一株擬康氏木霉tz-11菌株及其用途
【專利摘要】本發明涉及一株擬康氏木霉(Trichoderma?koningiopsis)TZ-11菌株、用途及其制劑的制備方法。由該菌株經固體發酵而制得的可濕性粉劑，可用于防治由圍小叢殼菌(Glomerella?cingulata)侵染引起的炭疽病，例如辣椒、芒果、香蕉和枇杷等很多作物炭疽病的防治，尤其是由圍小叢殼菌(Glomerella?cingulata)侵染引起的葡萄炭疽病和草莓炭疽病等病害。田間試驗結果表明，該菌劑對葡萄炭疽病和草莓炭疽病均有很好的防治效果且菌株發酵工藝簡單，生產成本低廉；菌劑活孢子含量高，貯藏性質穩定。
【專利說明】一株擬康氏木霉TZ-11菌株及其用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株微生物菌株及其用途，更具體地說涉及一株擬康氏木霉 (Trichoderma koningiopsis)TZ-ll菌株、用途及其制劑的制備方法，屬于生物農藥技術領 域。
【背景技術】
[0002] 由植物病原真菌圍小叢殼菌屬（Glomerellaspp.)引發的葡萄、蘋果、梨和草莓等 的炭疽病，是設施農業農作物的主要病害。化學藥劑防控是當前防治炭疽病的主要防治措 施。常用的化學藥劑主要有多菌靈（carbendazim)、丙環唑（propiconazole)、雙苯三唑醇 (bitertanol)、抑霉唑（imazalil)、己唑醇（hexaconazole)、啼菌酯（azoxystrobin)、醚菌 酯（kresoxim-methyl)、啼霉胺（pyrimethanil)、苯醚甲環唑（difenoconazole)、烯廂菌酯 (enestroburin)、咪鮮胺（prochloraz)和批唑醚菌酯（pyraclostrobin)等。農戶在作物 炭疽病防治上大多使用上述的高效低毒藥劑，但該類藥劑作用位點單一（抑制線粒體呼吸 鏈電子傳遞）。在高防治頻次下極易產生抗藥性，且藥劑間交互抗藥性風險極高。生產上已 屢屢出現防治失敗的事例，說明炭疽病病原真菌已對上述當家化學藥劑都產生了不同程度 的抗（耐）藥性，替代藥劑的研發已刻不容緩。
[0003] 相對于大田作物病害生物防治，葡萄、草莓等應時鮮果病害的生物防治研究在 我國才剛剛開始。目前國內外還沒有成功用于防治炭疽病的生物農藥專用制劑。已 報道的研究大多集中于利用活體微生物來防控，如利用木霉菌屬真菌（Trichoderma spp.)中的綠色木霉（Trichoderma viride)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)和 長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum),芽抱桿菌屬細菌（Bacillus spp.)中的 枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、錯質芽抱桿菌（Bacillus cereus)、多粘芽抱桿 菌（Bacillus polymyxa)、巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium)和解淀粉芽抱桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)，假單胞菌屬細菌（Pseudomonas spp.)中的洋蔥假單胞 菌（Pseudomonas cepacia)、突光假單胞細菌（Pseudomonas fluorescens)和惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)，酵母菌中的季也蒙畢赤氏酵母（Pichia guilliermondii)和羅倫隱 球酵母（Cryptococcus laurentii)，寡雄腐霉（Pythiumoligandrum)等來防治。運用活體 微生物防治作物炭疽病的研究報道僅限于室內活性測定、溫室防治試驗和田間試驗測定階 段。本發明提供的可有效防治炭疽病的擬康氏木霉菌株，在現有技術中沒有提及和公開。
【發明內容】
[0004] 本發明的第一目的在于提供一種可用于防治由圍小叢殼菌（Glomerella cingulata)侵染引起的炭疽病病害的菌株。
[0005] 本發明的第二目的是提供菌株在防治由圍小叢殼菌（Glomerella cingulata)侵 染引起炭疽病病害方面的應用，尤其是在圍小叢殼菌侵染引起的葡萄炭疽病和草莓炭疽病 上的應用。
[0006] 本發明的第三目的是一種利用上述菌株制備的可濕性粉劑。
[0007] 本發明的第四目的是提供一種上述可濕性粉劑的制備方法。
[0008] -、為解決第一目的，提供的技術方案如下：
[0009] 一株擬康氏木霉囷株，其特征在于，該囷株的分類命名為擬康氏木霉 TZ-11 (Trichoderma koningiopsisTZ-11)，為該菌株已于2010年7月8號在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCCNo. 3969。
[0010] 本發明菌株的形態學及顯微特征如下：
[0011] 在麥芽汁瓊脂培養基（MEA)上生長快，25°C黑暗條件下培養4d菌落直徑60-63mm， 初期白色，后期因產孢呈灰綠色，質地絮狀；背面淺褐色，無水溶性色素。分生孢子結構大量 形成，產孢區均勻分布。菌絲壁平滑或粗糙，多分枝，具分隔，寬2. 0-3. 5 μ m ;分生孢子梗壁 光滑，主軸明顯，對生分枝情況較少，寬2. 0-3. 5 μ m ;產孢瓶梗多數2-4個簇生于分生孢子 梗或其分枝上，基部柱狀或略膨大6. 2-15. 0X 2. 0-3. 5 μ m ;分生孢子橢圓形，深綠色，壁平 滑或稍粗糙，3. 5-5. 5 X 1. 8-3. 0 μ m。
[0012] 本發明的擬康氏木霉（Trichoderma koningiopsis) TZ-11菌株rRNA基因序列對 應的DNA序列（該段rRNA包括了 18SrRNA片段，ITS1、5. 8SrRNA、ITS2區全序列及28SrRNA 序列片段）如SEQ ID NO :1所示。
[0013] 二、菌株在防治由圍小叢殼菌（Glomerellacingulata)侵染引起的炭疽病害方面 的應用，尤其是在圍小叢殼菌引起的葡萄炭疽病和草莓炭疽病防治中的應用。
[0014] 三、一種利用上述菌株制備的可濕性粉劑。
[0015] 四、一種上述可濕性粉劑的制備方法，具體包括以下步驟：
[0016] ㈧固體發酵培養物的獲得
[0017] ⑴將麥麩和鋸木屑按3: 7 (V/V)的比例混勻后，分別加入0. 1 % (W/W)的蔗糖和 碳酸銨，并加水使含水量為60?65 %，pH調至7. 5-8. 0,再次混勻后在加厚的聚乙烯塑料 袋內每袋分裝1.5kg，扎緊袋口，并在121°C下濕熱滅菌60min。在水平槽固體發酵盤底部 鋪墊2張滅菌報紙，加入滅菌后的固體發酵培養基1. 5kg，裝料厚度約為5cm。將預先轉接 到PDA平皿中的擬康氏木霉TZ-11菌株，置于培養箱內28°C培養7d后，用無菌水洗下的孢 子，用顯微鏡計數后將孢子液濃度調配為：1. 〇X 1〇7個/mL。將100mL該孢子液均勻接種 至IJ 1. 5kg固體發酵培養基后，在發酵盤頂部蓋2張滅菌報紙并用扎繩扎緊密封，最后放置于 28°C保濕培養箱內發酵，發酵環境相對濕度達到80 %以上，發酵8-10d，發酵產物活孢子量 可達 1. 0-2. 0X109cfu/g ;
[0018] (2)將上述發酵產物加入適量蒸餾水置于搖床上150rpm振蕩洗滌8min，然后用 325目標準篩過濾并收集濾液，反復3次，最后將濾液在3000rpm下離心15min，收集沉淀物 備用。
[0019] (B)菌劑加工工藝
[0020] (1)將經固體發酵、離心后收集到沉淀物用〇· 5% (W/W)甲基纖維素溶液（溶液用 無菌水配制）懸浮，并將懸浮液中活孢子的含量調節成> 5. OX 108cfu/mL ;
[0021] (2)將亞甲基二萘磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈣、輕質碳酸鈣和硅藻土按5:4:1:90 的重量比混合后，通過氣流粉碎使細度達到325目以上，然后加入配制好的孢子懸浮液，最 后經50°C氣流烘干、攪拌機混勻和包裝后加工成含擬康氏木霉TZ-11菌株活孢子的可濕性 粉劑。其中所述擬康氏木霉τζ-ll菌株可濕性粉劑的活孢子含量> 1.0X108cfu/g。
[0022] 本發明的有益效果
[0023] (1)本發明為了解決葡萄和草莓等作物栽培中炭疽病防治的問題，結合農業生產 實際需求，提供一株新的生防菌株--擬康氏木霉TZ-11菌株，由該菌株經固體發酵而制 得的可濕性粉劑，可用于防治由圍小叢殼菌（Glomerella cingulata)侵染引起的炭疽病， 例如辣椒、芒果、香蕉和枇杷等很多作物炭疽病的防治，尤其是由圍小叢殼菌（Glomerella cingulata)侵染引起的葡萄炭疽病和草莓炭疽病等病害。田間試驗結果表明，該菌劑對葡 萄炭疽病和草莓炭疽病均有很好的防治效果。
[0024] (2)菌株發酵工藝簡單，生產成本低廉；菌劑活孢子含量高，貯藏性質穩定。
[0025] 本發明的擬康氏木霉 TZ-11 (Trichoderma koningiopsis TZ-11)菌株已于 2010 年 7月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所）保藏，保藏編號為：CGMCCNo. 3969。
【具體實施方式】
[0026] 下面列舉實施例對本發明進一步說明，但不因此限制本發明的內容。
[0027] 實施例1本實施例說明獲得擬康氏木霉（Trichoderma koningiopsis)TZ-11菌株 的方法。
[0028] PDA培養基配方為：馬鈴薯（去皮）200g/L，葡萄糖20g/L，水1L，瓊脂20g/L，pH自 然。將馬鈴薯去皮，切成小塊，于鍋中加水約1L煮沸半個小時，用雙層紗布過濾，取其濾液 加葡萄糖，并加水補足1L。
[0029] 包括以下步驟：
[0030] 1)菌株的分離、純化與保存。
[0031] 在江蘇省句容市葡萄種植區內的巨峰葡萄上采集樣品，在超凈工作臺上將采集的 樣品在PDA平皿上進行組織分離，根據真菌的菌落特征及時挑取不同形態單菌落至PDA平 皿上，純化2次，記錄菌株號，將已純化的菌株轉到PDA斜面上培養好后放入4°C冰箱中備 用。然后將上述分離保存的真菌菌株轉接中PDA平皿上活化，采用平皿對峙培養法篩選圍 小叢殼菌（Glomerella cingulata)的拮抗菌株，根據抑菌圈的大小評定菌株的拮抗活性。
[0032] 2)鑒定囷株種屬并保減。
[0033] 將拮抗活性最強的菌株傳代純化培養后，對菌株進行分子鑒定，鑒定結果顯示 菌株為擬康氏木霉（Trichoderma koningiopsis),對其命名為擬康氏木霉（Trichoderma koningiopsis)TZ-11 菌株，并制作擬康氏木霉（Trichoderma koningiopsis)TZ-11 菌株的 冷凍干燥管進行原始菌株的凍藏。
[0034] 上述菌種的菌落形態及顯微特征為：在麥芽汁瓊脂培養基（MEA)上生長快， 25°C黑暗條件下培養4d菌落直徑60-63mm，初期白色，后期因產孢呈灰綠色，質地絮 狀；背面淺褐色，無水溶性色素。分生孢子結構大量形成，產孢區均勻分布。菌絲壁 平滑或粗糙，多分枝，具分隔，寬2.0-3. 5μπι;分生孢子梗壁光滑，主軸明顯，對生分枝 情況較少，寬2.0-3. 5μπι;產孢瓶梗多數2-4個簇生于分生孢子梗或其分枝上，基部 柱狀或略膨大6. 2-15. 0X2. 0-3. 5μπι;分生孢子橢圓形，深綠色，壁平滑或稍粗糙， 3. 5-5. 5X1. 8-3. 0 μ m〇
[0035] 本發明的擬康氏木霉（Trichoderma koningiopsis) TZ-11菌株rRNA基因序列對 應的DNA序列（該段rRNA包括了 18SrRNA片段，ITS1、5. 8SrRNA、ITS2區全序列及28SrRNA 序列片段）如SEQIDN0 :1所示。。
[0036] 實施例2用本發明的防治炭疽病的菌株TZ-11制備可濕性粉劑
[0037] 制備方法包括以下步驟：
[0038] (A)固體發酵培養物的獲得
[0039] (1)將麥麩和鋸木屑按3:7 (V/V)的比例混勻后，分別加入0. 1 % (W/W)的蔗糖和 碳酸銨，并加水使含水量為60?65 %，pH調至7. 5-8. 0,再次混勻后在加厚的聚乙烯塑料 袋內每袋分裝1.5kg，扎緊袋口，并在121°C下濕熱滅菌60min。在水平槽固體發酵盤底部 鋪墊2張滅菌報紙，加入滅菌后的固體發酵培養基1. 5kg，裝料厚度約為5cm。將預先轉接 到PDA平皿中的擬康氏木霉TZ-11菌株，置于培養箱內28°C培養7d后，用無菌水洗下的孢 子，用顯微鏡計數后將孢子液濃度調配為：1. OX 1〇7個/mL。將100mL該孢子液均勻接種 到1. 5kg固體發酵培養基后，在發酵盤頂部蓋2張滅菌報紙并用扎繩扎緊密封，最后放置 于28°C保濕培養箱內發酵，發酵環境相對濕度達到80%以上，發酵8-10d，發酵產物活孢子 量可達1. 0-2. OX 109cfu/g ; (2)將上述發酵產物加入適量蒸餾水置于搖床上150rpm振蕩 洗滌8min，然后用325目標準篩過濾并收集濾液，反復3次，最后將濾液在3000rpm下離心 15min，收集沉淀物備用。
[0040] (B)菌劑加工工藝
[0041] (1)將經固體發酵、離心后收集到沉淀物用0. 5% (W/W)甲基纖維素溶液（溶液用 無菌水配制）懸浮，并將懸浮液中活孢子的含量調節成>5.0乂108(^11/ 1^;(2)將亞甲基二 萘磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈣、輕質碳酸鈣和硅藻土按5:4:1:90的重量比混合后，通過氣 流粉碎使細度達到325目以上，然后加入配制好的孢子懸浮液，最后經50°C氣流烘干、攪拌 機混勻和包裝后加工成含擬康氏木霉TZ-11菌株活孢子的可濕性粉劑。其中所述擬康氏木 霉TZ-11菌株可濕性粉劑的活孢子含量彡1. OX 108cfu/g。
[0042] 實施3試驗實施例
[0043] (1)TZ-11菌株可濕性粉劑對圍小叢殼菌（Glomerella cingulata)的室內毒力
[0044] TZ-11菌株可濕性粉劑對圍小叢殼菌的室內毒力測定方法如下：
[0045] 分別用無菌水將1. OX 108cfu/gTZ-ll菌株可濕性粉劑和1. OX 106cfu/g寡雄腐 霉可濕性粉劑（北京比奧瑞生物科技有限公司）依次稀釋至一定濃度，再將lmL藥液與 9mLPDA培養基在培養皿內混勻，制成含系列梯度濃度藥劑的PDA培養基，各藥劑在PDA培養 基中的系列梯度濃度均設計為 1. 〇Xl〇5、5. 0X104、1. 0X104、5. 0X103、1. 0X103、5. 0X102 和1. OX 102cfu/mL，采用無菌水作對照，各處理重復4次。將保留的圍小叢殼菌移植到PDA 平皿中，在25°C下活化96h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5mm的菌餅，并移植到 上述含藥和空白對照的PDA平皿中，25 °C培養96h，待對照中菌落長至約平皿直徑的4/5時， 采用十字交叉法量取菌落直徑。計算菌落直徑平均值，并按照下列公式計算菌絲生長平均 抑制率：菌絲生長平均抑制率={(對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）八對照菌落直 徑均值-接種菌餅直徑）} X 100%。采用DPS數據處理系統，計算出各藥劑對圍小叢殼菌菌 絲生長抑制的回歸方程、EC5(I及其95 %置信限。
[0046] TZ-11菌株可濕性粉劑對圍小叢殼菌的室內毒力測定結果：
[0047] 室內毒力測定結果（表1)表明，TZ-11菌株可濕性粉劑和寡雄腐霉可濕性粉劑對 圍小叢殼菌菌絲生長抑制的EC 5(I分別為：8. 2979Χ102和1.4434X 103yg/mL，相差約1.7 倍，TZ-11菌株可濕性粉劑對圍小叢殼菌菌絲生長抑制的活性高于寡雄腐霉可濕性粉劑。
[0048] 表1TZ-11菌株的可濕性粉劑對圍小叢殼菌（Glomerella cingulata)的室內毒力 測定結果
[0049]
【權利要求】
1. 一株擬康氏木霉菌株，其特征在于，該菌株的分類命名為擬康氏木霉τζ-11 ΤΖ-11),該菌株已于2010年7月8號在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCC No. 3969。
2. 根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，SEQ ID NO :1所示的為rRNA基因序列對應 的DNA序列，該段rRNA包括了 18S rRNA片段，ITS1、5. 8S rRNA、ITS2區全序列及28S rRNA 序列片段。
3. 權利要求1-2所述的菌株在防治由圍小叢殼菌侵染引起 的炭疽病病害方面的應用。
4. 一種用權利要求1-2所述的菌株制備的可濕性粉劑。
5. -種制備根據權利要求4所述的可濕性粉劑的方法，其特征在于包括以下步驟： (A) 固體發酵培養物的獲得 (1) 將麥麩和鋸木屑按3:7(V/V)的比例混勻后，分別加入0. 1%(W/W)的蔗糖和碳酸銨， 并加水使含水量為6(T65%，pH調至7. 5-8. 0,再次混勻后在加厚的聚乙烯塑料袋內每袋分 裝1. 5kg，扎緊袋口，并在121°C下濕熱滅菌60 min ; 在水平槽固體發酵盤底部鋪墊2張滅菌報紙，加入滅菌后的固體發酵培養基1. 5 kg，裝 料厚度約為5 cm ; 將預先轉接到PDA平皿中的擬康氏木霉TZ-11菌株，置于培養箱內28°C培養7d后，用 無菌水洗下的孢子，用顯微鏡計數后將孢子液濃度調配為：1. 〇 X 1〇7個/mL ; 將100mL該孢子液均勻接種到1. 5 kg固體發酵培養基后，在發酵盤頂部蓋2張滅菌報 紙并用扎繩扎緊密封，最后放置于28°C保濕培養箱內發酵，發酵環境相對濕度達到80%以 上，發酵8-10d，發酵產物活孢子量可達1. 0-2. 0 X 109cfu/g ; (2) 將上述發酵產物加入適量蒸餾水置于搖床上150rpm振蕩洗滌8min，然后用325目 標準篩過濾并收集濾液，反復3次，最后將濾液在3000rpm下離心15min，收集沉淀物備用； (B) 菌劑加工工藝 ⑴將經固體發酵、離心后收集到沉淀物用〇.5%(W/W)甲基纖維素溶液懸浮，其中溶液 用無菌水配制，并將懸浮液中活孢子的含量調節成> 5. 0X108 cfu/mL ; (2)將亞甲基二萘磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈣、輕質碳酸鈣和硅藻土按5:4:1:90的重 量比混合后，通過氣流粉碎使細度達到325目以上，然后加入配制好的孢子懸浮液，最后 經50°C氣流烘干、攪拌機混勻和包裝后加工成含擬康氏木霉TZ-11菌株活孢子的可濕性粉 劑。
6. 根據權利要求5中所述的可濕性粉劑的制備方法，其特征在于所述的擬康氏木霉 TZ-11菌株活孢子含量彡1. OX 108cfu/g。
【文檔編號】C12N1/14GK104059860SQ201410316956
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月4日 優先權日:2014年7月4日
【發明者】陳宏州, 肖婷, 楊敬輝, 莊義慶 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所