甘肅棘豆產苦馬豆素內生真菌Undifilum oxytropis的定向分離及鑒定方法
【專利摘要】本發明涉及一種甘肅棘豆產苦馬豆素內生真菌Undifilumoxytropis的定向分離及鑒定方法。從甘肅棘豆中分離內生真菌Undifilumoxytropis時，不可避免的會分理出其他種屬的菌株，影響分離效率。本發明用蒸餾水、乙醇、無菌水和次氯酸鈉依次清洗甘肅棘豆的莖和成熟種子，再將組織剪成小塊置于PDA平板上，平板中充滿CO2并用保鮮膜密封，光照下室溫培養，待切口處長出菌絲后，挑取頂端菌絲轉接至培養基上純化，刮取菌絲，隨后將菌株接種至試管斜面冷藏；提取分離菌株的基因組DNA，在GeneBank中進行序列比對。本發明從瘋草中只分離得到一種菌，減少其他種屬內生真菌的干擾，方法簡便易行，保存過程中菌株不易發生變異或菌株活性減低。
【專利說明】甘肅棘豆產苦馬豆素內生真菌Undifi Ium oxytropis的定
向分離及鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥【技術領域】，具體涉及一種甘肅棘豆產苦馬豆素內生真菌Undifilum oxytropis的定向分離及鑒定方法。
【背景技術】
[0002]內生真菌(fungal endophyte)是指生活史或其中某一段時期生活在活的植物組織內，對植物組織不引起明顯病害癥狀的真菌，包括腐生真菌、潛伏性病原真菌和菌根菌。目前研究發現，瘋草毒素與瘋草內生真菌關系密切。一方面瘋草內生真菌協助瘋草產生毒素，從而增強了瘋草的毒性，減少了動物對瘋草的采食；另一方面，內生真菌可以提高瘋草的抗逆性，這使得瘋草在干旱半干旱的草原上生命力顯得極其頑強，加大了防治的難度。
[0003]最初，人們認為瘋草毒素苦馬豆素是瘋草在生長過程中自身合成的代謝產物，但深入研究發現，苦馬豆素是由瘋草攜帶的內生真菌合成的。人們對瘋草中苦馬豆素的來源認識有了更新，認為瘋草內苦馬豆素的含量與內生真菌的種類、數量及定植部位等關系密切。現已證實，能合成苦馬豆素的真菌主要有豆類絲核菌屬Ieguminicola')^金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae )和埃里磚格孢屬iEmbelIisia，現已更名為
尤其是內生真菌Undifilum oxytropis合成力最優。
[0004]在對瘋草進行內 生真菌分離時,不僅會分離得到內生真菌Undifilum oxytropis,還會不可避免的得到其他種屬的菌株，如下表1，嚴重影響了分離效率，造成了時間和精力上的損失。
[0005]表1分離瘋草攜帶的內生真菌的多樣性
【權利要求】
1.甘肅棘豆產苦馬豆素內生真菌的定向分離及鑒定方法,其特征在于: 由以下步驟實現: 步驟一:分離: 將甘肅棘豆的莖和成熟種子用蒸餾水沖洗干凈，經質量分數為75%的乙醇溶液漂洗30S、無菌水沖洗3次、有效氯的質量百分含量為2%的次氯酸鈉溶液漂洗3 min、無菌水沖洗3-5次后，再將組織剪成5_X 5_小塊，分別置于PDA平板上，平板中充滿CO2并用保鮮膜密封，在光照條件下于室溫培養，待切口處長出菌絲后，挑取頂端菌絲轉接至PDA培養基上純化2-3次，刮取菌絲，隨后將菌株接種至試管斜面，4°C冰箱保存備用； 步驟二:ITS序列比對: (1)刮取新鮮菌絲80mg，用去離子水沖洗干凈后，再用無菌水沖洗一次，用濾紙將菌絲表面水吸干后放入1.5mL離心管內，加入液氮迅速研磨至粉末； (2)向管內加入預熱65°C的2XCTAB緩沖液500μ L，振蕩混勻，置于65°C水浴鍋中溫育30min,中間搖晃2_3次； (3)放置至室溫后，加入500μ L的萃取混合液，振蕩混勻后，室溫靜置5min，期間持續輕搖；
(4)4°C，12000 r/min,離心 15min ； (5)吸取上清，再加入500μ L的CTAB提取液，混勻，于65°C再溫育15min ； (6)加入500μ L的萃取混合液,振蕩混勻，12000 r/min, 4°C離心15min ； (7)取上清加入1/10體積、pH5.2、摩爾體積濃度為3mol/L的NaAC，再加入500 μ L的異戍醇，輕搖即出現沉淀，-20°C放置30min以上；4°C, 13000 r/min,離心15min ;棄上清,用質量分數為75%的冷乙醇溶液100 μ L洗滌沉淀兩次，室溫下風干； (8)用ρΗ8.0的TE緩沖液或滅菌的雙蒸水溶解，于4°C貯存；以真菌rDNA擴增的通用引物 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3，)為上、下游引物，擴增其核糖體rDNA-1TS保守序列； 進行擴增的 PCR反應體系為 50 μ L =TaKaRa Taq DNA聚合酶 2.5UU0XPCR Buffer 5 μ L,MgCl2 3ML、Dntp 4 μ L、ITSl 和 ITS4 引物各 2 μ L、模板 DNA 0.5 μ L,加雙蒸水至 50 μ L ； 反應條件為:95°C預變性5min ； (9)95°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸lmin,30個循環；最后72°C延伸1min使其完全反應； (10)將PCR產物加入質量體積分數為15g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統中進行分析，真菌5.8S rDNA-1TS序列的長度一般為500-700bp，對擴增產物進行測序，將測定的5.8S rDNA-1TS序列用BLAST與GenBank中的5.8S rDNA-1TS序列進行同源性比較，應用Clustal X 1.83 vers1n和MEGA 5.0軟件，分別采用鄰接法和最大簡約法構建系統進化樹進行種屬歸類，自展法檢測進化樹，自展數據集為1000次。
2.根據權利要求1所述的甘肅棘豆產苦馬豆素內生真菌Undifilumoxytropis的定向分離及鑒定方法，其特征在于: 步驟一中，所述的PDA培養基的配方如下: 馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸懼水I 000 mL。
3.根據權利要求2所述的甘肅棘豆產苦馬豆素內生真菌Undifilum oxytropis的定向分離及鑒定方法，其特征在于: 步驟二的(3)和(6)中，所述萃取混合液由質量比為25:24:1的Tris飽和酚、氯仿和異戊醇混合而成 。
【文檔編號】C12R1/645GK104031849SQ201410318819
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年7月7日 優先權日:2014年7月7日
【發明者】路浩, 楊曉雯, 趙寶玉, 曹丹丹, 薛瑞旭, 權海云 申請人:西北農林科技大學