抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體及其制備。本發明提供了一株保藏號為CCTCC?NO:C201475的雜交瘤細胞株CR-M01，以該雜交瘤細胞株可以分泌特異性識別豬紅細胞CR1-like的抗豬紅細胞CR1-like單克隆抗體。本發明的單克隆抗體能夠特異性識別豬紅細胞上的CR1-like蛋白，并能夠特異性阻斷豬紅細胞對致敏乳膠顆粒的免疫粘附，在豬紅細胞CR1-like的功能研究中具有很高的應用價值。
【專利說明】抗豬紅細胞CR1-1 ike單克隆抗體及其制備
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種單克隆抗體，具體涉及一種抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體，以及該單克隆抗體的制備，本發明還涉及分泌該抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
【背景技術】
[0002]自美國學者Siegel等在1981年提出“紅細胞免疫系統(Red cell immunesystem, RCIS) ”概念以來,人們逐漸認識到紅細胞不僅具有在血液中攜帶氧氣的呼吸功能和調節血液PH值的緩沖功能，還具有免疫功能，并包含完整的自我調控系統。目前，人類醫學領域中有關紅細胞免疫的研究已經非常深入，紅細胞在體內廣泛參與特異性與非特異性免疫、機體免疫調控，并影響多種疾病的發生、發展，而CRl是人紅細胞免疫功能最重要的物質基礎。
[0003]人CRl是一種存在于紅細胞、淋巴細胞、白細胞表面的相對分子質量205kDa的單鏈糖蛋白，其在每個紅細胞上的數量為950，以散在和集簇狀態分布在細胞膜上。人紅細胞上有50%的CRl呈集簇分布，而其他細胞上CRl的集簇分布率卻小于15%，紅細胞CRl的這種集簇分布方式可使它與C3b包被的免疫復合物的結合位點呈多價性，且連接更為牢固。由于血液循環中絕大多數的CRl存在于紅細胞膜上，紅細胞清除血液循環免疫復合物的幾率比白細胞大500-1000倍，因此，以CRl基礎的紅細胞免疫黏附是人紅細胞最重要的免疫功能。當人紅細胞對免疫復合物的結合受到限制時，免疫復合物就會沉積在敏感組織中，導致許多疾病的發生。
[0004]目前的研究證實，多種哺乳動物、嚙齒類動物、禽類紅細胞具有免疫粘附功能，但并未證實CRl是動物紅細胞唯一的免疫粘附受體，也未見有特異性阻斷這種免疫粘附的研究報告，更未從動物紅細胞膜上獲得過粘附受體并證明其蛋白質特性。豬作為我國飼養量最大的家畜和人類醫學和生物醫學工程領域最常用的模型動物，對豬紅細胞CRl-1ike功能的研究，將有可能提高和改善豬養殖和疾病治療的現狀，并為其他動物紅細胞免疫粘附的研究提供借鑒，也將為人類開展以CRl為靶點的疾病治療和藥物研發提供研究基礎。
[0005]由于對豬紅細胞CRl-1ike研究缺乏有效的試驗工具，特別是抗豬紅細胞CRl-1ike的特異性抗體，使得豬紅細胞CRl-1ike研究進展較為緩慢。因此，提供一種抗豬紅細胞CRl-1ike的單克隆抗體，對進一步研究豬紅細胞CRl-1ike具有重要意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種分泌特異性識別豬紅細胞CRl-1ike的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以及上述雜交瘤細胞株分泌的抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體。
[0007]本發明提供了一株抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體的雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株命名為CR-MOl，于2014年6月6日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢市武昌珞珈武漢大學，郵編430072。保藏號為CCTCC N0:C201475。
[0008]本發明所述的雜交瘤細胞株是通過雜交瘤技術，以合成的多肽作為免疫原建立的。
[0009]本發明還提供了由所述雜交瘤細胞株CR-MOl分泌的抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體，所述單克隆抗體的亞型為IgGl。
[0010]所述單克隆抗體純化后,經western blot和免疫突光染色,證明其能夠特異性識別豬紅細胞CRl-1ike蛋白。
[0011]進而，本發明所述抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體能夠特異性的阻斷豬紅細胞的免疫粘附作用。
[0012]本發明提供的抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體的制備方法包括如下步驟:
I抗原制備
對GenBank登錄的豬紅細胞CRl-1ike基因進行分析，選取CDS區翻譯出相應的蛋白質序列，分析蛋白質序列二級結構，獲得以下抗原位點pep =NSFffSIPEGNCKRKT0將抗原位點合成多肽，多肽分別偶聯KLH和BSA，其中KLH-pep用于小鼠免疫，BSA-pep用于ELISA后期篩選。
[0013]2動物免疫
以KLH-p印免疫Balb/c小鼠，ELISA檢測血清效價大于10000的小鼠，融合前3天用免疫原50 μ g/只量腹腔注射待融合小鼠進行加強免疫。
[0014]3雜交瘤細胞制備
制備免疫脾細胞，與培養的骨髓瘤細胞進行沖擊融合，采用HAT選擇性培養基篩選出雜交瘤細胞，ELISA篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，克隆擴增凍存，同時對雜交瘤細胞上清中的單克隆抗體進行亞型鑒定。
[0015]4單克隆抗體制備
取Balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石臘1_2周后腹腔內接種雜交瘤細胞，小鼠腹部膨大后用注射器抽取腹水，用Protein-A親和純化，檢測純化抗體純度、濃度及親和力。用Western Blot和免疫熒光染色證明所制備單克隆抗體的特異性。
[0016]本發明所制備的雜交瘤細胞株CR-MOl及其分泌的單克隆抗體能夠特異性的識別豬紅細胞上的CRl-1ike蛋白，所獲得單克隆抗體能夠特異性的阻斷豬紅細胞對致敏乳膠顆粒的免疫粘附，在豬紅細胞CRl-1ike的功能研究中具有很高的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體的SDS-PAGE。
[0018]圖2是Western Blot分析抗豬紅細胞CRl-like單克隆抗體與抗原的特異性結合圖。
[0019]圖3是免疫熒光染色分析抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體與抗原的特異性結合(顯微鏡放大倍數1000倍)。其中A為陰性對照，B為加單克隆抗體。
[0020]圖4是抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體阻斷豬紅細胞的免疫粘附作用(顯微鏡放大倍數1000倍)，其中A加PBS，B加同型抗體，C加單克隆抗體。
【具體實施方式】
[0021]實施例1、雜交瘤細胞株CR-MOl的獲得 I抗原的制備
對GenBank登錄的豬紅細胞CRl-1ike基因(Gene ID: 1640741)進行分析，選取CDS區，利用 Translate (http://web.expasy.0rg/translate/)翻譯出相應的蛋白序列，Gene1us軟件分析蛋白質的二級結構、親疏水性、抗原性、跨膜區等，選擇蛋白質二級結構彈性大、親水性強、抗原性強、非跨膜區的位置；同時在NCBI上進行與同物種的同源性分析，避開同源性的區域，最終獲得以下抗原位點P印=NSFffSIPEGNCKRKT0
[0022]采用美國ABI公司的多肽自動合成儀，以獲得的抗原位點序列采用固相合成法合成多肽，合成程序按照ABI操作指南及Fmoc化學合成步驟。經過縮合一洗滌一去保護一中和洗滌一下一輪縮合等操作，直到完成所要求的序列，使用Kaiser方法對成肽過程中縮合反應程度進行定性監測。利用HPLC對合成的多肽進行純化，LCMS檢測多肽純度，-80°C保存。
[0023]將合成的多肽分別與KLH和BSA用sulfo_GMBS法偶聯。稱量多肽，用0.05M PBS溶解，終濃度為6mg/ml，根據需求分裝好多肽。將KLH和BSA以sulfo-GMBS溶解活化，將活化好的“載體蛋白-sulfo-GMBS”溶液滴加到上述多肽溶液中，以垂直混勻器在室溫下旋轉混勻3h (或4°C旋轉過夜)。用DTNB分析液檢測偶聯前后自由巰基光吸收值的變化，偶聯前OD413 —偶聯后OD413 > 2.0，說明偶聯成功，否則失敗。根據活化后載體蛋白的濃量來確定偶聯后“載體蛋白-多肽”的濃度。KLH-p印用于小鼠免疫，BSA-pep用于ELISA后期篩選。
[0024]2動物免疫
將KLH-p印按60 μ g/只小鼠的量，分別皮下初次免疫4只SPF Balb/c雌性小鼠，免疫間隔14d，初免后，加強4次，加強免疫每次劑量30 μ g/只，第4次加強后，眼眶采血分離血清，采用間接ELISA法測定免疫血清效價。
[0025]取20 μ g BSA-pep 1/2/3多肽溶解于1ml 0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ I/孔，4°C過夜。用含有0.05% Tween-20 PBS洗板3次，用1%BSA封閉液37°C封閉2h，使用0.05% Tween-20 PBS洗板3次，將小鼠免疫血清從200倍開始2倍梯度稀釋，取100μ I加入96孔板，37°C孵育lh，0.05% Tween-20 PBS洗板3次后，加入100 μ I
I: 1000倍稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG，37°C孵育lh，0.05% Tween-20 PBS洗板3次后，加入100 μ I TMB顯色，室溫避光15min，加50 μ I IM HCl終止反應，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值的比> 2.1為陽性來判斷免疫血清效價。
[0026]取血清效價大于10000的小鼠，融合前3天，用免疫原50 μ g/只腹腔注射待融合小鼠進行加強免疫。
[0027]3細胞融合
將狀態良好的SP2/0細胞輕柔的從培養瓶壁上吹打下來，吸入到50ml離心管中；小鼠摘眼球取血，拉頸處死，放入75%酒精中浸泡5min ;在平皿中倒入少量無血清MDM，將細胞篩及注射器內芯放入平皿中，用剪刀和鑷子取下小鼠脾臟放到細胞篩上，用注射器內芯輕輕充分碾碎，碾好的細胞吸入到裝有SP2/0的離心管中，1500rad/min離心5min。用剪刀和鑷子取下小鼠胸腺，碾碎，碾好的胸腺細胞加入到15ml離心管中，再加入1ml HAT,放在孵箱中備用。將離心好的細胞倒掉上清，用無血清MDM將細胞小心輕柔地吹勻，離心(1500rad/min, 5min),棄上清，拍打離心管底充分懸浮細胞，將離心管放入37°C溫水中，在Imin內緩慢加入1ml PEG，加完后，溫水中靜置lmin。然后在2min內緩慢加入2ml的無血清IMDM,接著在2min內緩慢加入8ml的無血清IMDM。1000rad/min離心5min,棄上清,加入1ml血清，小心將細胞吹勻，倒入前面準備好的胸腺細胞，再加入25ml滅菌半固體培養基(含HAT)，充分混勻。均勻倒入30個細胞培養皿中，將細胞培養皿放入濕盒中于孵育箱中培養。
[0028]4篩選單克隆細胞
間接ELISA法篩選細胞培養上清，選擇效價較高的陽性克隆雜交瘤細胞進行亞克隆化，并用有限稀釋法連續克隆化2~3次，直至100%細胞陽性率，最后獲得穩定分泌抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體的雜交瘤細胞株I株，命名為CR-M01。
[0029]將克隆化后陽性率達100%的細胞擴增培養后液氮凍存。采用ELISA鑒定陽性雜交瘤細胞株所分泌單克隆抗體的亞型，單克隆抗體的亞型為IgGl。
[0030]實施例2、單克隆抗體的制備 I抗體的制備
取Balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷預處理I~2周，之后每只小鼠腹腔接種16個雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產生和分泌單克隆抗體，約I~2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。
[0031]2抗體的純化
用 Protein A/G 親和柱(Pierce Protein A/G Magnetic Beads,貨號:thermo 88802)純化抗體。純化步驟按照實際說明書進行如下操作:用偶聯緩沖液以1: 3稀釋腹水，配平，1000rpm 4°C離心20min，0.22Mm濾膜過濾，除去脂肪、細胞殘渣及小顆粒物質。用5~10倍柱體積的偶聯緩沖液平衡預裝親和柱，保持流速為4滴/S。用注射器將樣品注入柱子上端接口，收集流出液于50ml離心管中，保持流速為5s/滴。用5倍柱體積的偶聯緩沖液過柱，保持流速為4滴/S。在對應所需中和液附近取幾個值，加入EP管；滴加洗脫液到1.0ml，混勻后檢測PH值。根據結果調整中和液的量，使中和結果pH為7.0。取5個EP管，根據中和液調試結果，按量分別加入中和液維持抗體生物活性，避免抗體失活。用5倍柱體積洗脫緩沖液洗脫抗體，收集于上述EP管中。用5倍柱體積pH2.7洗脫緩沖液過柱，保持流速為4滴/S。用5~10柱體積G柱偶聯緩沖液平衡柱子至pH7.0，保持流速為4滴/s。
[0032]實施例3、單克隆抗體的特性鑒定 I抗體的純度測定
以SDS-PAGE測定單克隆抗體的純度，純度達到90%以上，如圖1所示。
[0033]2抗體的濃度測定
采用Beyotime公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定單克隆抗體的濃度,亞型IgGl的抗體濃度為3.12mg/mL.
[0034]3抗體的效價測定
經ELISA測定，亞型IgGl的抗體效價為108。
[0035]4 抗體的 Western Blot 鑒定
提取豬紅細胞的膜蛋白，經12% SDS-PAGE電泳后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，加入I: 1000稀釋單克隆抗體，4°C孵育過夜，0.1% Tween-20的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)洗膜3次，每次1minJaAl: 10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育 Ih,0.1% Tween-20 的 Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7.4)洗膜 3 次，每次 1min, ECL發光試劑盒顯色后曝光。雜交瘤細胞制備的抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體出現單一的特異性條帶，結果如圖2所示。
[0036]5抗體的免疫熒光鑒定
采集豬新鮮血，加入等體積的PBS，然后將血液加入等體積的淋巴細胞分離液上層，1500rpm離心15min。用吸管吸取管底紅細胞，加入3~4ml用細胞洗液(PBS，pH7.4，含2%胎牛血清)中，1500rpm離心5min，再用細胞洗液洗滌2次。將細胞100倍稀釋后計數板計數，同時觀察細胞形態。將紅細胞稀釋至I X 16個/ml，加入制備的抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體(I: 100稀釋)，37°C孵育lh，以PBS (ρΗ7.4)為陰性對照。PBS (ρΗ7.4)洗滌細胞后，加入FITC標記羊抗鼠二抗(I: 1000)，37°C孵育lh，PBS (ρΗ7.4)洗滌細胞后，熒光顯微鏡下觀察，經抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體染色的細胞觀察到綠色熒光，如圖3所示。結果證明雜交瘤細胞制備的抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體可識別天然豬紅細胞CRl-1ike 蛋白。
[0037]實施例4、單克隆抗體阻斷豬紅細胞對乳膠顆粒的免疫粘附 I材料及試劑
乳膠顆粒(Invitrogen), BSA-Alexa Fluor? 488 (Invitrogen)JP^Kbuffer (0.1MMES)，激活 buffer (10mg/ml EDAC)，含 2%BSA 的偶聯 buffer，2.5mM EDTA 溶液，30mM CaCl210mM MgCl2 溶液。
[0038]2 步驟
取乳膠顆粒(Beads)原液10 μ I,用偶聯buffer重懸為1ml。將重懸的Beads與5 μ IBSA-Alexa Fluor? 488 混勻，立即調 pH 為 6.5。取 ρΗ6.5 的激活 buffer 50 μ 1，與上述懸液混勻，室溫條件下，暗室反應15min, 1000rpm離心5min,棄上清。用含2% BSA的偶聯buffer洗漆乳膠顆粒2次,PBS重懸beads。在懸液中加入適量人血清(含Ca、Mg離子),使血清終濃度為20%，對照血清加入足量的EDTA，同時置于37°C水浴中，致敏反應lOmin，反應結束后加入足量的EDTA終止補體反應，1000rpm離心5min，棄上清。用含2%BSA的偶聯buffer洗滌乳膠顆粒2次，PBS重懸beads。將豬紅細胞與抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體在37°C中預孵育15min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS洗滌兩次并重懸。將上述重懸的紅細胞與致敏beads暗室反應15min，以加PBS和加同型抗體分別作為對照，1200rpm離心5min，棄上清，PBS洗滌三次，重懸后熒光顯微鏡觀察。
[0039]結果如圖4所示，抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體能夠特異性的阻斷豬紅細胞對致敏乳膠顆粒的免疫粘附作用。
【權利要求】
1.抗豬紅細胞CRl-1ike單克隆抗體雜交瘤細胞株CR-M01，保藏號CCTCCN0:C201475。
2.由保藏號CCTCCNO:C201475的雜交瘤細胞株CR-MOl分泌的單克隆抗體。
3.權利要求2所述單克隆抗體作為識別豬紅細胞CRl-1ike檢測試劑的應用。
4 .權利要求2所述單克隆抗體作為阻斷豬紅細胞CRl-1ike免疫粘附試劑的應用。
【文檔編號】C12N5/20GK104164407SQ201410308534
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月1日 優先權日:2014年7月1日
【發明者】李宏全, 姜俊兵, 馬海利, 孫耀貴, 崔嬌艷, 尹偉, 范闊海, 王治維, 孫娜, 趙昕 申請人:山西農業大學