基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的ssr引物組及其在種質鑒定中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一套基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的SSR引物組及其在種質鑒定中的應用，屬于分子生物學【技術領域】。本發明所述SSR引物組有42對引物，其中第1至42對引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1至SEQ?ID?No.84所示。實驗證實：本發明獲得的SSR引物組具有多態性豐富、重復性好、電泳條帶清晰等優點，該SSR引物組可有效用于種質鑒定和DNA指紋圖譜構建等研究，且方法靈敏、可靠，能快速準確地實現和完成白蠟種質的區分和鑒別，對我國白蠟種質資源的鑒定、知識產權保護以及促進白蠟分子遺傳育種具有重要意義。
【專利說明】基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的SSR引物組及其在種 質鑒定中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一套基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的SSR引物組及其在種質鑒 定中的應用，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 絨毛白錯（Fraxinus Velutina Torr.)為木犀科（leaceae)白錯屬（Fraxinus Linn.)落葉喬木，原產于美國，1911年引入我國山東濟南（孟昭和等，2001)，速生、美觀、抗 逆，已成為我國華北、華東主要沿海城市園林綠化樹種和優良鹽堿地造林樹種（時明芝， 1996 ;王勤等，2000 ;倪國祥等，1995 ;王友平等，2007)，也是唯一的鹽堿地大喬木樹種。由 于缺乏大量的多態性分子標記，其遺傳學和基因組學方面的研究滯后于林木樹種楊樹。因 此，查清我國絨毛白蠟種質資源的遺傳背景、開展相應的遺傳學基礎研究、定位重要經濟性 狀是我國白蠟選育工作中首先需要解決的問題。此外，傳統的白蠟分類主要依靠果實形狀 和果翅數目的不同，該分類方法無法有效的在幼樹早期進行應用，同時在還存在著分類混 淆問題，導致目前白蠟命名上存在一些爭議（洪亞平等，2004)。利用分子生物學辦法、建立 有效、快捷的種質鑒別方法對解決我國白蠟樹種間的分類問題與良種早期選育具有重要的 意義。
[0003] 目前在木本植物的遺傳學分析中，應用較多的主要是RAPD，ISSR，AFLP等分子標 記，但是這些標記大多是采用無全基因組序列信息的技術開發得到，雖然具有一定的應用 價值，但是隨機性強、穩定性差。SSR (Simple Sequence repeats)即簡單重復序列，又稱微 衛星DNA(Mierosatellites)，是一種由2-6個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸 的串聯重復序列，存在于絕大多數真核生物基因組中，且分布在整個基因組的不同位置上。 與其他分子標記相比，SSR技術具有共顯性、多態性相對豐富、基因組覆蓋較多等特點，且該 技術具有簡便、快速、穩定性高和等位基因多樣性高等優點，是目前進行遺傳多樣性分析、 遺傳圖譜構建、品種鑒定和DNA指紋圖譜構建等研究的首選標記（Maetal. 2004 ;吳曉雷等， 2001)。由于林木自身固有的長周期育種特性，分子標記在林木育種研究中應用將更加廣 泛。隨著測序技術的發展和成本的降低，部分木本樹種已完成轉錄組測序，在此基礎上便于 對這些植物進行轉錄組SSR標記的挖掘和分析。白蠟與楊樹、茶樹等木本植物相比，目前報 道的僅有歐洲白蠟SSR標記（只有11對），王建兵等通過EST數據庫開發了具有多態性的 3對絨毛白蠟SSR標記（2014年），數量極少，遠不能滿足白蠟研究的需要，因此大量開發 SSR標記仍是目前白蠟研究的重要工作之一。鑒于此，開發基于白蠟轉錄組序列的SSR引物 組，將有助于高效的構建白蠟的遺傳圖譜，開展與重要經濟性狀相關的QTL定位，從而推動 白蠟分子標記輔助育種的進程。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術的不足，本發明的目是提供一套基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發 的SSR引物組及其在種質鑒定中的應用。
[0005] 本發明所述的基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的SSR引物組，其特征在于，該 SSR引物組有42對引物，其中：
[0006] 第1對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的反向引物序列組成，
[0007] 第2對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的反向引物序列組成，
[0008] 第3對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示的反向引物序列組成，
[0009] 第4對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示的反向引物序列組成，
[0010] 第5對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示的反向引物序列組成，
[0011] 第6對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 12所示的反向引物序列組成，
[0012] 第7對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 14所示的反向引物序列組成，
[0013] 第8對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 16所示的反向引物序列組成，
[0014] 第9對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 18所示的反向引物序列組成，
[0015] 第10對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 20所示的反向引物序列組成，
[0016] 第11對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 22所示的反向引物序列組成，
[0017] 第12對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 24所示的反向引物序列組成，
[0018] 第13對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 25所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 26所示的反向引物序列組成，
[0019] 第14對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 27所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 28所示的反向引物序列組成，
[0020] 第15對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 29所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 30所示的反向引物序列組成，
[0021] 第16對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 31所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 32所示的反向引物序列組成，
[0022] 第17對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 33所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 34所示的反向引物序列組成，
[0023] 第18對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 35所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 36所示的反向引物序列組成，
[0024] 第19對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 37所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 38所示的反向引物序列組成，
[0025] 第20對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 39所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 40所示的反向引物序列組成，
[0026] 第21對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 41所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 42所示的反向引物序列組成，
[0027] 第22對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 43所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 44所示的反向引物序列組成，
[0028] 第23對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 45所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 46所示的反向引物序列組成，
[0029] 第24對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 47所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 48所示的反向引物序列組成，
[0030] 第25對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 49所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 50所示的反向引物序列組成，
[0031] 第26對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 51所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 52所示的反向引物序列組成，
[0032] 第27對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 53所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 54所示的反向引物序列組成，
[0033] 第28對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 55所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 56所示的反向引物序列組成，
[0034] 第29對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 57所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 58所示的反向引物序列組成，
[0035] 第30對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 59所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 60所示的反向引物序列組成，
[0036] 第31對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 61所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 62所示的反向引物序列組成，
[0037] 第32對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 63所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 64所示的反向引物序列組成，
[0038] 第33對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 65所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 66所示的反向引物序列組成，
[0039] 第34對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 67所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 68所示的反向引物序列組成，
[0040] 第35對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 69所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 70所示的反向引物序列組成，
[0041] 第36對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 71所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 72所示的反向引物序列組成，
[0042] 第37對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 73所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 74所示的反向引物序列組成，
[0043] 第38對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 75所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 76所示的反向引物序列組成，
[0044] 第39對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 77所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 78所示的反向引物序列組成，
[0045] 第40對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 79所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 80所示的反向引物序列組成，
[0046] 第41對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 81所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 82所示的反向引物序列組成，
[0047] 第42對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 83所示的正向引物序列和核苷酸序列如 SEQ ID No. 84所示的反向引物序列組成。
[0048] 具體的，各對引物的核苷酸序列見如下列表。
[0049] SEQ ID No. Primer Forward primer sequence Reverse primer sequence I、 2 1 CAAACATGTTCTTCAGCAACAGA CAGTTCCTCCCCTTATTGCTAGT 3、 4 2 AACATGTTCTTCAGCAACAGACA TTCCTCCCCTTATTGCTAGTCTT 5、 6 3 CAAACATGTTCTTCAGCAACAGA TTCCTCCCCTTATTGCTAGTCTT I、 8 4 AACATGTTCTTCAGCAACAGACA CTTATTGCTAGTCTTGGACAGGC 9, l〇 5 TCGTTTCTAAAAGCTGCTCAGTC GAGTAAAGTGGCGGATTAGACAGT II、 12 6 GCTCAGTCAGATGTAATGAGCM GTGGAGTMAGTGGCGGATTAG 13、 14 7 GCTCAGTCAGATGTAATGAGCAA GAGTAAAGTGGCGGATTAGACAGT 15、 16 8 CCATAAACAGCAAAATTTCAAGC GAGGGAATTAACATTTACCAGGC 17、 18 9 TTTCAAGCTGAAAACACCAATTT GAGGGAATTAACATTTACCAGGC 19、 20 10 AAATTTCAAGCTGAAAACACCAA GAGGGAATTAACATTTACCAGGC 2K 22 11 AAAATTTCAAGCTGAAAACACCA GAGGGAATTAACATTTACCAGGC 23, 24 12 CMAATTTCMGCTGAAMCACC GAGGGAATTAACATTTACCAGGC 25、 26 13 GAACAACAATACTGTCAGCAACG GCTTTCTCGTTGAGTTCATTGTC 27、 28 14 AACAACAATACTGTCAGCAACGA TCTCGTTGAGTTCATTGTCTCTG 29、 30 15 GAACAACAATACTGTCAGCAACG TCTCGTTGAGTTCATTGTCTCTG -31、32 16 AACAACAATACTGTCAGCAACGA CGTTGAGTTCATTGTCTCTGGAT -33、34 丨 7 ATTAAGCCACCAAGCAACTACTG TAGCACCCGAATAGTAAGGATCA 35, 36 18 ATTAAGCCACCAAGCAACTACTG CACCCGAATAGTAAGGATCAACA 37, 38 丨9 ATTAAGCCACCAAGCAACTACTG TCCTAGAGAGAACCTTCGGGTAG 39、 40 20 ATTAAGCCACCAAGCAACTACTG ATCCTAGAGAGAACCTTCGGGTA 41、 42 21 TCACAATCCAATTTACACCATCA GAGATTGCTTAGAGCCAGAGGAC 43、 44 22 TCACAATCCAATTTACACCATCA GAGATTGCTTAGAGCCAGAGGA 45、 46 23 TCACAATCCAATTTACACCATCA AGATTGCTTAGAGCCAGAGGAC 47、48 24 TTTCAAGTAGGATGATGAACAACAA GGAAGAGGAGAAAGCTAGAATGC
[0050] 49、 50 25 CCAACAAAAGGAGCAAGATAAAA ACATGAGATGGCTGAGAAATGTT 51、 52 26 CCAACAAAAGGAGCAAGATAAAA ATGTTACTAGCTTCCCCTTGACC 53、 54 27 CCAACAAAAGGAGCAAGATAAAA TCGAACTTGAACTGTAATCACGA 55、 56 28 GAAAGGAGAAAGGCATTAAGCAG ACATGAGATGGCTGAGAAATGTT 57、 58 29 AGAAAGGAGAAAGGCATTAAGCA ACATGAGATGGCTGAGAAATGTT 59、60 30 MGCATGAMGCTTACTCGAAAA CTTGATCTTCTCCTTCAAACCCT 61、 62 31 AAAGCATGAAAGCTTACTCGAAA CTTGATCTTCTCCTTCAAACCCT 63、 64 32 AAAAGCATGAAAGCTTACTCGAA CTTGATCTTCTCCTTCAAACCCT 65, 66 33 AAGCTTACTCGAAAAGCTCCAAC CTTGATCTTCTCCTTCAAACCCT 67, 68 34 CTCTTCGAGTGATGAGGAAGAAG CCAGATATCTTCCCCTTGATCTT 69、 70 35 AAAATCTTGCTCGGAAAAATCAG AGGTCAACTTGTGAAACTCGAAG 71、 72 36 AAAATCTTGCTCGGAAAAATCAG AACATTTTCCACCACTAGGTCAA 73、 74 37 AAAATCTTGCTCGGAAAAATCAG GAACATTTTCCACCACTAGGTCA 75、 76 38 AAAATCTTGCTCGGAAAAATCAG TGAACATTTTCCACCACTAGGTC 77、 78 39 AAAATCTTGCTCGGAAAAATCA AGGTCAACTTGTGAAACTCGAAG 79、 80 40 TCAGCATTTAGAACTGAAAAACA AAATTAAGAATTACAAGCGGGGA SK 82 41 TCAGCATTTAGAACTGAAAAACA GAAATTAAGAATTACAAGCGGGG 83, 84 42 TCAGCATTTAGAACTGAAAAACA ATGAGATGAAAAACAACAATCCG
[0051] 本發明所述基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的SSR引物組在白蠟種質鑒定中 的的應用。
[0052] 其中，利用所述的SSR引物組進行白蠟種質鑒定的方法是：
[0053] (l)DNA提取：利用改良的CTAB法提取待測白蠟樣品基因組DNA ;
[0054] (2) SSR-PCR 擴增：
[0055] 以步驟⑴提取的DNA樣品為模板，采用如序列表SEQ ID No. 1-84所示引物進行 SSR-PCR 擴增；
[0056] SSR-PCR 采用 10ul 反應體系：25mmol · 1-1]\%2+0· 8μ 1、10μπιο1 · Γ1 引物 0· 2μ 1、 lOmmol · ΓΜΝΤΡΟ. 3μ 1、5U · μ llaq 酶 0· 05μ l、5-10ng · μ 1-1DNA 模板 2· 00μ 1、10XPCR 緩沖液 1· 〇μ 1，ddH205. 45 μ 1 ;
[0057] PCR 反應條件為 94°C 預變性 3min，94°C 變性 lmin，54°C -58°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin，共35個循環；最后72°C延伸5延伸lmin，4°C lOmin終止反應；
[0058] (3)電泳檢測及統計：將步驟（2)的SSR-PCR擴增產物用聚丙烯酞胺凝膠電泳分 離，銀染法染色，照相并統計帶型，某位置若有條帶記為1，若無則記為0,以此方式建立供 試材料SSR基因型信息數據庫，進行白蠟種質鑒定分析。
[0059] 進一步的，步驟（3)中所述的聚丙烯酞胺凝膠電泳的方法是：將步驟（2) SSR-PCR 擴增后的產物與等體積95 %去離子甲酰胺混勻后，取4μ 1點樣，PCR產物在6 %變性 聚丙烯酰胺凝膠中，60W恒功率電泳2-3h;其中，電極緩沖液為1XTBE，使用10bp DNA Ladder (Invitrogen Inc.)來確定等位基因大小。
[0060] 本發明基于絨毛白蠟轉錄組序列開發的42對多態性的核心SSR引物組具有多態 性豐富、重復性好、電泳條帶清晰的優點，該SSR引物組可有效用于種質鑒定和DNA指紋圖 譜構建等研究，且方法靈敏、可靠，能快速準確地實現和完成白蠟種質的區分和鑒別，對我 國白蠟種質資源的鑒定、知識產權保護以及促進白蠟分子遺傳育種具有重要意義。
[0061] 本發明突出的效果是：1)本發明以提取的白蠟總DNA為鑒定材料，在任何生長時 期和部位取材都不影響反應結果，從而避免對品種鑒別的干擾與影響；2)本發明的42對 SSR引物在白蠟基因組中分布均勻，多態性豐富，擴增穩定，擴增條帶易于鑒定，具有簡便、 快捷、特異等特點；3)通過大量的篩選工作，得到了多態性的核心SSR引物組，進行白蠟 品種鑒定、多樣性評價、親緣關系分析和品種權保護等提供分子水平上的依據，促進了白蠟 遺傳育種水平的提1?和白錯廣業的發展。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0062] 圖1 :引物18對12份白蠟樹種的擴增結果。
[0063] 其中：Μ為Marker ;1為金葉白錯；2為歐洲白錯；3為白柊；4為花曲柳；5為水曲 柳；6為魯蠟6號；7為魯蠟3號；8為魯蠟2號；9為對節白蠟；10為紅葉白蠟；11為中國白 蠟；12為新疆小葉白蠟。
[0064] 圖2 :引物30對12份白蠟樹種的擴增結果。
[0065] 其中：Μ為Marker ;1為金葉白錯；2為歐洲白錯；3為白柊；4為花曲柳；5為水曲 柳；6為魯蠟6號；7為魯蠟3號；8為魯蠟2號；9為對節白蠟；10為紅葉白蠟；11為中國白 蠟；12為新疆小葉白蠟。
[0066] 圖3 :引物42對12份白蠟樹種的擴增結果。
[0067] 其中：Μ為Marker ;1為金葉白錯；2為歐洲白錯；3為白柊；4為花曲柳；5為水曲 柳；6為魯蠟6號；7為魯蠟3號；8為魯蠟2號；9為對節白蠟；10為紅葉白蠟；11為中國白 蠟；12為新疆小葉白蠟。
【具體實施方式】
[0068] 實施例1
[0069] 1、白錯基因組DNA的提取：
[0070] ⑴材料
[0071] 從白錯核心種質材料中選取12份有代表性的種，分別為新疆小葉白錯（Fraxinus sogdiana)、中國白錯（Fraxinus chinensis Roxb)、紅葉白錯（Fraxinus velutina Torr Hongyebaila)、對節白錯（Fraxinus hupehensis)、魯錯 2 號（Fraxinus velutina Torr Lula No. 2)、魯錯 3 號（Fraxinus velutina Torr Lula No. 3)、魯錯 6 號（Fraxinus pennsylvanica Lula No. 6)、7jC 曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr)、花曲柳（Fraxinus rhynchophylla)、 白稃（Fraxinus americana Linn)、歐洲白錯（Fraxinus Excelsior)、金葉白錯（Fraxinus Linn)〇
[0072] 每年5月，取春季剛長出的新鮮葉片，用保鮮袋封存后置于冰盒帶回山東省林業 科學研究院，液氮冷凍后放置于-70°C冰箱中保存待用。
[0073] (2)采用CTAB法提取白蠟葉片基因組DNA
[0074] 1)將配制好的CTAB提取緩沖液置于65°C的水浴鍋中預熱30min，氯仿：異戊醇 (24:1)、無水乙醇、70%乙醇置于-20°C冰箱預冷備用，研缽需提前預冷，使用前再用少量液 氮預冷。
[0075] 2)取0· 1-0. 2g白蠟幼葉，加充足液氮（分兩次加）研磨至粉末狀，迅速轉入2ml 離心管中，加入600 μ 12%的CTAB提取液（含2% β -巰基乙醇），充分混勻。在65°C的水 浴鍋中水浴30min,其間輕輕顛倒3-4次。
[0076] 3)冷至室溫后加入600 μ 1的氯仿：異戊醇（24 :1)抽提lOmin，其間不停地輕輕 地搖動，冷卻至室溫，在12000r · mirT1離心lOmin。
[0077] 4)將上清液（約500 μ 1)轉入另一離心管中，加等體積氯仿：異戊醇（24:1)重復 步驟3。
[0078] 5)取出上清液并移到另一個干凈的1. 5ml的離心管中，再加1ml的預冷無水乙醇 沉淀DNA (_20°C放置30min)，輕輕旋轉離心管，出現絮狀DNA，-20°C放置lh，觀察沉淀生成。
[0079] 6) 8000rmp室溫離心5min，倒掉上清液，沉淀用lml75 %的酒精洗滌兩次，超凈工 作臺靜置乙醇揮發干凈。
[0080] 7)待DNA風干后（DNA不宜過分干燥，否則極難溶解），用適量的TE (PH8. 0、50 μ 1) 或純水溶解，4°C放置6-12h使其充分溶解。
[0081] 8)加入2 μ 1 RNA酶10mg/ml，37°C水浴lh，利用微量分光光度計檢測DNA質量，將 DNA濃度按1:50稀釋，置于-20°C保存備用。
[0082] 2、SSR-PCR 擴增反應
[0083] 以提取的DNA樣品為模板，采用如序列表SEQ ID No. 1-84所示引物進行SSR-PCR擴 增；SSR-PCR 采用 10μ 1 反應體系：Mg2+(25mmol · ΓΟΟ. 8μ 1、引物（ΙΟμπιοΙ · Γ1)。· 2μ 1、 dNTP (lOmmol · Γ1) 0· 3 μ 1、Taq 酶（5U · μ Γ1) 0· 05 μ 1、DNA 模板（5-10ng · μ Γ1) 2· 00 μ L、 10XPCR 緩沖液 1. 0μ 1，ddH205. 45 μ 1 ;PCR 反應條件為 94°C預變性 3min，94°C變性 lmin， 54°C -58°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，共 35 個循環；最后 72°C延伸 5 延伸 lmin，4°C lOmin 終止反應，PCR 反應于 GeneAmp? RCRSystem9700(ABI Inc.)上進行。
[0084] 3、擴增產物的檢測
[0085] PCR產物用6%的變性PAGE電泳檢測，電泳結束后用硝酸銀染色觀察結果，步驟如 下：
[0086] (1)清洗玻璃板：用自來水和洗滌靈把玻璃板反復擦洗干凈，用雙蒸水擦洗兩遍， 再用95%酒精擦洗兩遍，晾干。
[0087] (2)組裝膠板：用無屑紙巾在晾干的長板上均勻涂抹0. 5% Binding Silane，在短 板上均勻涂抹2% Repel Silane。干燥5min之后，將長板涂有Binding Silane的一面與短 板涂有R印el Silane的一面相扣，兩側用夾子夾緊，水平放置。
[0088] (3)灌膠：取 10mL 雙蒸水，加入 8mL20%的 Acr-Bis，2mllOXTBE，8·4g尿素。尿素 溶解以后加入24 μ L TEMED和300 μ L10 %的過硫酸氨（APS)，輕輕混勻，把膠沿灌膠口灌進， 灌膠過程中注意防止出現氣泡。然后插入梳子，靜置使其聚合60min。
[0089] (4)PCR產物電泳前變性處理：PCR反應結束后，產物中加入等體積95%去離子甲 酰胺，點樣前95°C熱變性5分鐘，立即置于冰上，以保證變性后不會立即復性。
[0090] (5)加緩沖液：取出梳子，將聚合好的膠板組裝到電泳槽上，然后將電泳槽連好導 線并將導線接入電泳儀中，再將干凈的IX TBE緩沖液加入電泳槽，注意讓緩沖液沒過梳子 孔。插上電源，在60W恒功率預電泳30min。
[0091] (6)點樣：用移液槍反復沖洗加樣孔，然后將變性后的PCR產物加上6XLoading Buffer3 μ L點樣，每一個加樣孔點樣量為4 μ 1，Marker為2 μ 1，電泳緩沖液為1 X TBE。
[0092] (7)電泳：60W恒功率電泳150min。
[0093] (8)硝酸銀法進行染色：
[0094] 具體步驟為：
[0095] 1)脫色：加入2L固定液，在轉速為60rpm的搖床上輕搖20min至膠完全脫色，
[0096] 2)沖洗：倒出固定液，蒸餾水沖洗3次，每次2-5min,
[0097] 3)染色：加入2L染色液，在轉速為60rpm的搖床上輕搖染色30min ;
[0098] 4)沖洗：用蒸餾水沖洗膠板，不超過5s ;
[0099] 5)顯影：把膠板迅速轉移至預冷2L顯影液中，輕搖，直至產物條帶出現；
[0100] 6)定影：將膠板迅速轉移至原固定液中輕搖3-5min ;
[0101] 7)沖洗：蒸餾水清洗，膠板室溫下干燥，使用相機拍照進行數據結果分析。
[0102] 8)觀察照相，記錄。
[0103] 上述試劑配制：
[0104] 95|%去離子甲醜胺1〇1111:(卩〇1'1]1&111(16:9.51111 ;漠酌藍：0· 025g ;0· 5M EDTA :0· 2ml ; 二甲苯青FF :〇· 〇25g ;無菌雙蒸水：0· 3ml)
[0105] 固定液：10%冰醋酸2L ;
[0106] 染色液：一般于使用前lOmin配置,2L水中加入2g AgN03, 3ml甲醒；
[0107] 顯影液：2L水中加入60g Na2C03，冷卻至4°C,使用前5min加入甲醒3-6ml, 10mg/ ml硫代硫酸鈉400 μ 1。
[0108] 6%變性聚丙烯酰胺凝膠 500ml:(尿素：210g;10XTBE:50ml ;丙烯酰胺：28·5g; 滅菌雙蒸水：450ml ;甲叉雙丙烯酰胺：1. 5g)
[0109] 9)觀察照相，記錄。
[0110] 4、數據統計與分析
[0111] (1)試驗方法：
[0112] 根據PAGE凝膠電泳結果讀取擴增的譜帶，選出多態性、重復性好的區分開所有的 供試材料的SSR引物，擴增條帶在相同遷移率位置上有帶則記為"1"，無帶則記為"0"，組成 原始數據矩陣，用于構建選取的有代表性的12個白蠟種的指紋圖譜。
[0113] (2)試驗結果：
[0114] 引物18對材料2和12有特征性譜帶（圖1);
[0115] 引物30對材料1、3、8和11有特征性譜帶（圖2);
[0116] 引物42對材料4、5、6、7、9和10有特征性譜帶（圖3)。
[0117] 上述結果表明：3對SSR引物組合即可將12種白蠟材料區分開。
[0001] 序列表 <110〉山東省林業科學研究院 <120〉基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的SSR引物組及其在種質鑒定中的應用 <141〉 2014-06-30 <160> 84 <170> Patentln Version 3. 5 <210> 1 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉1 caaacatgtt cttcagcaac aga 23 <210> 2 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>2 cagttcctcc ccttattgct agt 23 <210> 3 <211> 23 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <400>3 aacatgttct tcagcaacag aca 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>4 ttcctcccct tattgctagt ctt 2'?
[0002] <210〉 5 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)5 caaacatgtt cttcagcaac aga 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA 〈213〉人工序列 <400>6 ttcctcccct tattgctagt ctt 23 <210〉 7 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)7 aacatgttct tcagcaacag aca 23 〈210〉 8 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)8 cttattgcta gtcttggaca ggc 23 <210> 9 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)9 tcgtttctaa aagctgctca gtc 23 <210> 10
[0003] <211> 24 <212> DM <213〉人工序列 <400>10 gagtaaagtg gcggattaga cagt 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA 〈213>人丄序列 <400>11 gctcagtcag atgtaatgag caa 23 <210〉 12 <211> 22 <212> DM <213〉人工序列 <400>12 gtggagtaaa gtggcggatt ag 22 <210> 13 <211〉 23 <212> DM <213〉人工序列 <400>13 gctcagtcag atgtaatgag caa 23 <210> 14 <211〉 24 <212> DM <213〉人工序列 <400>14 gagtaaagtg gcggattaga cagt 24 <210〉 15 <211〉 23
[0004] <212> DNA <213〉人工序列 <400)15 ccataaacag caaaatttca age 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 <400)16 gagggaatta acatttacca ggc 23 <210〉 17 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)17 tttcaagctg aaaacaccaa ttt 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213〉人丄序列 <400)18 gagggaatta acatttacca ggc 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)19 aaatttcaag ctgaaaacac caa 23 <210> 20 <211〉 23 <212> DNA
[0005] <213〉人工序列 <400>20 gagggaatta acatttacca ggc 23 <210〉 21 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>21 aaaatttcaa gctgaaaaca cca 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>22 gagggaatta acatttacca ggc 23 <210〉 23 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>23 caaaatttua agctgaaaac acc 23 〈210〉 24 <211> 23 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <400>24 gagggaatta acatttacca ggc 23 <210〉 25 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列
[0006] <400)25 gaacaacaat actgtcagca acg 23 <210〉 26 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)26 gctttctcgt tgagttcatt gtc 23 〈210〉 27 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)27 aacaacaata ctgtcagcaa cga 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213〉人1：序列 <400)28 tctcgttgag ttcattgtct ctg 23 <210〉 29 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)29 gaacaacaat actgtcagca acg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>30
[0007] tctcgttgag ttcattgtct ctg 23 <210> 31 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>31 aacaacaata ctgtcagcaa cga 23 <210> 32 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>32 cgttgagttc attgtctctg gat 23 <210> 33 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>33 attaagccac caagcaacta ctg 23 <210〉 34 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>34 tagcacccga atagtaagga tea 23 <210〉 35 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>35 attaagccac caagcaacta ctg 23
[0008] <210〉 36 <211〉 23 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <400)36 cacccgaata gtaaggatca aca 23 <210〉 37 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400)37 attaagccac caagcaacta ctg 23 <210> 38 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>38 tcctagagag aaccttcggg tag 23 <210〉 39 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>39 attaagccac caagcaacta ctg 23 <210〉 40 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400)40 atcctagaga gaaccttcgg gta 23
[0009] <210〉 41 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)41 tcacaatcca atttacacca tea 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA 〈213〉人工序列 <400)42 gagattgett agagccagag gac 23 <210〉 43 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)43 tcacaatcca atttacacca tea 23 〈210〉 44 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400)44 gagattgett agagccagag ga 22 <210> 45 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)45 tcacaatcca atttacacca tea 23 <210> 46
[0010] <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400>46 agattgctta gagccagagg ac 22 <210> 47 <211〉 25 <212〉 DNA <213〉人丄序列 <400>47 tttcaagtag gatgatgaac aacaa 25 <210〉 48 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>48 ggaagaggag aaagctagaa tgc 23 <210〉 49 <211> 23 <212> DM <213〉人工序列 <400>49 ccaacaaaag gagcaagata aaa 23 <210〉 50 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>50 acatgagatg gctgagaaat gtt 23 <210〉 51 <211〉 23
[0011] <212〉 DNA <213〉人工序列 <400)51 ccaacaaaag gagcaagata aaa 23 <210> 52 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)52 atgttactag cttccccttg acc 23 <210〉 53 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)53 ccaacaaaag gagcaagata aaa 23 <210〉 54 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)54 tcgaacttga actgtaatca cga 23 <210〉 55 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)55 gaaaggagaa aggcattaag cag 23 <210> 56 <211〉 23 <212> DNA
[0012] <213〉人工序列 <400)56 acatgagatg gctgagaaat gtt 23 <210〉 57 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)57 agaaaggaga aaggcattaa gca 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA 〈213〉人工序列 <400)58 acatgagatg gctgagaaat gtt 23 <210> 59 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>59 aagcatgaaa gcttactcga aaa 23 <210> 60 <211〉 23 <212> DNA 〈213〉人工序列 <400>60 cttgatcttc tccttcaaac cct 23 <210> 61 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列
[0013] <400)61 aaagcatgaa agcttactcg aaa 23 <210> 62 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)62 cttgatcttc tccttcaaac cct 23 <210〉 63 <211> 23 <212> DNA 〈213〉人工序列 <400)63 aaaagcatga aagcttactc gaa 23 <210〉 64 <211> 23 <212> DNA <213〉人丁序列 <400)64 cttgatcttc tccttcaaac cct 2S <210〉 65 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>65 aagcttactc gaaaagctcc aac 23 <210〉 66 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400)66
[0014] cttgatcttc tccttcaaac cct 23 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>67 ctcttcgagt gatgaggaag aag 23 <210〉 68 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>68 ccagatatct tcutgat ctt 23 <210〉 69 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>69 aaaatcttgc tcggaaaaat cag 23 <210〉 70 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>70 aggtcaactt gtgaaactcg aag 23 <210> 71 〈211〉 23 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400>71 aaaatcttgc tcggaaaaat cag 23
[0015] <210〉 72 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>72 aacattttcc accactaggt caa 23 <210> 73 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400>73 aaaatcttgc tcggaaaaat cag 23 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)74 gaacattttc caccactagg tea 23 <210〉 75 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>75 aaaatcttgc tcggaaaaat cag 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)76 tgaacatttt ccaccactag gtc 23
[0016] <210> 77 <211> 22 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400)77 aaaatcttgc tcggaaaaat ca 22 <210> 78 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400)78 aggtcaactt gtgaaactcg aag 23 <210〉 79 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)79 tcagcattta gaactgaaaa aca 23 <210> 80 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)80 aaattaagaa. ttacaagcgg gga 23 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>81 tcagcattta gaactgaaaa aca 23 〈210〉 82
[0017] <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400)82 gaaattaaga attacaagcg ggg 23 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>83 tcagcattta gaactgaaaa aca 23 <210> 84 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400>84 atgagatgaa aaacaacaat ccg 23
【權利要求】
1. 一套基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的SSR引物組，其特征在于，所述SSR引物組 有42對引物，其中： 第1對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的反向引物序列組成， 第2對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的反向引物序列組成， 第3對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示的反向引物序列組成， 第4對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示的反向引物序列組成， 第5對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示的反向引物序列組成， 第6對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示的反向引物序列組成， 第7對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示的反向引物序列組成， 第8對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示的反向引物序列組成， 第9對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示的反向引物序列組成， 第10對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 20所示的反向引物序列組成， 第11對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 22所示的反向引物序列組成， 第12對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 24所示的反向引物序列組成， 第13對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 25所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 26所示的反向引物序列組成， 第14對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 27所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 28所示的反向引物序列組成， 第15對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 29所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 30所示的反向引物序列組成， 第16對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 31所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 32所示的反向引物序列組成， 第17對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 33所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 34所示的反向引物序列組成， 第18對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 35所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 36所示的反向引物序列組成， 第19對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 37所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 38所示的反向引物序列組成， 第20對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 39所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 40所示的反向引物序列組成， 第21對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 41所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 42所示的反向引物序列組成， 第22對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 43所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 44所示的反向引物序列組成， 第23對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 45所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 46所示的反向引物序列組成， 第24對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 47所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 48所示的反向引物序列組成， 第25對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 49所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 50所示的反向引物序列組成， 第26對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 51所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 52所示的反向引物序列組成， 第27對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 53所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 54所示的反向引物序列組成， 第28對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 55所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 56所示的反向引物序列組成， 第29對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 57所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 58所示的反向引物序列組成， 第30對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 59所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 60所示的反向引物序列組成， 第31對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 61所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 62所示的反向引物序列組成， 第32對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 63所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 64所示的反向引物序列組成， 第33對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 65所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 66所示的反向引物序列組成， 第34對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 67所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 68所示的反向引物序列組成， 第35對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 69所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 70所示的反向引物序列組成， 第36對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 71所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 72所示的反向引物序列組成， 第37對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 73所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 74所示的反向引物序列組成， 第38對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 75所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 76所示的反向引物序列組成， 第39對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 77所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 78所示的反向引物序列組成， 第40對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 79所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 80所示的反向引物序列組成， 第41對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 81所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 82所示的反向引物序列組成， 第42對引物由核苷酸序列如SEQ ID No. 83所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID No. 84所示的反向引物序列組成。
2. 權利要求1所述基于絨毛白蠟轉錄組測序信息開發的SSR引物組在白蠟種質鑒定中 的的應用。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于，利用所述的SSR引物組進行白蠟種質鑒定的 方法是： (1) DNA提取：利用改良的CTAB法提取待測白蠟樣品基因組DNA ; (2) SSR-PCR 擴增： 以步驟⑴提取的DNA樣品為模板，采用如序列表SEQ ID No. 1-84所示引物進行 SSR-PCR 擴增； SSR-PCR 采用 10ul 反應體系：25_〇1 · llg2%. 8μ 1、10μπιο1 · Γ1 引物 0. 2μ 1、 lOmmol · ΓΜΝΤΡΟ. 3μ 1、5U · μ llaq 酶 0· 05μ l、5-10ng · μ 1-1DNA 模板 2· 00μ 1、10XPCR 緩沖液 1· 〇μ 1，ddH205. 45 μ 1 ; PCR反應條件為94°C預變性3min，94°C變性lmin，54°C -58°C退火lmin，72°C延伸 lmin，共35個循環；最后72°C延伸5延伸lmin，4°C lOmin終止反應； (3) 電泳檢測及統計：將步驟（2)的SSR-PCR擴增產物用聚丙烯酞胺凝膠電泳分離，銀 染法染色，照相并統計帶型，某位置若有條帶記為1，若無則記為0,以此方式建立供試材料 SSR基因型信息數據庫，進行白蠟種質鑒定分析。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟（3)中所述的聚丙烯酞胺凝膠電 泳的方法是：將步驟（2)SSR-PCR擴增后的產物與等體積95%去離子甲酰胺混勻后，取4μ 1 點樣，PCR產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中，60W恒功率電泳2-3h ;其中，電極緩沖液為 1 XTBE，使用10bp DNA Ladder來確定等位基因大小。
【文檔編號】C12N15/11GK104046697SQ201410318921
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年7月4日 優先權日:2014年7月4日
【發明者】燕麗萍, 劉翠蘭, 夏陽, 李麗, 孫超 申請人:山東省林業科學研究院