煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtPDR6及其干擾表達載體和應用的制作方法

煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtPDR6及其干擾表達載體和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtPDR6及其干擾表達載體和應用，煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtPDR6的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示或SEQ?ID?NO.4所示氨基酸序列經取代、缺失或添加至少一個氨基酸，其編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示或SEQ?ID?NO.3所示核苷酸序列經取代、缺失或添加至少一個核苷酸，該蛋白具有抑制側枝，腋芽或側芽增生的作用，干擾表達后煙草的側枝生長明顯活躍，且腋芽或側芽增生明顯，對煙草株型的調控和提高煙葉產量有著重要的意義。
【專利說明】煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtPDR6及其干擾表達載體和應 用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，具體涉及煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtroR6,還涉及編 碼煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtroR6的基因及干擾該基因表達的載體和應用。

【背景技術】
[0002] 植物激素是受特定環境信號誘導產生的一類可調節植物生理反應的次生代謝 物質，它們在細胞分裂與伸長、組織與器官分化、開花與結實、成熟與衰老、休眠與萌發 等生長發育過程中起著重要的調控作用。常見的植物激素有生長素（auxin)、赤霉素 ((gibberellin，GA)、細胞分裂素（cytokinin，CTK)、脫落酸（abscisic acid, ΑΒΑ)、乙烯 (ethyne，ΕΤΗ)、水楊酸（salicylic acid, SA)、茉莉酸（jasmonic acid, JA)和油菜素甾醇 (brassinosteroid，BR)。其中，生長素和細胞分裂素是兩種傳統上認為控制植物分枝發育 的激素。然而近期研究發現，還有另外一種能夠調控植物分枝發育的激素，即獨腳金內酯 (strigolactone, SL)，屬于倍半廠類次生代謝物質。獨腳金內酯能夠抑制植物的分支和側 芽生長，并同生長素和細胞分裂素一起調控植物地上和底下部分的生長來維持株型。
[0003] 天然的獨腳金內酯類化合物主要有5種：獨腳金醇（strig〇l)、5-脫氧獨腳 金醇（5-deoxystrigol)、列當醇（orobanchol)、高梁內酯（sorgolactone)和黑蒴醇 (alectrol)。最早發現的獨腳金內酯是獨腳金醇，從非寄生植物棉花根系中分泌，以刺激惡 性的寄生雜草獨腳金、列當種子的萌發。隨后在玉米、高粱、煙草以及番茄中都分離到獨腳 金內酯化合物。研究還表明，獨腳金內酯也可以作為刺激因子促進AM真菌菌絲分枝，與植 物建立共生的關系。
[0004] 獨腳金內酯具有抑制植物分枝的功能，最早發現于對分枝增加的突變體的研究， 導致突變植株分枝增加原因在于天然獨腳金內酯的合成受阻。目前，關于獨腳金內酯合成 途徑調控植物分枝的研究已經在水稻、擬南芥、豌豆、矮牽牛中進行了較為深入的研究。獨 腳金內酯作為一種新型的激素，其對植物分枝發育的調控是與生長素和細胞分裂素相互作 用的過程。獨腳金內酯在根部能夠受低磷、生長素等信號的誘導合成，除了在根毛下表區 域分泌后參與促進AM菌絲分枝外，其余則要經木質部自下而上運輸，參與地上部側枝的抑 制。而生長素在植物的頂端合成之后，要極性下輸送參與抑制分枝。而細胞分裂素是極性 向上運輸，促進細胞分裂和參與組織分生，是生長素調控的第二激素。生長素可以通過促進 獨腳金內酯的合成或抑制細胞分裂素的水平來發揮對分枝的抑制。獨腳金內酯也可以通過 反饋作用影響生長素的激素水平。
[0005] 獨腳金內酯在根部或者地上部發揮其作用，要涉及從根部到地上部的一系列轉運 過程，這就需要轉運蛋白的參與。最近，在矮牽牛中發現了植物中第一個獨腳金內酯轉運蛋 白PhTORl，為ABC轉運蛋白ABCG亞家族成員。煙草作為重要的農作物，煙葉生長至后期，為 保證煙葉中的營養不向生殖器官轉移，要采取"打頂"的操作。但這一操作將破壞植株的頂 端優勢，導致側枝分生明顯，若不及時抹掉側芽，同樣會消耗葉片內營養，影響煙葉產量。研 究煙草獨腳金內酯的轉運分子機理將有助于通過分子手段控制植株的分枝，對煙草株型的 調控研究有著重要的理論和現實意義。然而，在現有的煙草研究報道中，有關煙草獨腳金內 酯的轉運相關基因未見報道。


【發明內容】

[0006] 有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6,本 發明的目的之二在于提供編碼煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6的基因；本發明的目的之 三在于提供干擾煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6表達的轉基因干擾表達載體；本發明的 目的之四在于提供上述干擾表達載體的構建方法；本發明的目的之五在于提供煙草獨腳金 內酯轉運蛋白NtH)R6的應用；本發明的目的之六在于提供煙草獨腳金內酯轉運蛋白基因 NtH)R6的應用；本發明的目的之七在于提供轉基因干擾表達載體的應用。
[0007] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0008] 1、煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtroR6,其氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示或SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列經取代、缺失或添加至少一個氨基酸且來源于煙草的具有獨腳金內酯 轉運蛋白功能的氨基酸序列。
[0009] 2、編碼權利要求1所述煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N0. 3所示或SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列經取代、缺失或添加至少一個核苷酸且來 源于煙草的具有獨腳金內酯轉運蛋白功能的核苷酸序列。
[0010] 3、干擾所述煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtroR6表達的轉基因干擾表達載體。
[0011] 優選的，所述干擾表達載體為含有干擾SEQ ID N0. 3所示序列表達的發夾結構經 Not I酶切位點連入pART27植物表達載體而得。
[0012] 更優選的，所述發夾結構含有如SEQ ID N0. 9所示的正向序列和反向序列。
[0013] 4、所述干擾表達載體的構建方法，包括如下步驟：以SEQ ID N0. 10和SEQ ID NO. 11所示序列為引物，煙草的根組織cDNA為模板進行PCR擴增獲得正向序列，將正向序列 通過Xhol和ΚρηΙ酶切位點連入pHANNIBAL載體，獲得含有正向序列的pHANNIBAL載體；然 后以SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 13所示序列為引物，煙草的根組織cDNA為模板進行PCR擴 增獲得反向序列，將獲得的反向序列通過Xbal和Hindlll連入含有正向序列的pHANNIBAL 載體，獲得含有正向序列和反向序列的pHANNIBAL載體，再利用Not I酶切位點從含有正 向序列和反向序列的pHANNIBAL載體切下發夾結構序列并連入經Not I酶切、去磷酸化的 PART27植物表達載體中，即得干擾表達載體。
[0014] 5、所述煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6在抑制煙草側枝、腋芽或側芽增長中的 應用。
[0015] 6、所述編碼煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6的基因在抑制煙草側枝、腋芽或側 芽增長中的應用。
[0016] 7、所述干擾表達載體在促進煙草側枝、腋芽或側芽增長中的應用。
[0017] 本發明的有益效果在于：本發明利用矮牽牛獨腳金內酯轉運蛋白PhroRi的序列 設計引物序列，經擴增獲得煙草獨腳金內酯轉運蛋白基因的核苷酸序列，從而獲得了該基 因編碼的氨基酸序列，該基因在缺磷、Me JA和NAA誘導下能夠提高NtroR6基因的表達量，但 受NaCl和ΑΒΑ的影響較小；本發明還公開了干擾NtH)R6基因表達的干擾表達載體，利用干 擾表達載體轉化煙草后獲得的轉基因陽性株系NtroR6基因表達量降低，從株型來看轉基 因陽性株系分枝明顯增多，側枝生長活躍，莖部腋芽和側芽增生明顯，因此可以利用該基因 來抑制煙草分枝，抑制腋芽和側芽增生，相反也可以通過干擾該基因的表達促進煙草分枝， 促進腋芽和側芽增生，對煙草株型的調控具有重要的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0019] 圖1為NtroR6基因在誘導表達特征（"+P"表示植株添加磷元素營養液中培養， "-P"表示缺磷營養液中培養，"H 20"、"ΑΒΑ"、"MeJA"、"NAA"和"NaCl "分別表示在營養液中 添加 H20、ABA、MeJA、NAA和NaCl誘導處理下培養）。
[0020] 圖2為NtroR6(RNAi)-pART27轉基因干擾載體示意圖（35Sp表示為35S啟動子， NtH)R6S為NtH)R6正向片段，NtH)R6R為NtH)R6反向片段，intron為內含子片段，0CS terminator為0CS終止信號；NPT II新霉素磷酸轉移酶基因，L和R分別表示T-DNA轉基因 載體的左右邊界）。
[0021] 圖3為?；代轉基因株系的鑒定結果（"WT"表示野生型煙草，1，2, 3,4, 5為葉盤轉 化后獲得的?；代轉基因株系；A圖為Nptll基因在植株基因組中的PCR擴增結果；B圖為 CaMV35S啟動子在植株基因組中的PCR擴增結果）。
[0022] 圖4為轉基因陽性苗NtH)R6的基因表達結果（"WT"表示野生型煙草，L2和L5表 示轉基因干擾陽性植株）。
[0023] 圖5為轉基因陽性苗的表型特征（A :左為野生型煙草，右為轉基因陽性煙草；B圖 顯示轉基因陽性植株分生的側枝，C表示近地面處莖部腋芽和側芽增生表型明顯，箭頭指示 增生的側枝）。

【具體實施方式】
[0024] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 實施例1、克隆煙草NtH)R6基因
[0026] 根據矮牽牛獨腳金內酯轉運蛋白PhroRl的序列，設計擴增煙草獨腳金內酯轉運 蛋白基因（NtPDR6)編碼區的引物，具體引物如下：
[0027] NtPDR6_fw :5'-atggagggtggtgaagacag-3'（SEQ ID NO. 1);
[0028] NtPDR6_rev :5'-atggagggtggtgaagacag-3'（SEQ ID NO. 2);
[0029] 然后以煙草紅花大金元的根組織cDNA為模板，分別以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,所示的引物對進行PCR擴增，PCR擴增條件為：94°C預變性4min。94°C變性30s，56°C 退火30s，72°C延伸240s，共30個循環。再72°C終延伸10min，4°C保存。將擴增獲得的序 列測序后獲得如SEQ ID N0.3所示序列，含有4482bp個核苷酸，為一個完整的開放式閱讀 框，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0030] 實施例2、NtroR6在激素及低磷處理下的誘導表達分析
[0031] 將生長至"大十字"期的煙草幼苗從營養土中轉移至去離子水中，恢復生長3天后 進行缺磷、激素及高鹽誘導處理。
[0032] 缺磷處理：將恢復生長的煙草幼苗轉入不含磷元素的MS培養基中培養，對照組則 放入正常的MS培養基中培養，兩周后取幼苗于1. 5mL離心管中，液氮速凍，-80°C保存備用。
[0033] 激素處理：將恢復生長的煙草幼苗分別放入添加了 50μΜ ΑΒΑ、100μΜ MeJA、 30 μ Μ NAA的營養液中培養，同時以添加等量水的營養液作為對照，處理24h后取幼苗于 1. 5mL離心管中，液氮速凍，-80°C保存備用。
[0034] 高鹽誘導處理：將恢復生長的煙草幼苗放入添加了 20mM NaCl的營養液中培養， 處理24h后取幼苗于1. 5mL離心管中，液氮速凍，-80°C保存備用。
[0035] 設計檢測Ν?Η)Κ6基因的突光定量引物，具體為：NtPDR6_q_fw :5' -tggaatgaaggac aggaggctaa-3'（SEQ ID NO. 5), NtPDR6_q_rev :5'-gtccaaccatcatctcccctgtag-3'（SEQ ID NO. 6);同時以煙草GAPDH (NtGAPDH)基因為內參，具體引物為NtGAPDH-q-fw: 5' -tgggtgt caacgagaaggaa-3' （SEQ ID N0.7) ;NtGAPDH-q-rev:5'-tctgggtggcagtaaggga_3' （SEQ ID NO. 8)。然后將保存的材料用于提取RNA，進行反轉錄成cDNA，然后上述熒光定量進行熒光 定量檢測，熒光定量PCR條件為95°C預變性10s，95°C變性5s，60°C退火30s，39個循環，然 后統計C t值。將Ct值通過2_ΛΛα計算NtH)R6基因表達量，結果如圖1所示。由圖1可知， 在缺磷、MeJA和NAA誘導處理后NtH)R6表達量大幅度提高，而在NaCl和ΑΒΑ誘導處理后 NtH)R6表達量變化不大。表明在缺磷、MeJA和ΝΑΑ誘導下能夠提高NtH)R6基因的表達量。
[0036] 實施例3、NtH)R6基因干擾載體構建
[0037] 根據獲得的NtH)R6基因序列在N端設計一對擴增長度為315bp截斷片段（SEQ ID N0.9)的引物（包括正向片段引物和反向片段引物），并根據pHANNIBAL中間載體的酶切位 點在引物的上游和下游分別設計酶切位點，并以酶切位點控制序列的插入方向，從而獲得 RNAi干擾載體的干擾序列。
[0038] 具體引物序列如下：
[0039] 正向片段引物：
[0040] NtPDR6-if-fw ：5' -ccgctcgagtaactaaacttgatttggtggaaag-3' (SEQ ID NO. 10), 下劃線表示Xhol酶切位點；
[0041] NtPDR6_if-rew :5'-cggggtaccctggtttgatgattccactgactt-3' (SEQ ID NO. 11), 下劃線表示Kpnl酶切位點；
[0042] 反向片段引物：
[0043] NtPDR6-ir-fw ：5' -tgctctagataactaaacttgatttggtggaaag-3' (SEQ ID NO. 12), 下劃線表示Xbal酶切位點；
[0044] NtPDR6-ir~rew ：5'-cccaagcttctggtttgatgattccactgactt_3' (SEQ ID NO. 13), 下劃線表示Hindlll酶切位點；
[0045] 然后分別以 SEQ ID Ν0· 10 和 SEQ ID Ν0· 11，SEQ ID Ν0· 12 和 SEQ ID Ν0· 13 的 序列為引物，實施例1中合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增條件為：94°C預變性 4min。94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 240s，共 30 個循環。再 72°C終延伸 10min， 4°C保存，擴增產物經瓊脂糖凝膠純化后分別連入克隆載體pEASY-Tl，分別獲得含有正向片 段的pEASY-T 1載體和含有反向片段的pEASY-T 1載體。將含有正向片段的pEASY-T 1載體通 過Xhol和Kpnl酶切后連入經同樣酶切的pHANNIBAL載體中，得含有正向片段的pHANNIBAL 載體；再將含有反向片段的PEASY-T1載體通過Xbal和Hindlll雙酶切，并連入經同樣酶切 的含有正向片段的PHANNIBAL載體中，形成中間載體，命名為NtH)R6 (RNAi) -pKANNIBAL。將 構建的中間載體NtroR6(RNAi)-pKANNIBAL用Not I酶切之后連入經Not I酶切的、去磷酸 化的PART27植物表達載體中，獲得轉基因干擾表達載體，命名為NtH)R6 (RNAi)-pART27,其 結果如圖2所示。
[0046] 實施例4、基因干擾載體的農桿菌轉化及轉基因煙草植株的獲得
[0047] (1) NtH)R6 (RNAi) -pART27干擾表達載體轉化農桿菌
[0048] 從_80°C冰箱中取出農桿菌LBA4404感受態細胞，在冰上凍融，待即將解凍時加 入NtroR6(RNAi)-pART27干擾表達載體，輕彈混勻；將混合物加入到預冷的2mm電轉杯中， 置于冰上5分鐘；將電轉儀參數調至：電壓2. 5kV ;電容：25yF ;電阻200Ω ;用紙吸取電 轉杯外壁上的水滴，把電轉杯放入電擊槽中，電擊5ms，然后迅速加入800 μ L28°C預熱的 YEB液體培養基，并于220rpm，28°C振蕩復蘇3小時；復蘇后將菌液在4500rpm條件下離 心lmin，棄一半體積的上清，重新懸浮后均勻涂與含有Rif(100y g/mL)、Str(50y g/mL)和 Kan (50 μ g/mL)的YEB固體培養基上，28°C倒置培養約2-3天，直至單菌落形成；挑取單菌 落，擴培后菌液通過PCR鑒定陽性克隆，獲得工程菌。
[0049] (2)轉基因煙草的獲得
[0050] 取煙草無菌苗葉片，用打孔器將葉片處理成直徑0.5cm大小的葉盤，葉背朝下， 在MS固體培養基上預培養3天；同時活化工程菌，具體方法為：挑取陽性單菌落，在2mL含 有 Rif(100 μ g/mL)、Str (50 μ g/mL)和 Kan(50 μ g/mL)的 YEB 培養基過夜培養；取 lmL 菌 液，加入到50mL含相同抗性的YEB培養基中，28°C，200rmp培養至0D達到0. 6左右，然后 在4000rpm條件下離心5min，用20mL的MS液體培養基懸浮菌體30分鐘；然后將預培養的 葉片放入懸浮菌液中，侵染10分鐘，用無菌的濾紙吸干葉片多余的菌液，在MS+6-BA(2mg/ L)+NAA(0. 5mg/L)的固體培養基上暗培養3天；然后用含有400mg/L頭孢霉素（Cef)的無 菌水清洗葉盤，無菌濾紙吸去多余的液體，再將葉盤轉到含有6-BA(2mg/L)、NAA(0. 5mg/ L)、Cef (200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固體篩選培養基上，28°C光照培養；待不定芽長到 0. 5cm時，轉移到含Cef (200mg/L)和Kan (50mg/L)的MS固體培養基上生根，得到TQ代轉基 因株系。
[0051] 待幼苗在含有卡那霉素的抗性培養基上生根之后，剪取葉片，在DNA水平鑒定陽 性轉基因株。具體方法為，設計轉基因干擾載體上CaMV35S啟動子序列和Npt II基因的擴 增引物，具體為：
[0052] 35S_fw :5,-gaagggtcttgcgaaggata-3，（SEQ ID N0. 14);
[0053] 35S_rev :5'-ttgtaaaacgacggccagtg-3'（SEQ ID NO. 15);
[0054] Npt Il-fw:5,-ataccgtaaagcacgaggaag-3，（SEQ ID NO. 16);
[0055] Npt II-rev:5'-ctgaagcgggaagggact-3' (SEQ ID NO. 17)；
[0056] ，然后以?；代轉基因株系DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增條件為：94°C預變性 4min。94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 45s，共 25 個循環；再 72°C終延伸 10min，4°C 保存。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。結果顯示，2號和5號轉基因株系有 目的基因擴增，表明2號和5號轉基因株系為陽性株系，分別命名為L2和L5。
[0057] 取L2和L5轉基因陽性株系提取煙草根部的RNA，反轉合成cDNA后通過qRT-PCR 分析NtroR6基因表達量，同時提取野生型煙草作為對照，檢測方法與實施例2相同，其檢測 結果如圖4所示。結果顯示，L2和L5轉基因陽性株系中NtH)R6基因表達量明顯低于野生 型煙草的NtH)R6基因表達量，表明轉基因陽性株系中NtH)R6基因表達量明顯下調。
[0058] 觀察L2和L5轉基因陽性苗的表型特征：分別將野生型和轉基因陽性株系移栽至 盆中，溫室培養5周左右，然后觀察轉基因陽性株系和野生型煙草的表型特征，結果如圖5 所示。結果顯示，轉基因陽性苗與野生型煙草相比，L5株呈明顯的多分枝表型，葉片數目增 多。表明干擾NtH)R6基因表達后植株分生的側枝生長活躍，近地面處莖部腋芽和側芽增生 表型明顯。相反，NtH)R6基因的表達具有具有抑制植株腋芽和側芽的增生，因此可以通過 控制NtH)R6基因表達控制植株腋芽和側芽的增生。
[0059] 最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通 過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在 形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。
[0001] _序歹丨j表_ <110>西南大學 <120>煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtPDR6及其干擾表達載體和應用 <160 17 <210 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>擴增煙草獨腳金內酯轉運蛋A基因引物NtPDR6- % <400> 1 啤gagggtg glga嗯1cag 20 <210> 2 <211> 20 <2I2> DNA <213>人丄序列 <220> <223>擴增煙草獨腳金內酯轉運蛋白基因引物NtPDR6- rev <400> 2 atggagggig gtgaagacag 20 <2i0> 3 <211> 4482 <212> DNA <2)3> 佩草（Nicotiana tabacim Linn,) <220> <223>煙草獨腳金內酯轉運蛋白基因 <400> 3
[0002] atggagggtg gtgaagacag ttttagggta agtagtgcac gtttgagtag Gtcaaatgta 60 tggaggaata gtgcaatgga tgtgttttca agatcttcaa gagaagcaga tgatgaagag 120 gcattaaaat gggctgctct tgagaaatta ccaacttatc ttcgtataag gagaggtatt 180 ctcactgaag aagaaggcca atctagagaa gttgatataa ctaaacttga tttggtggaa 240 aggaggaatt tattagaaag gcttgtcaag attgctgatg aagai:aa1:ga gaagttcttg 300 ttgaaactca aaa,agcgca,t tgctagagtt ggtcttgatc ttcctacaat tgaagtccgg 360 tttgagcatg tgagtgtaga tgcagaagct agagttggta gtagagctct acctacaata 420 ttcaacttca cagttaacat cttagaggat ttcttgaact atcttcatat tcttccaagt 480 agaaagaaac cattgccaat ccttcacgaa gtcagtggaa tcatcaaacc aggaagaatg 540 acactgcttt taggaccacc aagttctgga aaaaccacat tgttattagc tttggctggg 600 aaactagata aagatctcaa agtttcaggg agagttacat ataatggcca tggaatggat 660 gagtttgtac cacaaagatc atctgcttat ataagccaaa atgatcttca tattggagaa 720 atgacagtta gggaaacact ggcattttct gctagatgtc aaggagttgg agccaaatat 780 gaaattttgg cagagctgtc tagaagagag aagggagcaa atattaaacc agatcctgat 840 gtcgatatct ttatgaagtc agcatggaat gaaggacagg aggctaatgt ggtaacggat 900 tatactctca agatattggg acttgaaatt tgtgctgata ccctcgttgg agatgaaatg 960 attcgaggaa tttcaggagg gcagagaaag agactaacta caggggagat gatggttgga 1020 ccagcaagag cactttttat ggatgagata tcaactggtt tagatagttc aacaacttat 1080 cagattgtga attcaattag gcaatcaatc cacattcttc aaggaactgc tgtaatctca 1140 cttcttcagc ctgcaccaga aacttatgac ttgttcgacg atatcattct tctatcagat 1200 gggcaaattg tgtaccaagg tccccgggaa aatgtacttg agttcttcga gtacatgggc 1260 ttcatgtgtc ctgagaggaa aggcgtcgct ga,ttt,cttac aagaagtgac atcaaggaag 1320 gatcaagagc aatactgggc acgtcgtgat gaaccttata agtatattac agtgcgcgaa 1380 ttttctgaat catttcaatc atttcacatt ggaaggaagc ttggtgatga gcttgctgtt 1440 ccttttgata aatcaaagag ccaccctgcc gctctaacca caaagaagta tggtattagc 1500 aagaaagaac tcttaaaagc ctgcacagct agagaatacc ttcttatgaa gaggaattca 1560 ttcgtctata tattcaagat gatacaacta acattgatgg cttctataac aatgacgctg 1620 ttcctacgaa ctgagatgca cagaaataca acaacagatg gtgctgtttt cttgggtgca 1680 ctgttctatg cagttatcat gattatgttc aatggattct cagagcttgc cctcagtatt 1740 atgaagcttc cttcctttta caaacaacgc gatcttcttt tctttcctgc ttgggcatat 1800 gctcttccta cttggatcct caagataccg gtcacacttg tagaagttgc catttgggtg 1860 tgtatgactt attatgttat tggattcgag gcggatgttg ggaggttctt caaacagtta 1920 tttctgctca tatgtgttaa ccaaatggcc tcggggctgt ttcgattcat aggagctctt 1980 ggaaggaatg tcattgttgc aaatacattt ggatcatgtg cactaGtcac agttcttgta 2040 atgggtggat tcattctgtc aagagatgac gtgaagaagt ggtggatatg gggctactgg 2100 atttcgccta tgatgtacgc acagaatgct atcgctgtga atgaatttct agggaagagt 2160 tgggcacatg ttcctcctaa ctccacgggc acagagacat t.aggagtatc attcttgaaa 2220 tcgcgtggaa tctttccaga agcaagatgg tattggattg gagcaggagc tcttcttgga 2280 tatgttttac tcttcaattt catgttcact gtggccttag cttatctcaa cccatttggt 2340 aaatctcagg cagttctttc agaagaaact gttgccgaga ggaatgcaag caaaaggggt 2400 gaggttattg aactatctcc gatagaaaag cgctcttctg aaagaggaaa tgatgttcgg 2460 cgaagtgcat. cttccaggtc tatgtcctca agggtaggca gcattactga ggctgattta 2520 aacaagagaa ggggaatgat tctccctttt gagccccttt ctattacttt tgacgatatc 2580 agatacgcag tagatatgcc acaggaaatg aaagctcaag gtgtggctga ggatcggctt 2640
[0003] gaactcttga aaggtgtgag tggtgctttt aggccaggag ttttgacagc tctaatgggt 2700 gtaagtggag ctggtaagac cacccttatg gatgtcttag ctggtaggaa aactggcgga 2760 tacattgacg gaaccatcag tatatcaggg tacccgaaac aacaagaaac gtttgcgcgg 2820 atagctggat actgtgagca aactgacatt cattcacctc atgttacagt. atatgaatca 2880 ttgcagtttt ctgctttgct tcgattgcct cgtgaagttg acactgaaac tagaaagatg 2940 ttcgttgaag aggtcatgga actcgtagag cttacccctc taagagaagc acttgttgga 3000 ttgcctggcg tgaatggtct ttGaactgaa caacgaaaac ggcttacagt tgcagttgaa 3060 cttgttgcca acccttctat aatattcatg gatgagccaa cctctggact agatgctaga 3120 gcagctgcaa tagtgatgag aacagttaga aacacggtag atacaggccg aacagtggta 3180 tgcactatcc atcagcctag catcgacata tttgatgctt tcgatgagct cctactcctg 3240 aaacgaggag gtgaagaaat atatgtcggc ccattaggac gccattcttc tcaccttatt 3300 aagtattttg agggaattga tggagttcca aaaatcaaag atggttataa tccagcaaca 3360 tggatgttgg agataacttc agtagcacaa gaagcagctc gcgtaattga ctttacagaa 3420 ttatacaaga actcagaatt gtataggaga aacaaagcat taatcaagga actaagtgta ,3480 ccaccccctt gttcaaaaga cctctacttt ccaactaagt actcccaatc tttcttcacc 3540 caatgcaagg cttgtttctg gaaacagcac tggtcatact ggagaaatcc accttacaca 3600 gcagtcaggc tcatgtttac attctttatt gctctcatgt ttggaacaat attctgggat 3660 cttggctcca gaaggaaaag gcaacaagat cttttgaatg ctataggttc aatgtatgct 3720 gctgtcttgt ttcttggtgt acaaaatgca acttcagtgc agccagttat tgccattgag 3780 aggacggaaa gagcggctgg aatgtactct gctctgcctt atgctttcgg acaggttatg 3840 attgagGtcc catacctttt catccagacg atcatatatg gagttatagt atatgtcatg 3900 atcggatttg aatggacagt tgccaagttc ttttggtatc tgttctttat gtatttcacc 3960 ttgttatact tcacattgta tgggatgatg acagtagctg ttactcctaa tcacagcatt 4020 gcagccatca tttcatctgc attttatgca atatggaacc ttttctgtgg attcgtcgtt 4080 ccaaaaacag acttagtctt ctatggaagc aagtccgatg gcagcaactt tgtcttgagt 4140 atcacggtct gcgcgcgaat tgctgttggc gtacgcgaca ctatttggat ctgccagtgg 4200 ctaggcgctg gtgcttggca ttgggtctgc gcgcggggaa ctgtctgtgc gggcagcgct 4260 gttggcaaca tgatggtttg tgcgcgtagc attgtcggta cgcgcggcac tgatggcatt 4320 cgccagGCgc tgggcgctga aactgattat cggtgggacg acagaggcgt atgcgtgctt 4380 gttacttggc gctgccaaga ccacggggcc gaccgtggct ctaggcgttg ggaggcttgc 4440 cgggatgcca cggggcgcgt ccaaggggtc atgggtcgat ga 4482 <210 4 <211> 1493 <2I2> PRT <213 > 煙草（Linn.) <220> <223>煙草獨腳金內酯轉運蛋白 <400> 4 Met Glu Gly Gly Glu Asp Ser Phe Arg Val Ser Ser Ala Arg Leu
[0004] 15 10 15 Scr Ser Ser Asn Val Trp Arg Asn Ser Ala Met Asp Val Phe Ser 20 25 30 Arg Scr Scr Arg Glu Ala Asp Asp Glu Glu Ala Leu Lys Trp Ala 35 40 ,15 Ala Leu Glu Lys Leu Pro Thr Tyr Leu Arg lie Arg Arg Gly lie 50 55 60 Leu Thr Glu Glu Glu Gly Gin Ser Arg G丄u Val Asp 丄丄e Thr lys 65 70 75 Leu Asp Leu Val Glu Arg Arg Asn Leu Leu Glu Arg Leu Val Lys 80 85 90 lie Ala Asp Glu Asp Asn Glu Lys Phe Leu Leu Lys Leu Lys Lys 95 100 105 Arg lie Ala Arg Val Gly Leu Asp Leu Pro Thr lie Glu Val Arg 110 115 120 Phe Glu His Val Ser Val Asp Ala Glu Ala Arg Yal Gly Ser Arg 125 130 135 Ala Leu Pro Thr lie Phe Asn Phe Thr Val Asn lie Leu Glu Asp 140 1.15 150 Phe Leu Asn Tyr Leu His lie Leu Pro Ser Arg Lys Lys Pro Leu 丄55 160 165 Pro He Leu His Glu Val Ser Gly lie lie Lys Pro Gly Arg Met 170 175 180 Thr Leu Leu Leu Gly Pro Pro Ser Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu 185 190 195 Leu Ala Leu Ala Gly Lys Leu Asp Lys Asp Leu Lys Val Ser Gly 200 205 210 Arg Val Thr Tyr Asn Gly His Gly Met Asp Glu Phe Val Pro Gin 215 220 225 Arg Ser Ser Ala Tyr lie Ser Gin Asn Asp Leu His lie Gly Glu 230 235 240 Met Thr Val Arg Glu Thr Leu Ala Phe Ser Ala Arg Cys Gin Gly 245 250 255 Val Gly Ala Lys Tyr Glu lie Leu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Glu
[0005] 260 265 270 Lys Gly Ala Asn lie Lys Pro Asp Pro Asp Val Asp lie Phe Met 275 280 285 Lys Scr Ala Trp Asn Glu Gly Gin Glu Ala Asn Val Val Thr Asp 290 295 300 Tyr Thr Leu Lys lie Leu Gly Leu Glu lie Cys Ala Asp Thr Leu 305 310 315 Val Gly Asp G丄u Met 丄丄e Arg Gly lie Ser G丄y Gly Gin Arg Lys 320 325 330 Arg Leu Thr Thr Gly Glu Met Met Val Gly Pro Ala Arg Ala Leu 335 3-10 315 Phe Met Asp Glu lie Ser Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Thr Tyr 350 355 360 Gin lie Val Asn Ser lie Arg Gin Ser lie His lie Leu Gin Gly 365 370 375 Thr Ala Val lie Ser Leu Leu Gin Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Asp 380 385 390 Leu Phe Asp Asp lie lie Leu Leu Ser Asp Gly Gin lie Val Tyr 395 400 105 Gin Gly Pro Arg Glu Asn Val Leu Glu Phe Phe Glu Tyr Met Gly 110 415 420 Phe Met Cys Pro Glu Arg Lys Gly Val Ala Asp Phe Leu Gin Glu 125 430 135 Val Thr Ser Arg Lys Asp Gin Glu Gin Tyr Trp Ala Arg Arg Asp 440 445 450 Glu Pro Tyr Lys Tyr lie Thr Val Arg Glu Phe Ser Glu Ser Phe 155 460 465 Gin Ser Phe His lie Gly Arg Lys Leu Gly Asp Glu Leu Ala Val 170 175 180 Pro Phe Asp Lys Ser Lys Ser His Pro Ala Ala Leu Thr Thr Lys 185 490 195 Lys Tyr Gly lie Ser Lys Lys Glu Leu Leu Lys Ala Cys Thr Ala 500 505 510 Arg Glu Tyr Leu Leu Met Lys Arg Asn Ser Phe Val Tyr lie Phe
[0006] 515 520 525 Lys Met lie Gin Leu Thr Leu Met Ala Ser lie Thr Met Thr Leu 530 535 510 Phc Leu Arg Thr Glu Met His Arg Asn Thr Thr Thr Asp Gly Ala 5X15 550 555 Val Phe Leu Gly Ala Leu Phe Tyr Ala Val lie Met lie Met Phe 560 565 570 Asn Gly Phe Ser Giu Leu Ala Leu Ser 丄丄e Met Lys Leu Pro Ser 575 580 585 Phe Tyr Lys Gin Arg Asp Leu Leu Phe Phe Pro Ala Trp Ala Tyr 590 595 600 Ala Leu Pro Thr Trp lie Leu Lys lie Pro Val Thr Leu Val Glu 605 610 615 Val Ala lie Trp Val Cys Met Thr Tyr Tyr Val lie Gly Phe Glu 620 625 630 Ala Asp Val Gly Arg Phe Phe Lys Gin Leu Phe Leu Leu lie Cys 635 640 615 Val Asn Gin Met Ala Ser Gly Leu Phe Arg Phe lie Gly Ala Leu 650 655 660 Gly Arg Asn Val lie Val Ala Asn Thr Phe Gly Ser Cys Ala Leu 665 670 675 Leu Thr Val Leu Val Met Gly Gly Phe lie Leu Ser Arg Asp Asp 680 685 690 Val Lys Lys Trp Trp lie Trp Gly Tyr Trp lie Ser Pro Met Met 695 700 705 Tyr Ala Gin Asn Ala lie Ala Val Asn Glu Phe Leu Gly Lys Ser 710 715 720 Trp Ala His Val Pro Pro Asn Ser Thr Gly Thr Glu Thr Leu Gly 725 730 735 Val Ser Phe Leu Lys Ser Arg Gly lie Phe Pro Glu Ala Arg Trp 740 lAh 750 Tyr Trp Lie Gly Ala Gly Ala Lou Leu Gly Tyr Val Leu Leu Phe 755 760 765 Asn Phe Met Phe Thr Val Ala Leu Ala Tyr Leu Asn Pro Phe Gly
[0007] 770 775 780 Lys Ser Gin Ala Val Leu Ser Glu Glu Thr Val Ala Glu Arg Asn 785 790 795 Ala Scr Lys Arg Gly Glu Val lie Glu Leu Ser Pro lie Glu Lys 800 805 810 Arg Ser Ser Glu Arg Gly Asn Asp Val Arg Arg Ser Ala Ser Ser 815 820 825 Arg Ser Met Ser Ser Arg Va.丄 Gly Ser 丄丄e Thr Glu Ala. Asp Leu 830 835 840 Asn Lys Arg Arg Gly Met lie Leu Pro Phe Glu Pro Leu Ser lie 8?5 850 855 Thr Phe Asp Asp lie Arg Tyr Ala Val Asp Met Pro Gin Glu Met 860 865 870 Lys Ala Gin Gly Val Ala Glu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Lys Gly 875 880 885 Val Ser Gly Ala Phe Arg Pro Gly Val Leu Thr Ala Leu Met Gly 890 895 900 Val Ser Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Met Asp Val Leu Ala Gly 905 910 915 Arg Lys Thr Gly Gly Tyr lie Asp Gly Thr lie Ser lie Ser Gly 920 925 930 Tyr Pro Lys Gin Gin Glu Thr Phe Ala Arg lie Ala Gly Tyr Cys 935 940 945 Glu Gin Thr Asp lie His Ser Pro His Val Thr Val Tyr Glu Ser 950 955 %() Leu Gin Phe Ser Ala Leu Leu Arg Leu Pro Arg Glu Val Asp Thr 965 970 975 Glu Thr Arg Lys Met Phe Val Glu Glu Val Met Glu Leu Val Glu 980 985 990 Leu Thr Pro Leu Arg Glu Ala Leu Val Gly Leu Pro Gly Val Asn 995 1000 1005 Gly Leu Ser Thr Glu Gin Arg Lys Arg Leu Thr Val Ala Val Glu 1010 1015 1020 Leu Val Ala Asn Pro Ser lie lie Phe Met Asp Glu Pro Thr Ser
[0008] 1025 1030 1035 Gly Leu Asp Ala Arg Ala Ala Ala lie Val Met Arg Thr Val Arg 1040 1045 1050 Asn Thr Val Asp Thr Gly Arg Thr Val Val Cys Thr lie His Gin 1055 1060 1065 Pro Ser lie Asp lie Phe Asp Ala Phe Asp Glu Leu Leu Leu Leu 1070 1075 1080 Lys Arg Gly Gly Glu Glu 丄丄e Tyr Va丄 Gly Pro Leu G丄y Arg His 1085 1090 1095 Ser Ser His Leu lie Lys Tyr Phe Glu Gly lie Asp Gly Val Pro 1100 110.5 1110 Lys lie Lys Asp Gly Tyr Asn Pro Ala Thr Trp Met Leu Glu lie 1115 1120 1125 Thr Ser Val Ala Gin Glu Ala Ala Arg Val lie Asp Phe Thr Glu 1130 1135 1140 Leu Tyr Lys Asn Ser Glu Leu Tyr Arg Arg Asn Lys Ala Leu lie 1145 1150 1155 Lys Glu Leu Ser Val Pro Pro Pro Cys Ser Lys Asp Leu Tyr Phe 1160 1165 1170 Pro Thr Lys Tyr Ser Gin Ser Phe Phe Thr Gin Cys Lys Ala Cys 1175 1180 1185 Phe Trp Lys Gin His Trp Ser Tyr Trp Arg Asn Pro Pro Tyr Thr 1190 1195 1200 Ala Val Arg Leu Met Phe Thr Phe Phe lie Ala Leu Met Phe Gly 1205 1210 1215 Thr lie Phe Trp Asp Leu Gly Ser Arg Arg Lys Arg Gin Gin Asp 1220 1225 1230 Leu Leu Asn Ala lie Gly Ser Met Tyr Ala Ala Val Leu Phe Leu 1235 1240 12?5 Gly Val Gin Asn Ala Thr Ser Val Gin Pro Val lie Ala lie Glu 1250 1255 1260 Arg Thr Glu Arg Ala Ala Gly Met Tyr Ser Ala Leu Pro Tyr Ala 1265 1270 1275 Phe Gly Gin Val Met lie Glu Leu Pro Tyr Leu Phe lie Gin Thr
[0009] 1280 1285 1290 lie lie Tyr Gly Val lie Val Tyr Val Met He Gly Phe Glu Trp 1295 1300 1305 Thr Val Ala Lys Phe Phe Trp Tyr Leu Phe Phe Met Tyr Phe Thr 1310 1315 1320 Leu Leu Tyr Phe Thr Leu Tyr Gly Met Met Thr Val Ala Val Thr 1325 1330 1335 Pro Asn His Ser 丄丄e Ala A丄a lie 丄丄e Ser Ser A丄a Phe Tyr Ala 1340 1345 1350 lie Trp Asn Leu Phe Cys Gly Phe Val Val Pro Lys Thr Asp Lou 1355 1360 1365 Val Phe Tyr Gly Ser Lys Ser Asp Gly Ser Asn Phe Val Leu Ser 1370 1375 1380 lie Thr Val Cys Ala Arg lie Ala Val Gly Val Arg Asp Thr lie 1385 1390 1395 Trp lie Cys Gin Trp Leu Gly Ala Gly Ala Trp His Trp Val Cys 1400 1405 1410 Ala Arg Gly Thr Val Cys Ala Gly Ser Ala Val Gly Asn Met Met 1415 1420 1425 Val Cys Ala Arg Ser lie Val Gly Thr Arg Gly Thr Asp Gly lie 1430 1435 1440 Arg Gin Pro Leu Gly Ala Glu Thr Asp Tyr Arg Trp Asp Asp Arg 1445 1450 1455 Gly Val Cys Val Leu Val Thr Trp Arg Cys Gin Asp His Gly Ala 1460 1465 1470 Asp Arg Gly Ser Arg Arg Trp Glu Ala Cys Arg Asp Ala Thr Gly 1475 1480 1485 Arg Val Gin Gly Val Met Gly Arg 1490 1493 <2!0> 5 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列
[0010] <220> <223> NLPDR6基因的熒光定量上游引物 <400> 5 tggaatgaag gacaggaggc taa 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> NtPDR6基因的熒光定量下游引物 <400> 6 Glccaaccal caicicccci glag 24 <210 7 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列 <220 <223> MC^LPD//基因的熒光定量上游引物 <400> 7 tggglgtcaa cgagaaggaa 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213>人下序列 <220> <223> MGAPD//基因的熒光定最下游引物 <400> 8
[0011] Iclggglggc aguicigggci 19 <210> 9 <211> 315 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> NtPDR6基因截斷片段 <400> 9 taactaaact tgatttggtg gaaaggagga atttattaga aaggcttgtc aagattgctg 6U atgaagataa tgagaagttc ttgttgaaac tcaaaaagcg cattgctaga gttggtcttg 120 atcttcctac aattgaagtc cggtttgagc atgtgagtgt agatgcagaa gctagagttg 18(J gtagtagagc tctacctaca atattcaact tcacagttaa catcttagag gatttcttga 240 actatcttca tattcttcca agtagaaaga aaccattgcc aatccttcac gaagtcagtg 300 gaatcatcaa accag 315 <210> 10 <2!1> 34 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>正向片段上游引物 <400> 10 ccgclcgagl aactaaaclt galllgglgg aaag 34 <210> 11 <211> 33 <212> DNA [0012] <2〗3>人丁i序列 <220> <223>正向片段下游引物 <400〉 11 cggggtaccc Iggttigalg altccactga ctt 33 <210> 12 <211〉 33 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>反向片段上游引物 <400> 12 tgclclagal aaclaaacil galUggtgg aaag 34 <210〉 13 <211〉 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反向片段下游引物 <400> 13 cccaagctlc iggiugaig attccactga ctt 33 <2I0> 14 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220〉
[0013] <223> 35S上游引物 <400> 14 gaaggglctl gcgaaggala 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220 <223> 35S下游引物 <400> 15 Ugiaaaacg acggccaglg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213>人丄序列 <220> <223> NptI丨上游引物 <400> 16 alaccglaaa gcacgaggaa g 21 <210〉 17 <21 卜 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> Nptll下游引物 <400> 17 clgaagcggg aagggacl 18
【權利要求】
1. 煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtroR6,其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示或 SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列經取代、缺失或添加至少一個氨基酸，且來源于煙草的具有獨 腳金內酯轉運蛋白功能的氨基酸序列。
2. 編碼權利要求1所述煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6的基因，其特征在于：核苷酸 序列如SEQ ID NO. 3所示或SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列經取代、缺失或添加至少一個核 苷酸，且來源于煙草的具有獨腳金內酯轉運蛋白功能的核苷酸序列。
3. 干擾權利要求1所述煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6表達的轉基因干擾表達載體。
4. 根據權利要求3所述的干擾表達載體，其特征在于：所述干擾表達載體為含有干擾 SEQ ID NO. 3所示序列表達的發夾結構經Not I酶切位點連入pART27植物表達載體而得。
5. 根據權利要求4所述的干擾表達載體，其特征在于：所述發夾結構含有如SEQ ID NO. 9所示的正向序列和反向序列。
6. 權利要求3-5任一項所述干擾表達載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：以 SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11所示序列為引物，煙草的根組織cDNA為模板進行PCR擴增 獲得正向序列，將正向序列通過Xhol和ΚρηΙ酶切位點連入pHANNIBAL載體，獲得含有正向 序列的pHANNIBAL載體；然后以SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示序列為引物，煙草的根 組織cDNA為模板進行PCR擴增獲得反向序列，將獲得的反向序列通過Xbal和Hindlll連 入含有正向序列的pHANNIBAL載體，獲得含有正向序列和反向序列的pHANNIBAL載體，再利 用Not I酶切位點從含有正向序列和反向序列的pHANNIBAL載體切下發夾結構序列并連入 經Not I酶切、去磷酸化的pART27植物表達載體中，即得干擾表達載體。
7. 權利要求1所述煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6在抑制煙草側枝、腋芽或側芽增長 中的應用。
8. 權利要求2所述編碼煙草獨腳金內酯轉運蛋白NtH)R6的基因在抑制煙草側枝、腋芽 或側芽增長中的應用。
9. 權利要求3-5任一項所述干擾表達載體在促進煙草側枝、腋芽或側芽增長中的應 用。
【文檔編號】C12N15/84GK104086637SQ201410316861
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月4日 優先權日:2014年7月4日
【發明者】王根洪, 夏慶友, 謝小東, 高軍平, 熊海軍 申請人:西南大學