一種鑒定大豆茸毛色的分子標記及其鑒定方法

一種鑒定大豆茸毛色的分子標記及其鑒定方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定大豆茸毛色的分子標記及其鑒定方法，所述分子標記具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，所述鑒定方法以大豆植物組織的基因組DNA為模板，所述分子標記為目的基因，設計特異性引物進行PCR擴增，獲得擴增片段，用以判定大豆茸毛的顏色；本發明是基于大豆類黃酮3’-羥化酶的編碼基因及其等位變異基因對大豆茸毛色的調控開發出的一種共顯性分子標記，與現有技術相比，本發明的分子標記及其鑒定方法能夠一次性將灰色茸毛大豆與棕色茸毛大豆鑒別開，適用于大豆茸毛色性狀的早期鑒定，為開展該性狀形成的生理基礎和分子機制等相關研究奠定基礎。
【專利說明】【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及的是一種大豆的分子標記【技術領域】，尤其涉及的是一種鑒定大豆茸毛 色的分子標記及其鑒定方法。 一種鑒定大豆茸毛色的分子標記及其鑒定方法 【背景技術】
[0002] 大豆茸毛色和花色是鑒定大豆品種的重要指標之一，其中茸毛色包括棕色和灰色 兩種顏色。一般來說，茸毛色為棕色、花色為紫色的大豆是大豆的野生原始性狀，這種大豆 對環境要求不嚴格，適應性強，而茸毛色為灰色、花色為白色的大豆屬于大豆的進化性狀， 這種大豆對環境條件要求高，適應性差。茸毛色和花色，尤其是茸毛色，與大豆的品質關系 密切，如棕毛紫花大豆，往往皮色發暗，臍色多為深色，易生褐斑，種子外觀不良；而灰毛百 花大豆，一般種皮鮮艷，臍色多為淡色，種子外觀良好。
[0003] 大豆茸毛色的判別方法一般可直接用肉眼觀測，但需要等到大豆結出果實后才能 判定，不適宜前期選種，Yong Guo等人（2013)發表了一篇文章指出，類黃酮3' -羥化酶和 類黃酮3'，5'-羥化酶這兩類具有催化B-環類黃酮使B-環類黃酮羥基化的酶，對大豆的顏 色具有重要的調控作用。該文章中指出了類黃酮3' -羥化酶的編碼基因與大豆茸毛色的 關系，揭示了利用該這兩種基因作為大豆茸毛色的標記基因進行分子鑒定的可行性。為驗 證兩種基因與茸毛色的關系，該文章中還針對大豆茸毛色的標記基因設計了多對引物，但 每一對引物擴增的片段都很短，且PCR產物需要酶切才能對目標性狀進行區分，操作繁瑣 效率不高（Yong Guo, Lijuan Qiu, Allele-specific marker development and selection efficiencies for both flavonoid3, -hydroxylase and flavonoid3,,-hydroxylase genes in soybean subgenus soja, Theor Appl Genet, (2013), 126:1445-1455)〇
【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種鑒定大豆茸毛色的分子標記 及其鑒定方法，以提供一種簡單高效的方法實現大豆茸毛色的早期鑒定。
[0005] 本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟：
[0006] 一種鑒定大豆茸毛色的分子標記，所述分子標記具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷 酸序列。
[0007] -種利用上述分子標記鑒定大豆茸毛色的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)提取大豆植物組織的基因組DNA，以所述分子標記的1?445位點的核苷酸序 列為模板設計上游引物，以所述分子標記的707?1471位點的核苷酸序列為模板設計下游 引物，進行PCR擴增，獲得擴增片段，其中所述核苷酸序列為5' 一 3' ；
[0009] (2)若所述步驟（1)的擴增片段包含所述分子標記的445?707位點的核苷酸序 列，則所述大豆茸毛色為灰色，若不包含，則所述大豆茸毛色為棕色。
[〇〇1〇] 優選地，所述步驟⑴中，上游引物為如SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列，下游引 物為如SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列：
[0011] 上游引物：SEQ ID NO :2 :5' GCATTATTGAGGAGCACA3' ；
[0012] 下游引物：SEQ ID NO :3 :5, AGTAAGTATGGGAGGTGGG3,；
[0013] 利用上述優選的上游引物和下游引物對大豆茸毛色的分子標記進行PCR檢測， 若獲得的擴增片段大小為1471bp，則所述大豆茸毛色為灰色，若獲得的擴增片段大小為 1209bp，則所述大豆茸毛色為棕色，所述大小為1471bp的擴增片段即為包含所述分子標記 的445?707位點的核苷酸序列。
[0014] 優選地，所述步驟（1)的PCR擴增程序為：95°C預變性5min，95°C變性30s，起始 退火溫度為66°C，以后每循環降低0. 3°C，退火時間40s，72°C延伸90s，設38個循環，最后 72°C繼續延伸15min。
[0015] 優選地，所述步驟（1)的大豆品種選自綏農1號、天鵝蛋、高作選1號、黑農2號、 克北1號、東山69、平頂黃豆、合豐37號、馬蘭早茶豆、白秋1號、長沙泥豆、黑河1號、貢豆 7號和中品661中的一種。
[0016] 優選地，所述步驟（1)的大豆植物組織選自葉片、根尖、種子和種皮中的一種。
[0017] 本發明的原理是：本發明首先是通過對大豆類黃酮3' -羥化酶的編碼基因（其核 苷酸序列如SEQ ID N0 :4所示）進行遺傳多樣性分析，發現該基因存在一種等位變異基因， 該等位變異基因在不同絨毛色大豆品種中存在262bp的差異（即所述分子標記的445? 707位點，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示），可以作為鑒別大豆茸毛色的標記基因。
[0018] 本發明相比現有技術具有以下優點：本發明提供了一種鑒定大豆茸毛色的分子標 記及其鑒定方法，該分子標記為大豆類黃酮3' -羥化酶的編碼基因的等位變異基因，該等 位變異基因只有在灰色茸毛的大豆中才存在，與類黃酮3' -羥化酶的編碼基因存在262bp 的差異，差異顯著，利用該差異開發的分子標記無需進行酶切即可鑒別，屬于共顯性分子標 記，不用擔心假陰性的現象，可直接應用于大豆灰色茸毛和棕色茸毛的早期鑒定，為開展該 性狀形成的生理基礎和分子機制等相關研究奠定基礎；另外，基于該分子標記開發的鑒定 方法，本發明還提供了一對特異性的引物，該引物PCR擴增的片段長度在1000?1500bp， 與PCR擴增過程中降解產生的雜帶相區分，可有效防止假陽性擴增片段的出現；本發明的 鑒定方法簡便易行，大大提高了對目標性狀的檢測效率和準確性。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為實施例1的14種大豆茸毛色鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結果圖。 【具體實施方式】
[0020] 下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前 提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下 述的實施例。
[0021] 實施例1
[0022] 本實施例的一種鑒定大豆茸毛色的分子標記的方法，包括以下步驟：
[0023] 1、DNA 提取：
[0024] 選取綏農1號（灰）、天鵝蛋（灰）、高作選1號（灰）、黑農2號（灰）、克北1 號（灰）、東山69(灰）、平頂黃豆（灰）、合豐37號（棕）、馬蘭早茶豆（棕）、白秋1號 (棕）、長沙泥豆（棕）、黑河1號（棕）、貢豆7號（棕）和中品661(棕）（括號中為各品 種目測的茸毛色）14種大豆品種作為待測樣品，分別取取3粒外觀、飽滿度較好的大豆種 子，用打孔器磨出豆粉l〇〇mg左右放入1. 5ml離心管中，加入0. 7ml的SDS提取緩沖液（配 方為：NaC1288mmol/L，Tris-HC1200mmol/L，EDTA25mmol/L，質量百分比為 0· 5%的 SDS)，用 0.7ml酚：氯仿：異戊醇（體積比為25 : 24 : 1)抽提除去蛋白質，重復一次，經異丙醇和 NaAc (pH5. 2)沉淀，70%乙醇漂洗后，真空干燥。紫外分光光度檢測DNA濃度，一20°C保存 備用，獲得大豆基因組DNA。
[0025] 2、以上述提取的14種大豆基因組DNA為模板，SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所述 序列為特異性引物，進行PCR擴增，獲得擴增片段；
[0026] SEQ ID N0 :2 :5' GCATTATTGAGGAGCACA3' ；
[0027] SEQ ID N0 :3 :5' AGTAAGTATGGGAGGTGGG3' ；
[0028] PCR擴增的反應體系為：總反應體系為20μ 1，含(ΜΗ2012.8μ 1，10XPCR Ex Buf?er2·0μl，2·5mMdNTP2·0μl，10μM如SEQIDN0·l所示的引物序列0·5μl，10μM如 SEQ ID Ν0· 2 所示的引物序列(λ 5μ 1，5υ/μ 1 的 Takara Ex-TaqO. 2μ l，50ng/ul 大豆基因 組 DNA2 μ 1。
[0029] PCR擴增的反應程序為：95°C預變性5min，95°C變性30s，起始退火溫度為66°C，以 后每循環降低0. 3°C，退火時間40s，72°C延伸90s，設38個循環，最后72°C繼續延伸15min。
[0030] 3、瓊脂糖凝膠電泳檢測：
[0031] 將上述PCR擴增獲得的擴增片段用質量分數為1. 5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電 泳的緩沖體系為1倍的TAE溶液，在100V恒壓下，電泳50分鐘，紫外燈下拍照并保存；
[0032] 若上述PCR獲得的擴增片段長度為1209bp，則所述大豆茸毛色為棕色；
[0033] 若上述PCR獲得的擴增片段長度為1471bp，則所述大豆茸毛色為灰色；
[0034] 4、結果
[0035] 附圖1為本實施例1瓊脂糖凝膠電泳的具體實驗結果圖，其中Μ為Marker5000,泳 道1-14分別為：綏農1號、天鵝蛋、高作選1號、黑農2號、克北1號、東山69、平頂黃豆、合 豐37號、馬蘭早茶豆、白秋1號、長沙泥豆、黑河1號、貢豆7號和中品661。
[0036] 其中，泳道1、2、3、4、5、6、7獲得了長度大小約為1400bp的片段，即綏農1號、天鵝 蛋、高作選1號、黑農2號、克北1號、東山69和平頂黃豆的鑒定結果為灰色，與目測結果一 致。
[0037] 泳道8、9、10、11、12、13、14獲得的片段長度約為120(^?左右，即合豐37號、馬蘭 早茶豆、白秋1號、長沙泥豆、黑河1號、貢豆7號和中品661的鑒定結果為棕色，與目測結 果一致。
[0038] 附圖1中可以看出，兩種茸毛色的大豆的擴增片段長度差異大，PCR擴增條帶清 晰，肉眼可直接準確判斷，同時，對14種大豆茸毛色的分子鑒定結果與目測結果一致，說明 本發明的鑒定準確度高。
[0039] 實施例2
[0040] 本實施例的一種大豆茸毛色的分子鑒定方法，包括以下步驟：
[0041] (1)選取綏農1號大豆植物的葉片、根尖、種子和種皮，分別提取上述4種組織的基 因組DNA，然后以上述4種組織的DNA為模板，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所述序列為特 異性引物，分別進行PCR擴增，獲得擴增片段。
[〇〇42] (2)鑒定結果：4種組織的DNA均擴增獲得了長度為1471bp的片段，判定所述綏農 1號大豆的茸毛色為灰色。
[0001]
【權利要求】
1. 一種鑒定大豆茸毛色的分子標記，其特征在于，所述分子標記具有如SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列。
2. -種利用如權利要求1所述的分子標記鑒定大豆茸毛色的方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1) 提取大豆植物組織的基因組DNA，以所述分子標記的1?445位點的核苷酸序列 為模板設計上游引物，以所述分子標記的707?1471位點的核苷酸序列為模板設計下游引 物，進行PCR擴增，獲得擴增片段，其中所述核苷酸序列為5' 一 3' ； (2) 若所述步驟（1)的擴增片段包含所述分子標記的445?707位點的核苷酸序列，則 所述大豆茸毛色為灰色，若不包含，則所述大豆茸毛色為棕色。
3. 根據權利要求2所述的一種利用分子標記鑒定大豆茸毛色的方法，其特征在于，所 述步驟（1)中，上游引物為如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，下游引物為如SEQ ID NO :3 所示的核苷酸序列： 上游引物：SEQ ID NO :2 :5' GCATTATTGAGGAGCACA3' ； 下游引物：SEQ ID NO :3 :5' AGTAAGTATGGGAGGTGGG3' ； 所述步驟（2)中，若擴增片段大小為1471bp，則所述大豆茸毛色為灰色，若擴增片段大 小為1209bp，則所述大豆茸毛色為棕色。
4. 根據權利要求2所述的一種利用分子標記鑒定大豆茸毛色的方法，其特征在于，所 述步驟⑴的PCR擴增程序為：95°C預變性5min，95°C變性30s，起始退火溫度為66°C，以后 每循環降低0. 3°C，退火時間40s，72°C延伸90s，設38個循環，最后72°C繼續延伸15min。
5. 根據權利要求2所述的一種利用分子標記鑒定大豆茸毛色的方法，其特征在于，所 述步驟（1)的大豆品種選自綏農1號、天鵝蛋、高作選1號、黑農2號、克北1號、東山69、平 頂黃豆、合豐37號、馬蘭早茶豆、白秋1號、長沙泥豆、黑河1號、貢豆7號和中品661中的 一種。
6. 根據權利要求2所述的一種利用分子標記鑒定大豆茸毛色的方法，其特征在于，所 述步驟（1)的大豆植物組織選自葉片、根尖、種子和種皮中的一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK104109715SQ201410327825
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月10日 優先權日:2014年7月10日
【發明者】王曉波, 張浩偉, 馬元山, 高雅麗, 張文明 申請人:安徽農業大學