一種重組人cytl1蛋白的表達方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種重組人CYTL1蛋白的表達方法，所述方法為將SEQ?ID:NO.1進行原核表達。本發明首次采用基因重組技術進行規模制備CYTL1蛋白，表達的重組人類源類細胞介素1-CYTL1蛋白為可溶性蛋白，并且證明了該重組蛋白能夠促進軟骨細胞的增殖。
【專利說明】-種重組人CYTL1蛋白的表達方法和用途 【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種蛋白質的表達方法，具體涉及一種重組人CTYL1蛋白的表達方法 和用途。 【背景技術】
[0002] 關節軟骨是一種獨特的結締組織，由軟骨細胞和軟骨基質組成，軟骨損傷的修復 依賴軟骨細胞分泌來完成。由于軟骨組織內無血管，軟骨細胞被嵌入由II型膠原和蛋白多 糖組成的致密的固體基質中，無法移動到缺損部位，因此，即使是很小的缺損也難以自行修 復。關節軟骨損傷在臨床上較常見，目前對其治療分為預防和對癥治療兩種，有癥狀的病人 可用藥物和手術治療進行干預，但這些手段并不能從根本上阻止病情的發展，因此人們一 直在積極尋找更有效的治療與預防措施。
[0003] 細胞因子是由造血系統、免疫系統或炎癥反應中的活化細胞產生，能調節刺激細 胞分化增殖和誘導細胞發揮功能，是高活性多功能的多肽、蛋白質或糖蛋白，對機體抗御疾 病、維持生理功能及促進組織器官的修復與再生等方面具有重要意義。自從1957年世界 上第一種高效干擾病毒繁殖的細胞因子-干擾素被發現以后，細胞因子以其高度生物學活 性、高特異性作用等優點受到醫學及生物學領域的高度重視，至今相繼發現了幾十種生長 因子并應用于臨床，獲得了良好的防治效果。
[0004] 在軟骨修復研究領域中，主要應用的細胞因子包括骨形態發生蛋白（BMP)、胰島素 樣生長因子（IGF)、血小板源性生長因子（PDGF)、軟骨調節素（ChM)等。目前，該種類細胞 因子作用復雜，并具有多重調節作用，在促進軟骨組織修復的同時，也容易做成其他組織的 增生（如纖維組織），導致新生軟骨組織骨化或纖維化，影響再生組織的生物學功能。此外， 商品化的外源性細胞因子多依賴國外進口，價格十分昂貴。
[0005] 在鼠的動物模型研究中發現了 一種新型的生長因子-類細胞介素 1 (Cytokine-likel，CYTL1)對軟骨的生成具有獨特的調控作用，主要在軟骨細胞和軟骨組 織中表達，在骨髓間充質干細胞中（Mesenchymal Stem Cells, MSC)表達量很低，能誘導MSC 向軟骨細胞方向轉化，在軟骨形成后CYTL1含量明顯增加 （Kim JS等，J Biol Chem. 2007)。 CYTL1通過刺激Sox9轉錄活性來增加軟骨生成；并能提高胰島素樣生長因子的表達，進一 步促進軟骨組織再生。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種重組人CYTL1蛋 白的表達方法，還提供了采用該方法表達的重組人CYTL1蛋白以及所述重組人CYTL1蛋白 的用途。
[0007] 為實現上述目的，所采取的技術方案：一種重組人CYTL1蛋白的表達方法，所述方 法為將SEQ ID:N0. 1進行原核表達。SEQ ID:N0. 1為人CYTL1蛋白⑶S中去除信號肽序列 后剩余的DNA序列，SEQ ID:N0. 1如下：
[0008] ACTCCCCCGACCTGCTACTCCCGCATGCGGGCCCTGAGCCAGGAGATCACCCGCGACTTCAACCTCCTG CAGGTCTCGGAGCCCTCGGAGCCATGTGTGAGATACCTGCCCAGGCTGTACCTGGACATACACAATTACTGTGTGCT GGACAAGCTGCGGGACTTTGTGGCCTCGCCCCCGTGTTGGAAAGTGGCCCAGGTAGATTCCTTGAAGGACAAAGCAC GGAAGCTGTACACCATCATGAACTCGTTCTGCAGGAGAGATTTGGTATTCCTGTTGGATGACTGCAATGCCTTGGAA TACCCAATCCCAGTGACTACGGTCCTGCCAGATCGTCAGCGCTAG〇
[0009] 其對應的氨基酸序列如下：
[0010] TPPTCYSRMRALSQEITRDFNLLQVSEPSEPCVRYLPRLYLDIHNYCVLDKLRDFVASPPCWKVAQVDS LKDKARKLYTIMNSFCRRDLVFLLDDCNALEYPIPVTTVLPDRQR
[0011] 優選地，所述原核表達中PCR擴增引物是：
[0012] 正向引物：5 ' -GAAAAGCTTCACACTCCCCCGACCTGCTACT-3 ' ；
[0013] 反向引物：5 ' -TATAGAATTCCTAGCGCTGACGATC-3 '。
[0014] 優選地，所述原核表達中選用的雙酶切位點分別為Xmn I和EcoR I酶切位點。
[0015] 優選地，所述原核表達中原核表達載體為pFL-B13cl。
[0016] 優選地，所述原核表達中宿主菌為Ε· coli BL21 (Gold) (DE3)。
[0017] 優選地，所述原核表達中采用IPTG誘導表達，IPTG終濃度為0. 05?0. ImM，培養 溫度為37 V。
[0018] 優選地，所述原核表達中采用鎳親和層析法純化重組人CYTL1蛋白。
[0019] 優選地，所述鎳親和層析中洗脫緩沖液含250mM咪唑。
[0020] 本發明還提供了一種重組人CYTL1蛋白，所述重組人CYTL1蛋白采用上述所述方 法表達而得。
[0021] 本發明還提供了上述所述重組人CYTL1蛋白在制備促進軟骨細胞增殖藥物中的 用途。
[0022] 本發明的有益效果在于：本發明首次采用基因重組技術進行規模制備CYTL1蛋 白，表達的重組人類源類細胞介素 1-CYTL1蛋白為可溶性蛋白，并且證明了該重組蛋白能 夠促進軟骨細胞的增殖。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明所述人軟骨細胞CYTL1蛋白cDNA的PCR擴增產物的電泳圖；
[0024] 圖2為本發明所述PFL_B13cl載體雙酶切后的電泳圖，1為酶切前，2為酶切后；
[0025] 圖3為雙酶切后的載體與目的片段的連接示意圖；
[0026] 圖4為本發明所述轉化子菌落PCR的電泳圖；
[0027] 圖5為本發明所述陽性轉化子PCR鑒定圖，1為CYTL1特異性引物擴增，2為B13 通用引物擴增；
[0028] 圖6為本發明所述重組pFL-B13cl_CYTLl成熟蛋白原核表達的蛋白電泳圖；
[0029] 圖7為本發明所述重組人CYTL1蛋白質純化后的蛋白電泳圖；
[0030] 圖8為本發明所述重組人CYTL1蛋白在不同濃度下促進人軟骨細胞增殖的柱狀 圖。 【具體實施方式】
[0031] 為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明 作進一步說明。
[0032] 實施例1
[0033] -種重組人CYTL1蛋白的表達方法，具體步驟如下：
[0034] 1、人軟骨細胞CYTL1蛋白cDNA的制備
[0035] 1. 1RNA抽提：將人軟骨細胞系C28112細胞充分震蕩混勻至細胞完全裂解，室溫放 置10分鐘左右后，每lml TRIzol中加入氯仿為200 μ 1，蓋上蓋子，劇烈振蕩約1分鐘，室溫 靜置2?5分鐘，然后12000g制冷離心15分鐘（6°C )，小心取出樣品，通過觀察可以發現 樣品分三層，其中最上層含有RNA樣品。
[0036] 1. 2RNA沉淀：小心吸取上清液約450 μ 1 (每lml TRIzol的吸取量）至含有600 μ 1 冷凍異丙醇的新RNase Free的離心管中，混勻，-20°C放置約10分鐘，12000g冷凍離心10 分鐘)。去上清，再加入冷凍的75%乙醇，彈起沉淀后12000g冷凍離心5分鐘)， 棄上清，風干約5?10分鐘以后再加入DEPC水制成RNA樣品（濃度調整到1 μ g/ml)，可-80 度保存。質量以瓊脂糖凝膠電泳觀察來確認。
[0037] 1. 3反轉錄（RT)制備cDNA樣品：用下列組份配制RT反應液（所有反應都在冰上 進行操作）。
[0038] 在預冷的RNase Free的PCR反應管內加入以下試劑進行RT反應
[0039]
【權利要求】
1. 一種重組人CYTL1蛋白的表達方法，其特征在于，所述方法為將SEQID: NO. 1進行原 核表達。
2. 根據權利要求1所述的重組人CYTL1蛋白的表達方法，其特征在于，所述原核表達中 PCR擴增引物是： 正向引物：5 ' -GAAAAGCTTCACACTCCCCCGACCTGCTACT-3 ' ； 反向引物：5 ' -TATAGAATTCCTAGCGCTGACGATC-3 '。
3. 根據權利要求1所述的重組人CYTL1蛋白的表達方法，其特征在于，所述原核表達中 選用的雙酶切位點分別為Xmn I和EcoR I酶切位點。
4. 根據權利要求1所述的重組人CYTL1蛋白的表達方法，其特征在于，所述原核表達中 原核表達載體為pFL-B13cl。
5. 根據權利要求1所述的重組人CYTL1蛋白的表達方法，其特征在于，所述原核表達中 宿主菌為 E. coli BL21 (Gold) (DE3)。
6. 根據權利要求1所述的重組人CYTL1蛋白的表達方法，其特征在于，所述原核表達中 采用IPTG誘導表達，IPTG終濃度為0. 05?0. ImM，培養溫度為37°C。
7. 根據權利要求4所述的重組人CYTL1蛋白的表達方法，其特征在于，所述原核表達中 采用鎳親和層析法純化重組人CYTL1蛋白。
8. 根據權利要求7所述的重組人CYTL1蛋白的表達方法，其特征在于，所述鎳親和層析 中洗脫緩沖液含250mM咪唑。
9. 一種采用如權利要求1-8任一方法表達的重組人CYTL1蛋白。
10. -種如權利要求9所述的重組人CYTL1蛋白在制備促進軟骨細胞增殖藥物中的用 途。
【文檔編號】C12N5/077GK104087608SQ201410317157
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月3日 優先權日:2014年7月3日
【發明者】楊小紅, 李斯明, 崔樹良, 梁偉國 申請人:廣州市紅十字會醫院