一種芝麻染色體熒光原位雜交方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種芝麻染色體熒光原位雜交方法，其采用涂片技術制作芝麻中期染色體標本，染色體分散效果好，制片效率高；在此基礎上，采用熒光素標記BAC探針，建立了芝麻BAC的染色體原位雜交技術。探針雜交染色體后，熒光信號可被直接檢測，從而確定目的DNA片段在染色體上的拷貝數量及位置。采用本發明方法制作的染色體標本可用于多次重復雜交，提高了標本的利用率和試驗效率，并節省大量時間和成本；填補了我國芝麻染色體BAC原位雜交技術的空白。
【專利說明】一種芝麻染色體焚光原位雜交方法
[0001]
【技術領域】 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種芝麻染色體制片與BAC熒光原位雜交方法。
【背景技術】
[0002] 染色體制片和細菌人工染色體熒光原位雜交（BAC-FISH)技術是開展生物DNA片 段染色體定位、物理圖譜構建等細胞遺傳學研究的重要技術手段。目前在芝麻染色體核型 分析研究中，所使用的染色體制片方法均為傳統的壓片方法；而且尚未見任何制片技術在 芝麻BAC-FISH研究中的應用報道。在制作染色體標本時，傳統的壓片法需要對染色體標本 進行敲片、蓋片處理，染色體容易變形；在進行原位雜交時，染色體標本因處于細胞質包裹 中，往往其背景信號較強，對雜交信號的觀察干擾較大；而且中間操作過程中的揭片環節極 有可能導致染色體丟失，從而導致制片效率低、費工費時。此外，傳統壓片技術不利于制片 的多次重復使用，這也很大程度地影響了原位雜交技術在芝麻物理圖譜構建和特定片段染 色體定位研究中的應用。因此，當前急需探討一種穩定高效快速的芝麻染色體制片方法和 BAC-FISH雜交技術，為加快芝麻細胞遺傳學和基因組學研究提供技術支撐。
【發明內容】
[0003] 為克服現有技術不足，本發明目的在于提供一種高效便捷的芝麻染色體熒光原位 雜交技術方法。
[0004] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 一種芝麻染色體熒光原位雜交方法，其包括如下步驟： A、 染色體標本的制備； B、 BAC探針制備： 1)BAC質粒DNA提取 從芝麻BAC庫中挑出目的BAC克隆，培養后，采用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，質粒 DNA 濃度 100 - 500 ng/ μ L ; 2 )探針標記 取20 μ L BAC DNA，0. lKpa、120°C下放置5min，然后冰浴放置5min，隨機引物法進行探 針標記，37°C水浴20h，65°C滅活5min，-20°C保存備用；標記體系見表1 ; 表1探針突光標記反應體系
【權利要求】
1. 一種芝麻染色體熒光原位雜交方法，其特征在于，包括如下步驟： A、 染色體標本的制備； B、 BAC探針制備： 1)BAC質粒DNA提取 從芝麻BAC庫中挑出目的BAC克隆，培養后，采用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，質粒 DNA 濃度 100 - 500 ng/ μ L ; 2 )探針標記 取20 μ L BAC DNA，0. lKpa、120°C下放置5min，然后冰浴放置5min，隨機引物法進行探 針標記，37°C水浴20h，65°C滅活5min，-20°C保存備用；標記體系見表1 ; 表1探針突光標記反應體系
C、 熒光原位雜交 將標記好的探針用雜交液稀釋10倍作為工作液用于熒光原位雜交；工作液各組分見 表2 ; 表2熒光原位雜交所用工作液組成
1)染色體制片處理 將染色體制片浸泡于45%乙酸中1 一 2min，取出自然晾干，褪去吉姆薩染液顏色；37°C 下用含1〇〇μ g/mL RNase A的2XSSC處理制片標記區lh ;然后用2XSSC洗片三次，每次 5min ;使用70%、85%及無水乙醇對制片逐級脫水，每級3 - 5min ; 自然晾干后，37°C下用1%胃蛋白酶處理制片標記區30min，lXPBS洗2次，每次5min ; 然后用1%多聚甲醛處理制片標記區l〇min，2XSSC洗2次，每次5min，自然晾干； 在制片標記區加70%去離子甲酰胺，加蓋片，70°C變性2min ;將變性后的制片進行脫 水，依次置于_20°C預冷的70%、85%及無水乙醇中逐級脫水，每級3 - 5min，自然晾干備用； 2) 探針變性 取20 μ L工作液，95°C變性lOmin，冰浴5min以上，備用； 3) 雜交 制片標記區內加工作液8 μ L，加蓋片，膠水封邊，37°C雜交過夜； 4) 信號檢測 室溫下2XSSC液浸泡制片，洗去蓋片，含0. 1 wt % SDS的2 XSSC浸洗3次，每 次5min ;然后用蒸饋水沖洗一遍，避光瞭干；在制片標記區滴入4μ L含4Pg/mL DAPI的 Vectashield H1000,加蓋片置于Nikon 80i突光顯微鏡下，根據制片坐標確定目標染色體， 觀察雜交信號，冷光源CCD下進行圖像采集，采用Spot Rtke 4.1軟件進行圖像合成，并利 用Adobe Photoshop 7.0軟件對圖像進行調整。
2. 如權利要求1所述的芝麻染色體熒光原位雜交方法，其特征在于，步驟A染色體標本 的制備具體為： 1) 根尖培養 選取健康芝麻種子，播于鋪有濕濾紙的培養皿中，21 °C暗培養至根長1. 2 - 1. 8cm ; 2) 根尖處理 切取4 一 5mm含分生區的根尖置于玻瓶中，浸入0. 002 Μ 8-羥基喹啉于21°C暗處理 1. 5h，倒出液體，直接加入由體積比為3:1的無水甲醇和冰乙酸組成的固定液4°C固定lh ; 取出根尖于蒸餾水中清洗2 - 3次，切取根尖分生區于蒸餾水中浸泡10 - 20min，然后 按每10個根尖分生區加入2〇μ1含2. 5%纖維素酶和2. 5%果膠酶的混合酶液于37°C水浴中 酶解2 - 3h ;取出根尖分生區，蒸餾水洗去酶液，然后蒸餾水中浸泡10 - 20min ;然后將根 尖分生區再次移至固定液中4°C固定lh ; 3) 涂片 用膠頭滴管吸取根尖分生區，置于已于4°C預冷的干凈玻片上，用尖頭鑷子尖端將根尖 分生區敲碎制成局部細胞懸液；然后滴加固定液使懸液分散于整個玻片，自然瞭干； 4) 染色 玻片倒置于一玻璃板上，兩端用毛細管支起，使玻片與玻璃板之間留有空隙，將吉姆薩 染液注入此空隙，染色15min，然后自來水沖洗，自然晾干； 5) 鏡檢 在Nikon 80i熒光顯微鏡下，挑選處于有絲分裂中期的染色體制片，在背面標記目的 染色體所在范圍，即標記區，記錄其在玻片上對應的坐標位置。
3. 如權利要求1所述的芝麻染色體熒光原位雜交方法，其特征在于，將雜交后的制片 標本進行后處理用以重復利用，具體為：揭去蓋片后，用含0. 2% Tween20的2XSSC浸洗 10min，然后蒸餾水沖洗一次，自然晾干，重復上述C步驟中的變性、脫水處理，即可用于另 一組探針的原位雜交檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099416SQ201410322009
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月8日 優先權日:2014年7月8日
【發明者】張海洋, 苗紅梅, 趙瑞紅, 李春, 馬琴, 魏利斌, 段迎輝 申請人:河南省農業科學院芝麻研究中心