一種檢測黃曲霉及煙曲霉的通用引物及實時熒光tHDA試劑盒的制作方法

一種檢測黃曲霉及煙曲霉的通用引物及實時熒光tHDA試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測煙曲霉及黃曲霉的通用引物及實時熒光tHDA試劑盒。本發(fā)明的檢測煙曲霉及黃曲霉的通用引物能夠同時檢測擴增出煙曲霉及黃曲霉，同時結(jié)合了實時熒光tHDA技術(shù)，較其他普通的PCR相比，能夠在恒溫下進行擴增，省去了變性、退火、延伸等步驟，直接模擬生物體環(huán)境進行解旋擴增，有利于簡化設(shè)備，利于在基層推廣。使用本發(fā)明的試劑盒，其檢測限可達到104copies(拷貝)/ml，可用于臨床。能夠檢測出臨床上最常見的兩種曲霉菌感染，不但為臨床節(jié)省大量寶貴的搶救時間，而且成本低廉、操作方便，具有廣闊的運用前景。
【專利說明】-種檢測黃曲霉及煙曲霉的通用引物及實時熒光tHDA試 劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外診斷核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及一種在臨床樣本中檢測煙曲霉和黃 曲霉感染的熒光tHDA(熱穩(wěn)定解旋酶依賴性恒溫擴增）試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著腫瘤患者的增多、化療藥物、免疫抑制劑和廣譜抗生素的廣泛使用， 特別的是在惡性血液性疾病、骨髓移植中，侵襲性真菌感染的發(fā)生率明顯增高，曲霉菌感染 是僅次于念珠菌感染的侵襲性真菌感染且逐年上升。有研究表明肺部曲霉菌感染的病死率 為40%，泛發(fā)性曲霉感染為病死率為90%。在反復(fù)運用氟康唑預(yù)防真菌感染的尸檢病例中 曲霉已成為首要的致病囷，而在惡性血液病患者尸檢中發(fā)現(xiàn)曲霉囷感染率商達30%。在中 國大陸的一項統(tǒng)計資料表明，在侵襲性曲霉感染中，煙曲霉與黃曲霉占86. 82%，成為曲霉 菌感染的主要病原菌（高露娟，余進，李若瑜.中國大陸地區(qū)曲霉病流行現(xiàn)狀分析[J]. 中國真菌學(xué)雜志，2010, 04:247-251)。
[0003] 對于侵襲性曲霉感染，早期診斷不僅能夠減少病死率，而且能夠減少醫(yī)療費用及 住院天數(shù)，而目前，侵襲性曲霉菌感染的診斷主要依賴于傳統(tǒng)的實驗室診斷方法，包括：直 接涂片鏡檢、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法、組織病理學(xué)方法、影像學(xué)方法、血清學(xué)方法等，然而這些方 法，每種方法均存在缺乏敏感性或特異性，而不能滿足臨床診療的需要。因此，以基因組DNA 為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷方法倍受關(guān)注，成為國內(nèi)外研究者的探索熱點。近來，研究人員報 道了許多應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)（Real-time PCR)檢測致病性真菌的特異核酸序列的研 究，提出了實時定量PCR檢測方法可以很好地用來快速準(zhǔn)確地診斷侵襲性真菌感染。然而， 實踐表明，實時定量PCR檢測方法存在著一些不足之處，例如：1)須要昂貴的PCR儀，尤其 是實時熒光PCR儀造價不菲；2)多種因素影響擴增效果；3)常引起非特異性擴增，難以在 基層推廣應(yīng)用等，亟待更新的方法來替代。
[0004] 解旋酶依賴性恒溫核酸擴增（helicase dependent amplification, HDA)，其原理 是根據(jù)解旋酶在ATP存在下能夠解開DNA雙鏈，隨后兩條特異性引物結(jié)合于單鏈DNA并在 DNA聚合酶的作用下催化合成雙鏈，并將此次合成的DNA雙鏈作為模版依次擴增實現(xiàn)指數(shù) 倍的擴增。采用研究表明，HDA能很好地擴增微生物基因組DNA、質(zhì)粒DNA和cDNA等。目 前根據(jù)所采用的解旋酶的不同，可以分為1、室溫HDA，采用大腸桿菌解旋酶和Mutl蛋白在 常溫下即可；2、熱穩(wěn)定 HDA (thermophilic helicase dependent amplification，tHDA)，從 嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定解旋酶，此過程較室溫HDA相比不需要Mutl蛋白及單鏈結(jié)合蛋白 (SSB)。本發(fā)明是采用tHDA作為擴增方法，在較高的溫度下擴增反應(yīng)可以減少非特異性擴 增，同時更有利于解旋酶進行DNA解旋（CN03824150. 1)。
[0005] 作為一種嶄新的核酸擴增方法，與普通PCR技術(shù)相比，該方法具有不需要經(jīng)過變 性-退火-延伸的多次循環(huán)擴增，可以簡化設(shè)備、降低成本更有利于在偏遠(yuǎn)地區(qū)的推廣運用 的巨大優(yōu)勢。另外，較其他常見的恒溫擴增技術(shù)也具有相應(yīng)優(yōu)勢，如：鏈替換擴增（SDA)需 要4條引物來實現(xiàn)早期擴增，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增（TMA)在轉(zhuǎn)錄、cDNA合成以及RNA降解過程 需要三種酶來實現(xiàn)恒溫的擴增。
[0006] 實時熒光tHDA是tHDA技術(shù)與熒光定量技術(shù)的結(jié)合。僅利用tHDA擴增技術(shù)對終 產(chǎn)物進行定性或定量分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，而實時熒光tHDA技術(shù)利用熒光信號 的變化實時監(jiān)測HDA擴增反應(yīng)中每一循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值及其標(biāo)準(zhǔn)曲線的分 析能夠?qū)ζ鹗寄０暹M行定量分析。但是，目前國際上對tHDA擴增技術(shù)處于起步階段，雖現(xiàn) 有利用tHDA擴增技術(shù)運用于曲霉菌的檢測（王小婷.解旋酶依賴性DNA恒溫擴增技術(shù)用 于黃曲霉檢測的研究[D].福建醫(yī)科大學(xué)，2012.)，但其敏感性較低，并且無法定量分析起 始模板，目前國內(nèi)外尚未有將實時熒光tHDA技術(shù)運用于曲霉菌的檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對上述問題，本發(fā)明首次建立起一種快速檢測曲霉菌的實時熒光tHDA技術(shù)，從 而更有利于建立簡單便捷的臨床和實驗室診斷，也使對于基因?qū)用娴拇才詸z驗成為可能。
[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供一組作為引物使用的，能夠同時檢測出煙曲霉及黃曲霉 的寡核苷酸序列。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種既快速、準(zhǔn)確，又易于標(biāo)準(zhǔn)化的能夠檢測煙曲霉 及黃曲霉的實時熒光定量tHDA試劑盒。
[0010] 具體而言，一方面，本發(fā)明提供一組檢測曲霉菌的引物，該組引物包括序 列表SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示的寡核苷酸序列。其中，擴增檢測曲霉 菌的正向引物為：TGCATTTAATAGCAATGCACGATAC ;擴增檢測曲霉菌的反向引物為： CAAAGTAAGGAGCGAAAGGTAATCTA 〇
[0011] 為解決所述第二個技術(shù)問題，本發(fā)明采用的檢測曲霉菌的實時熒光tHDA試劑盒， 保存于-20°C。包括DNA提取劑，tHDA反應(yīng)液，酶混合物，dNTP，熒光染料：包括EvaGreen Dye和ROX reference Dye (其為市售染料名稱，目前尚無統(tǒng)一中文譯文）；滅菌純水；陰性 對照：無插入有特異性片段的PUC18-T載體質(zhì)粒；陽性對照：含有煙曲霉或黃曲霉DNA樣 本；標(biāo)準(zhǔn)品：含有插入有曲霉的特異性片段的PUC18-T載體質(zhì)粒。本發(fā)明將采用EvaGreen Dye作為實時熒光定量的染料，該染料與常用的熒光定量染料相比，具有良好的穩(wěn)定性，對 擴增反應(yīng)的抑制性也小。
[0012] 所述的標(biāo)準(zhǔn)品為含有插入曲霉菌特異序列的PUC18-T載體質(zhì)粒，所插入的序列如 下：
[0013] GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTAT TACTAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATA ATGCTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTA ATAGCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCC TTACTTTGTATTTAAAGATTTAGTTACTGTATTTATTTTCTTTATAGTATTATCTGTATTTGTATTCTTCATGCCTA ACGCATTAGGTGATAGTGAAAATTATGTTATGGCTAATCCAATGCAAACTCCACC
[0014] 所插入的DNA序列為采用正向引物序列（GATGGCTACAGCTTTCTTAGGT)、反向引物序 列（GGTGGAGTTTGCATTGGATTAG)為擴增引物，并以煙曲霉DNA為模板進行普通PCR擴增所 得擴增產(chǎn)物。該擴增產(chǎn)物包含有以通用引物tHDA擴增的特異性DNA序列。標(biāo)準(zhǔn)品制備方 法是將擴增的產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳并利用微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回 收。然后回收產(chǎn)物lul加入至50 μ 1感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30分鐘。然后42°C熱擊45秒，迅 速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。加入450 μ 1無菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置于 37°C搖床，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)45分鐘，使菌體復(fù)蘇。取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到 含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固體培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于 37°C，直至液體被吸收后，倒置培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)12-16小時。挑選白色菌落進行進一步增殖 培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并通過PCR反應(yīng)鑒定及測序驗證，再用紫外分光光度計定量并-20°C保存作 為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0015] 所述的標(biāo)準(zhǔn)品為稀釋濃度IX 108拷貝（copies)/ml、IX 107拷貝/ml、IX 106拷貝 /ml、IX 105 拷貝 /ml、IX 104 拷貝 /ml 及 IX 103 拷貝 /ml ;
[0016] 所述的陰性對照品為無插入的曲霉菌的序列的載體質(zhì)粒。
[0017] 二、試劑盒的試劑組成成分：
[0018] 1. DNA 提取試劑：Buffer I、Buffer II、Buffer III、溶壁酶（Lyticase)、蛋白酶 K ;
[0019] 2. tHDA反應(yīng)液，其中包括：tHDA緩沖液、MgS04、NaCl、dNTP、引物I、引物II ;其中 所述的引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :2 所示；
[0020] 3.酶混合物，其中包括：熱穩(wěn)定DNA解旋酶，Bst聚合酶和極高熱穩(wěn)定性單鏈結(jié)合 蛋白；
[0021] 4.突光染料：包括 EvaGreen Dye 和 ROX reference Dye ;
[0022] 5.陰性對照：無插入曲霉的特異性片段的pUC18-T載體質(zhì)粒；
[0023] 6.陽性對照：為含有煙曲霉或黃曲霉DNA樣本；
[0024] 7.標(biāo)準(zhǔn)品：為插入有曲霉的特異性片段的pUC18-T載體質(zhì)粒；
[0025] 8.滅菌純水；
[0026] 三、根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，對人血流感染的曲霉菌感染進行檢測，該方法步驟 包括：
[0027] 1.用DNA提取試劑進行待測樣本的DNA提??；
[0028] 2.將提取的DNA和定量標(biāo)準(zhǔn)品加入到含有tHDA反應(yīng)液中進行實時熒光tHDA擴 增，使用實時熒光PCR儀進行檢測；
[0029] 3.利用定量標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過軟件分析確定待測樣品對應(yīng)濃度。
[0030] 本發(fā)明中所指的曲霉菌為煙曲霉和黃曲霉。
[0031] 本發(fā)明中通過對不同的真菌及臨床上常見的細(xì)菌進行了特異性分析，結(jié)果顯示具 有良好的特異性。
[0032] 本發(fā)明通過對標(biāo)準(zhǔn)品進行稀釋分析，可以達到104拷貝/ml。
[0033] 本發(fā)明是采用了實時熒光tHDA方法檢測曲霉菌感染。能夠?qū)崟r監(jiān)控，閉管檢測， 具有快速簡便、靈敏度高等特點（能夠達到1〇 4拷貝/ml)，通過標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以 快速的測定判斷樣本中是否含有并含有相應(yīng)的煙曲霉或黃曲霉。同時采用空白對照可以有 效的扣除可能發(fā)生感染的，在加樣規(guī)程中進行了質(zhì)量控制，能夠判斷是否在加樣中發(fā)生了 污染。通過快速的鑒定可以為臨床的決策判斷提供有效的證據(jù)，及時合理的運用抗生素，減 少耐藥的產(chǎn)生，同時減少患者的住院費用及時間。
[0034] 本發(fā)明具有的有益結(jié)果如下：
[0035] 1.本發(fā)明首次將tHDA擴增方法結(jié)合應(yīng)用于曲霉菌的檢測，有利于簡化儀器，節(jié)約 儀器研發(fā)的成本投入，更有利于在基層的開展以及運用，也為基因?qū)用娴拇才詸z驗提供思 路；
[0036] 2.本發(fā)明結(jié)合熒光tHDA技術(shù)，采用發(fā)明人創(chuàng)新設(shè)計的用于煙曲霉及黃曲霉的通 用引物檢測臨床上最常見的曲霉，可以同步對兩種常見的曲霉菌進行檢測，能夠為臨床侵 襲性真菌感染早期病原體診斷提供依據(jù)，以便早期及時的制定治療方案，為患者的及時準(zhǔn) 確的提供強大的證據(jù)支持，減少患者的醫(yī)療費用以及縮短患者的住院時間；本發(fā)明的發(fā)明 人也嘗試驗證其他引物進行曲霉的檢驗，但均未獲得同樣效果。
[0037] 3.本發(fā)明的實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的引物和試劑盒具有良好的靈敏度及特異性， 同時檢測速度快，步驟簡單，可重復(fù)性高，在臨床診斷上具有強大的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1為以煙曲霉DNA擴增模板為例的實時熒光tHDA擴增的設(shè)置條件；
[0039] 圖2為標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光tHDA定量的擴增曲線，針對的模板數(shù)為104?108拷貝/ml 進行的tHDA分析，圖中的橫坐標(biāo)代表擴增的循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光強度，其中1-5分別代 表標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線，針對不同的拷貝數(shù)；
[0040] 圖3為標(biāo)準(zhǔn)品實時突光tHDA定量檢測在Standard Curve標(biāo)簽下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖 中橫坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)品濃度（拷貝/ml)，縱坐標(biāo)代表閾值循環(huán)數(shù)，標(biāo)記代表檢測的樣本；
[0041] 圖4為標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光tHDA定量檢測的溶解曲線，橫坐標(biāo)表示溫度（tHDA產(chǎn)物熔 解溫度），縱坐標(biāo)是表示熒光強度/溫度的導(dǎo)數(shù)值（Derivative)。圖中的每一條曲線代表 樣本的溶解曲線，僅有單一峰出現(xiàn)表示該擴增產(chǎn)物具有較好的特異性，無引物二聚體形成。
[0042] 圖5為通用引物tHDA擴增特異性分析電泳圖。

【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明所用的真菌購買于中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學(xué)真菌中心，細(xì)菌標(biāo) 本均為從臨床中分離得到的常見的細(xì)菌，人類標(biāo)本為臨床收集。
[0044] 實施例1 :曲霉tHDA引物設(shè)計與合成
[0045] 根據(jù)Genbank中煙曲霉的線粒體基因序列，選擇曲霉的保守序列，通過IDT在線 引物設(shè)計進行設(shè)計引物，得到用于tHDA擴增的通用曲霉引物包括正向引物（其序列為 TGCAITTAATAGCAATGCACGATAC)和反向引物（其序列為 TGCAITTAATAGCAATGCACGATAC)引物 由上海英濰捷基公司合成。
[0046] 實施例2 :構(gòu)成檢測侵襲性曲霉菌的熒光定量tHDA快速診斷試劑盒制備。該試劑 盒包括DNA提取劑、實時熒光定量tHDA反應(yīng)液及質(zhì)粒模板定量標(biāo)準(zhǔn)品
[0047] 一、DNA提取劑，其包括如下組分：
[0048] 1.8肛作1'1:其為細(xì)胞裂解液，包括0.5%的十二烷基硫酸鈉（505)，0.1111 〇1/1 恥(：1，0.05111〇1/11'1^8-(：1&!17.6)，1臟〇1/1乙二胺四乙酸出0了八）；
[0049] 2.Buffer II :其為真菌破壁液，包含有500mmol/L Tris ;10mmol/L EDTA ;1% β - 疏基乙醇；
[0050] 3. Buffer III為苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1);
[0051] 4.蛋白酶 K(10U/ul);
[0052] 5.溶壁酶 lyticase(10U/ul);
[0053] 二、實時熒光定量tHDA反應(yīng)液
[0054] tHDA反應(yīng)液包括：10XtHDA緩沖液、20uM正向引物、20uM反向引物、lOOmM MgS04、 500mM NaCl、dNTP 混合液、酶混合液、2ul Evagreen20X、lul ROX reference Dye;
[0055] 1.其中 lOXtHDA 緩沖液含有 lOmM KCl、20mM Tris-HCl(25。C 時 pH8. 8);
[0056] 2.其中 dNTP 為 4. 28mM dCTP，4. 28mM dGTP，61. 4mM dATP, 4. 28mM dTTP ;
[0057] 3.其中酶混合液為lOU/ul Bst DNA聚合酶、3. 3ng/ul熱穩(wěn)定DNA解旋酶（購自 biohelix公司）、8. 3ng/ul極高熱穩(wěn)定性單鏈結(jié)合蛋白（購自北京NEB公司）。
[0058] 三、標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0059] 本步驟中采用質(zhì)粒用于定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備。采用正向引物序列 (GATGGCTACAGCTTTCTTAGGT)、反向引物序列（GGTGGAGITTGCATTGGATTAG)為擴增引物，并以 煙曲霉為DNA模板進行普通PCR擴增。該擴增產(chǎn)物包含有以通用引物tHDA擴增的DNA序 列。將擴增的產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳并利用微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行 回收。然后將回收得到的DNA利用TA連接試劑盒進行連接。首先將回收產(chǎn)物lul加入至 50 μ 1感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30分鐘。然后42°C熱擊45秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上 靜置2-3分鐘。加入450 μ 1無菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置于37°C搖床，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培 養(yǎng)45分鐘，使菌體復(fù)蘇。取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB 固體培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于37°C，直至液體被吸收后，倒 置培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)12-16小時。挑選白色菌落進行進一步增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并通過PCR反 應(yīng)鑒定及測序驗證，再用紫外分光光度計定量并-20°C保存作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0060] 實施例3實時熒光定量tHDA進行曲霉菌檢測的敏感性及特異性分析
[0061] 本實施例對實時熒光定量tHDA敏感性分析通過檢測不同梯度下的陽性標(biāo)準(zhǔn)品， 得到最低陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為敏感性的指標(biāo)，特異性分析則通過以實驗室提取的真菌、細(xì) 菌標(biāo)本及人類DNA作為擴增模板，觀察是否能夠非特異性擴增。
[0062] 一、取若干反應(yīng)管，分別作為敏感性分析及特異性分析檢測，tHDA體系的加樣量按 表1進行，實時熒光tHDA定量分析采用ABI7500定量儀進行檢測。
[0063] 表1為實時熒光定量tHDA反應(yīng)體系
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 一組檢測煙曲霉及黃曲霉的通用引物，其特征在于，所述通用引物包括正向引物和 反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，所述反向引物的核苷酸 序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
2. -種檢測曲霉菌感染的實時熒光tHDA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組 分： (1) DNA提取試劑； (2) tHDA反應(yīng)液，其中包括：tHDA緩沖液、1%504、似(：1、(1階1\引物1、引物11，其中，所述 引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，所述引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2 所示； (3) 酶混合物，其中包括：熱穩(wěn)定DNA解旋酶、Bst聚合酶和熱穩(wěn)定性單鏈結(jié)合蛋白ET SSB ； (4) 熒光染料； (5) 陰性對照：為無插入煙曲霉或黃曲霉的特異性片段的pUCIS-T載體質(zhì)粒； (6) 陽性對照：為含有煙曲霉或黃曲霉DNA的樣本；； (7) 標(biāo)準(zhǔn)品：為插入有煙曲霉或黃曲霉的特異性片段的pUCIS-T載體質(zhì)粒； (8) 滅菌純水。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑包括：Buffer I， Buffer II, Buffer III，蛋白酶K，溶壁酶（lyticase);所述突光染料包括：EvaGreen Dye和 ROX reference Dye。
4. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品中插入的特異性序列如下： GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTATTAC TAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATAATG CTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTAATA GCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCCTTA CTTTGTATTTAAAGATTTAGTTACTGTATTTATTTTCTTTATAGTATTATCTGTATTTGTATTCTTCATGCCTAACG CATTAGGTGATAGTGAAAATTATGTTATGGCTAATCCAATGCAAACTCCACC〇
5. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度為1 X 108拷貝/ml、 1 X107 拷貝 /ml、1 X106 拷貝 /ml、1 X105 拷貝 /ml、1 X104 拷貝 /ml、1 X103 拷貝 /ml。
6. -種檢測真菌感染的tHDA方法，用于對黃曲霉和/或煙曲霉感染進行檢測，其特征 在于，包括如下步驟： (1) 提取樣品的DNA ; (2) 以步驟（1)所得DNA為模版，利用權(quán)利要求1所述通用引物進行實時熒光tHDA擴 增，該實時熒光tHDA擴增具體包括： 第一步：在61°C下預(yù)熱2min，然后61°C下擴增2min，并收集熒光，進行45個擴增循環(huán)， 以獲得Ct值和擴增曲線； 第二步：使用實時熒光PCR儀器系統(tǒng)進行溶解曲線分析，以獲得相應(yīng)溶解曲線。 (3) 對分析結(jié)果進行判定，該步驟包括： 如果Ct值< 45并且> 0,并出現(xiàn)特定的S型擴增曲線，同時溶解曲線出現(xiàn)單一峰值，并 且單一峰在退火溫度附近，則判定樣本中存在煙曲霉或黃曲霉，進而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所繪制的 標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣品中黃曲霉或煙曲霉的DNA拷貝數(shù)； 如果Ct值< 0,并且無擴增曲線，則判定樣本中無煙曲霉及黃曲霉； 如果陽性對照組中不出現(xiàn)特定的S型擴增曲線和/或Ct值，或者陰性對照中出現(xiàn)特定 的S型曲線和/或Ct值，則判定此次擴增無效。
7.如權(quán)利要求6所述的tHDA方法，其特征在于，所述步驟（2)中的HDA擴增體系為： lOXtHDA緩沖液5ul，DNA序列如SEQ ID NO :2所示的引物I 0. 75ul、DNA序列如SEQ ID N0:2 所示的引物 II0.75ul，模版DNA4ul，4mM MgS04、40mM NaCl、0.4mM dNTP、4mM dATP、30U Bst DNA聚合酶、lOng熱穩(wěn)定DNA解旋酶、25ng熱穩(wěn)定性單鏈結(jié)合蛋白、2ul EvaGreen Dye、 lul ROX reference Dye，加滅菌純水至 50ul。
【文檔編號】C12Q1/04GK104087665SQ201410320294
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】沈建箴, 肖世極, 吳淡森, 付海英, 周華蓉, 黃金梅, 黃勁龍, 王小婷, 張勝藍(lán) 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院