肪基因的表達(Park, Rho et al.2005)。在G6H)缺陷病人中，血清蛋白的濃度以及脂質生成的速率都會降低(Dessi, Ch1dino et al.1986, Dessi, Batetta et al.1992)。G6PD 活性與代謝顯著相關，尤其是緊密參與多不飽和脂肪酸的代謝。Gero的活性會因飲食中糖類的刺激而增加，在食入的多不飽和脂肪酸刺激下降低(Salati, 2001#52)。
[0014]G6PD在人類及動物中有較多研究，以上這些結果表明提高G6H)的表達能夠促進脂肪酸合成的可能性。但是迄今Gero在植物及藻類中缺乏研究。此發明中，借鑒人類及動物研究中Gero基因與脂肪和成緊密相關、Gero活性增加能夠促進脂肪合成，在藻類中通過過表達G6ro基因使得G6ro基因表達量提高，從而使得G6ro活性顯著提高，使得藻的脂肪酸合成增加以及脂肪酸成分發生變化。
【發明內容】
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[0015]本發明的第一個目的是提供一種過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體。
[0016]本發明的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體，是一個多功能的微藻轉化載體。該重組載體包括篩選標記基因表達盒及目的基因表達盒；所述的篩選標記基因表達盒包括抗性篩選基因，在抗性篩選基因的上游融合了大腸桿菌Pl啟動子，抗性篩選基因的下游融合了大腸桿菌CCdB終止子；所述的目的基因表達盒包括三角褐指藻fcpC基因啟動子、6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因、三角褐指藻fcpA基因終止子及一個Omega leader序列，所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因啟動子的下游。
[0017]所述的大腸桿菌Pl啟動子的序列如SEQ ID N0.1所示,大腸桿菌ccdB終止子的序列如SEQ ID N0.2所示，三角褐指藻fcpC基因啟動子的序列如SEQ ID N0.3所示，6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的序列如SEQ ID N0.4所示，三角褐指藻fcpA基因終止子的序列如SEQID N0.5 所不，Omega leader 序列如 SEQ ID N0.6 所不。
[0018]所述的目的基因表達盒，優選在三角褐指藻fcpC基因啟動子和三角褐指藻fcpA基因終止子之間通過不依賴于連接反應的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位點，所述的XcmI序列如SEQ ID N0.7所示。
[0019]所述的目的基因表達盒，優選在三角褐指藻fcpA基因終止子前融合一個MYC標簽序列，所述的MYC標簽序列如SEQ ID N0.8所示。
[0020]所述的抗性篩選基因，優選為氯霉素酰基轉移酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.9所示。
[0021]所述的表達盒是指含有啟動子、目的基因或目的基因克隆位點和終止子、且其中的基因能正常進行轉錄和翻譯的序列。
[0022]所述的融合為本領域技術人員所熟知的DNA片段連接技術。
[0023]不依賴于連接反應的高效克隆方法(LIC)屬于現有技術。
[0024]本發明的第二個目的是提供所述的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體在構建高效的微藻生物產油器中的應用。
[0025]所述的微藻，優選為三角褐指藻。
[0026]本發明的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體包括2個基因表達盒，一個為篩選標記基因表達盒，另一為目的基因表達盒。篩選標記基因表達盒集成了真核和原核的表達盒，采用氯霉素酰基轉移酶基因作為抗性篩選基因，其上游融合了來自大腸桿菌的Pl啟動子和三角褐指藻fcpC基因啟動子，下游融合了大腸桿菌CCdB終止子和三角褐指藻fcpA基因終止子。該融合表達盒使得氯霉素酰基轉移酶基因既能在大腸桿菌中表達，又能在三角褐指藻中表達。該設計有效減小了表達載體的大小，便于載體的克隆操作以及高效的轉化。本發明中采用了三角褐指藻的內源性的高效啟動子fcpC，fcpC與三角褐指藻的光合作用相關，因此具有極高的啟動效率，是理想的構建載體元件。
[0027]目的基因表達盒，用于表達外源基因，采用三角褐指藻的高表達水平的fcpC基因的啟動子及終fcpA基因的終止子。目的基因表達盒內通過特別設計的2個XcmI內切酶位點引入了 TA克隆的連接方式。XcmI酶切線性化的載體即可直接一個步驟克隆Taq聚合酶PCR的產物。在三角褐指藻fcpC基因啟動子的后面融合了一個Omega leader序列，曾有相關研究表明，把CaMV35S啟動子-419~_90(E12)序列與omega序列相串聯，⑶S基因在轉基因煙草中有最大的表達活性。用這種結構增強⑶S基因表達，在轉基因煙草中⑶S活性比僅僅用CaMV35S啟動子高20-70倍(Mitsuhara et al., 1996)。由此可以看出，omega序列具有提聞啟動子活性進而提聞目的基因表達的作用。
[0028]在三角褐指藻fcpA基因終止子的前面，添加的另外一個序列MYC-tag，具有高效，可靠，穩定的特性屬于被廣泛應用的成熟的理想的蛋白標簽。在1985年就有相關文獻報道將MYC序列位于終止密碼子之前,用于western blot檢測目的基因的表達(Evan etal.，1985)。MYC-tag應用于本發明的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體，可以解決一些后續載體的應用問題。例如在載體攜帶三角褐指藻的內源性基因進行過表達研究時，因為無內源性基因表達的蛋白與藻細胞內自身表達的蛋白相同，無法使用特定的抗體進行檢測，MYC標簽可以方便可靠的檢測出基因是否成功的導入了細胞中。另一方面，對于其他非三角褐指藻內源性的基因的攜帶導入實驗中，也可以不必再針對不同的蛋白而使用不同的抗體，而可以統一使用MYC抗體進行檢測，節約了成本。
[0029]本發明的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體比較小，適合轉化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表達。
[0030]本發明的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體能夠在微藻中進行過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因。G6H)催化磷酸戊糖途徑的第一個反應并產生NADPH和磷酸戊糖。G6H)是該途徑的限速酶，反應產物NADPH通過提供還原力促進脂肪酸的合成(Salatiand Amir-Ahmady2001)。有研究表明，在此反應過程中，NADPH不斷生成，能夠提供肝臟中脂肪酸合成所必須的50-75%的還原力(R.Rognstadl979)。G6H)基因在受到外界刺激如激素、生長因子、營養條件以及氧化應激的調節時，會進行轉錄以及轉錄后水平的調節(Kletzien，1994#86)。有研究表明，在受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制時，脂肪合成酶包括Gero同樣受到調節，但是不同的脂肪合成酶受到的調節不同。G6ro是唯一一個可以在轉錄后水平調節的酶，所以能夠有效地調節脂肪合成(Kohan，2009#50)。通過過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因能夠顯著地提高微藻細胞內的脂質含量，為生物能源的研究奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
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[0031]圖1為目的基因表達盒構建圖；
[0032]圖2為pHY18表達載體結構圖，Pnr/Tnr:硝酸還原酶啟動子/終止子；PfcpC:三角褐指藻fcpC啟動子，TfcpA:三角褐指藻fcpA終止子；CAT:氯霉素乙酰轉移酶基因；0ri:PUC19質粒復制起點；
[0033]圖3為CAT在大腸桿菌和三角褐指藻中的表達，A左為商業化載體pMD19_T轉化大腸桿菌；A右為pHY18載體轉化大腸桿菌(LB培養基含35mg L-1氯霉素)；B左為轉化載體pHY18-eGFP的三角褐指藻生長在250mg L—1氯霉素f/2_si培養基中，B右為野生型三角褐指藻；
[0034]圖4PCR驗證和微藻蛋白質印跡分析，A為用引物P201和P202PCR擴增轉化eGFP基因融合，其中，泳道1:轉基因株系，泳道2:未轉基因藻株，泳道M:100bp Marker，箭頭表示0.7-kb的eGFP的條帶；B為Western blot分析用抗Myc及抗GFP抗體檢測綠色突光蛋白，β-actin作為內部對照基因和探討，泳道1:未轉基因藻株，泳道2:轉基因株系；
[0035]圖5共聚焦顯微鏡觀察eGFP基因，A為轉基因三角褐指藻株，B為未轉化的三角褐指藻B;
[0036]圖6為基因的PCR擴增結果圖，泳道M為Ikb的ladder marker ;泳道I為G6ro基因的擴增結果；
[0037]圖7為G6F*D基因編碼的蛋白序列的進化樹；
[0038]圖8為Ρ?66Η)_ρΗΥ18重組質粒的Sal I酶切圖，泳道M為Ikb的ladder marker ；泳道I為PtG6ro-pHY18重組質粒；泳道2為PtG6ro_pHY18重組質粒的Sal I酶切結果；
[0039]圖9為PtG6ro_pHY18重組質粒的引物圖譜；
[0040]圖10為抗生素篩選陽性三角褐指藻的培養結果照片，其中，A為200mg.L—1氯霉素平板篩選陽性藻的照片，Wild type為未轉化藻，Transgenic為轉化藻；B為200mg.L—1氯霉素濃度的f/2培養基培養轉化藻和未轉化藻,Wild type為未轉化藻,Transgenic為轉化藻；
[0041] 圖11為轉化藻的MYC蛋白的Western blot分析圖,其中，control為未轉化藻，G6PD1為轉化藻株I ;G6PD2為轉化藻株2 ；
[0042]圖12為G6H)基因表達蛋白的蛋白定位的膠體金免疫電鏡圖，A為過表達G6H)基因的轉基因三角褐指藻，B為野生型的三角褐指藻，標尺大小為500nm。
[0043]圖13為轉化藻中的G6H)基因的qPCR分析圖；
[0044]圖14為轉化藻的G6H)的酶活檢測結果；
[0045]圖15A為每ml藻液的轉化藻和未轉化藻的中性脂質含量；B為尼羅紅染色測定每16細胞的轉化藻和未轉化藻的中性脂質含量；C為轉化藻和未轉化藻的生長曲線；D為轉化藻和未轉化藻缺氮48小時和96小時后的中性脂質含量；
[0046]圖16為轉化藻和未轉化藻的激光掃描共聚焦顯微鏡檢測圖,A為未轉化藻；B為轉化藻。
【具體實施方式】
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[0047]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0048]本發明所使用的限制性內切酶、T4DNA連接酶、NEB高保真Pfu聚合酶(購自NewEngland B1labs1USA);所有引物及核苷酸序列的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。大腸桿菌DH5ci感受態細胞購自廣州鼎國生物有限公司。
[0049]過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體構建過程中所使用的引物序列如表I所示。
[0050]表1:載體設計中使用的引物
[0051]
【權利要求】
1.一種過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體，其特征在于，包括篩選標記基因表達盒及目的基因表達盒；所述的篩選標記基因表達盒包括抗性篩選基因，在抗性篩選基因的上游融合了大腸桿菌Pl啟動子，抗性篩選基因的下游融合了大腸桿菌CCdB終止子；所述的目的基因表達盒包括三角褐指藻fcpC基因啟動子、6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因、三角褐指藻fcpA基因終止子及一個Omega leader序列,所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因啟動子的下游； 所述的大腸桿菌Pl啟動子的序列如SEQ ID N0.1所示,大腸桿菌ccdB終止子的序列如SEQ ID N0.2所示,三角褐指藻fcpC基因啟動子的序列如SEQ ID N0.3所示,6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的序列如SEQ ID N0.4所示，三角褐指藻fcpA基因終止子的序列如SEQ IDN0.5 所不，Omega leader 序列如 SEQ ID N0.6 所不。
2.根據權利要求1所述的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體，其特征在于，所述的目的基因表達盒，其中在三角褐指藻fcpC基因啟動子和三角褐指藻fcpA基因終止子之間通過不依賴于連接反應的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位點，所述的XcmI序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根據權利要求1所述的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體，其特征在于，所述的目的基因表達盒，在三角褐指藻fcpA基因終止子前融合一個MYC標簽序列，所述的MYC標簽序列如SEQ ID N0.8所示。
4.根據權利要求1所述的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體，其特征在于，所述的抗性篩選基因為氯霉素酰基轉移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示。
5.權利要求1所述的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體在構建高效的微藻生物產油器中的應用。
6.根據權利要求5所述的過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體在構建高效的微藻生物產油器中的應用，其特征在于，所述的微藻為三角褐指藻。
【文檔編號】C12N1/13GK104131025SQ201410329135
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月10日 優先權日:2014年7月10日
【發明者】李宏業, 薛姣, 楊維東, 劉潔生 申請人:暨南大學