一種卵黃抗體的制備方法
【專利摘要】本發明提供一種卵黃抗體的制備方法，其采用滅活的保藏編號為CGMCC?No.9181的大腸埃希氏菌HNJD2014免疫蛋雞，然后從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體。本發明采用滅活的大腸埃希氏菌HNJD2014，能夠持續性獲得高純度的抗原；獲得的卵黃抗體效價高，免疫效果好；能夠有效預防和治療仔豬腹瀉，增強機體的免疫功能，促進豬的生長發育。
【專利說明】一種卵黃抗體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于預防仔豬腹瀉的卵黃抗體制備【技術領域】，具體涉及一種預防仔豬腹瀉的卵黃抗體的制備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，仔豬腹瀉給規模化養豬場造成了巨大的經濟損失。流行病學調查結果表明，在2010年至2012年，流行性腹瀉病毒導致的腹瀉發生率為39%至47%。大腸桿菌、沙門氏菌、輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒等病原體也是導致仔豬腹瀉的重要病原體。抗生素的大量應用并沒有從根本上控制仔豬腹瀉的問題，大量使用還容易產生耐藥性和畜產品藥物殘留，有悖于養豬業的綠色可持續發展。尋求綠色環保的預防性的抗生素替代品成為目前畜牧業健康發展的首選方案。卵黃抗體在疾病的預防、治療和診斷上發揮著重要的作用。有研究表明，基于抗PRRSV-N蛋白的卵黃抗體可以診斷PRRS病原。卵黃抗體對產生相應抗原的病原體的生長具有顯著的抑制作用，多項研究已經證實卵黃抗體的體內和體外的抑菌特性，其對細菌性腹瀉和病毒性腹瀉具有良好的防治作用。總之，卵黃抗體在動物傳染性疾病的預防和治療過程中具有良好的應用前景，可以替代抗生素的使用，減少病原體的耐藥性，是一種新型的綠色環保型抗生素替代品。
[0003]卵黃抗體特點:1gY具有良好的穩定性，耐熱、耐酸、耐堿，抗離子強度，并具有一定抗酶解能力。研究表明，IgY能夠抵抗幼齡動物腸道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。家禽免疫系統的特性決定小劑量的抗原便可發揮作用，因此可以用少量抗原在較長時間獲得大量高滴度特異性抗體。一個母雞每年大約能產280枚雞蛋，每個卵黃里面含有100~150mg IgY，因此每只雞每年能夠產生40g特異性卵黃抗體，具有很大的生產潛力。因此，與其他哺乳動物制備多克隆抗體相比，特異性IgY抗體制備有著經濟、易操作、產量大等優點。但是現有的制備純化卵黃抗體的方法還有待進一步多元化以及提高效率。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種預防仔豬腹瀉的卵黃抗體的制備方法，該方法與現有技術相比操作簡單，成本低，制備效率高，抗體效價高。
[0005]本發明的目的是通過以下方式實現的:
[0006]一種卵黃抗體的制備方法，采用滅活的保藏編號為CGMCC N0.9181的大腸埃希氏菌HNJD2014免疫蛋雞，然后從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體。
[0007]采用TSB液體培養基培養大腸埃希氏菌HNJD2014。
[0008]大腸埃希氏菌HNJD2014采用0.25%~0.35%甲醛在37°C滅活24小時。優選大腸埃希氏菌HNJD2014采用0.3%甲醛在37°C滅活24小時。
[0009] 用甲醛滅活并進行濃縮，細菌含量為(1.5~3) X 19個/mL，佐劑為白油佐劑，白油佐劑包括94重量份白油、6重量份司本80、2?1:%硬脂酸招,水相與油相按體積比2:1混合，采用磁力攪拌器充分混勻。
[0010]選擇100羽180~220日齡蛋雞，胸肌分點免疫，0.8~1.0mL/羽，首次免疫后每隔15d進行加強免疫，首次免疫45~50d后，抽檢蛋樣滴度，當凝集效價大于1:512后作為高免雞蛋收集，其后每隔30~40d再加強免疫一次，即可得到凝集價為1:512的持續高效價IgY的雞蛋。
[0011]從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體時，獲得的蛋黃充分攪勻，按照體積比1:1加入蒸餾水稀釋，充分攪勻；量取蒸餾水，按2.85%~3.15%質量比添加泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分攪勻，使包含蛋黃液的終體系中泊洛沙姆的含量為0.95~1.05wt% ;靜置使脂質充分沉淀。
[0012]優選雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體時，獲得的蛋黃充分攪勻，按照體積比1:1加入蒸餾水稀釋，充分攪勻；量取蒸餾水，按3%質量比添加泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分攪勻，使包含蛋黃液的終體系中泊洛沙姆的含量為lwt% ；靜置使脂質充分沉淀。
[0013]蛋黃脂質沉淀過后,將上清液過濾；添加8wt%~ 12wt%麥芽糊精、3wt%~ 5wt%β -環糊精、2wt%~4wt%微晶纖維素3種輔料，充分攪勻；然后噴霧干燥，噴霧干燥條件:進風溫度170~190°C，蠕動泵18~20轉每分鐘，風速頻率為55~60Hz。
[0014]一種用于制備卵黃抗體抗原的大腸桿菌，所述的大腸桿菌是大腸埃希氏菌HNJD2014，保藏編號為 CGMCC N0.9181。
[0015]該菌株從患病仔豬體內分離篩選得到，經16S rRNA基因鑒定為Escherichia coli屬，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)HNJD2014 ；
[0016]保藏日期:2014年5月20日；
[0017]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；
[0018]保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號；
[0019]保藏號:CGMCCN0.9181。
[0020]本發明帶來的有益效果
[0021]1、大腸桿菌菌種保藏編號為CGMCC N0.9181由本發明人分離保藏，經PCR鑒定，該菌種可表達ST、LT及志賀毒素，能夠很方便地直接獲得這三種毒素引起的仔豬腹瀉的抗體，使得產生的抗體具有更好的保護力，能夠持續性獲得高純度的抗原；
[0022]2、利用滅活的大腸桿菌菌種CGMCC N0.9181免疫蛋雞，可以高效率地獲得卵黃抗體；
[0023]3、獲得的卵黃抗體效價高，免疫效果好；能夠有效預防和治療仔豬腹瀉，增強機體的免疫功能，促進豬的生長發育；
[0024]4、采用噴霧干燥技術簡化卵黃抗體純化生產工藝，使卵黃抗體在豬場大規模應用成為可能；
[0025]5、在生產過程中避免使用有機溶劑等有害物質，減少污染，保護環境；
[0026]6、操作條件容易掌握，生產效率高，生產成本可大幅降低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為大腸埃希氏菌HNJD2014菌落圖；
[0028] 圖2為大腸埃希氏菌HNJD2014毒素PCR鑒定結果；
[0029]圖2中M表示DNA分子Marker2000，ST表示耐熱腸毒素，分子大小240bp ；LT表示不耐熱腸毒素，分子大小300bp ；eVT表不志賀毒素,分子大小469bp。
【具體實施方式】
[0030]以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0031]實施例1
[0032]1、大腸桿菌IgY制備具體方案
[0033]大腸桿菌菌種CGMCC N0.9181由本實驗室分離保藏，采用TSB平板培養，生成圓形突起、光滑、濕潤、半透明的乳白色菌落，如圖1所示。本菌在普通培養基上生長良好，最適生長溫度為37°C，最適生長pH為7.2~7.4。經PCR鑒定，該菌種可表達ST (耐熱腸毒素)、LT(不耐熱腸毒素)及志賀毒素，如圖2所示。采用TSB液體培養基大量培養大腸桿菌，用
0.25~0.35%甲醛滅活并進行濃縮，優選甲醛濃度為0.3%，細菌含量為(1.5~3) X 19/mL，佐劑為白油佐劑(94份白油、6份司本80、2%硬脂酸鋁)，水相與油相按2:1體積混合，用磁力攪拌器在室溫下充分混勻，轉速為1200轉/分鐘。選擇100羽180~220日齡蛋雞，胸肌分點免疫，0.8~1.0mL/羽。首次免疫后每隔15d進行加強免疫，首次免疫45~50d后，抽檢蛋樣滴度，當凝集效價大于1:512后作為高免雞蛋收集，其后每隔30~40d再加強免疫一次，即可得到持續高價IgY的雞蛋(凝集價為1:512)。
[0034]2、雞蛋消毒及蛋黃分離
[0035]采用千分之一濃度的聚維酮碘浸泡雞蛋消毒，清除蛋殼上的污點，打蛋分離蛋黃和蛋清。
[0036]3、蛋黃脂質沉淀
[0037]獲得的蛋黃充分攪勻，按照體積比1:1加入蒸餾水稀釋，充分攪勻；量取蒸餾水，按2.85~3.15wt %的量添加泊洛沙姆，優選3wt %的泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分攪勻；使蛋黃液終體系中泊洛沙姆的含量為0.95~1.05wt%,優選lwt%的泊洛沙姆；靜置使脂質充分沉淀。
[0038]蛋黃中脂質含量達到36%，在噴霧干燥過程中容易導致旋風分離器發生粘壁。降低蛋黃中脂肪含量是解決粘壁問題的關鍵。泊洛沙姆能夠沉淀蛋黃中的脂肪，脫脂后的蛋黃液噴霧干燥過程粘壁現象明顯降低。泊洛沙姆是一類由聚氧乙烯(PEO)、聚氧丙烯(PPO)組成的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0型非離子三嵌段共聚物。它具有表面活性，良好的安全性。
[0039]4、卵黃抗體噴霧干燥
[0040]蛋黃脂質沉淀過后,將上清液過濾。添加8wt%~ 12wt%麥芽糊精、3wt%~ 5wt%β -環糊精、2wt%~ 4wt%微晶纖維素3種輔料，充分攪勻。采用BIL0N-6000Y噴霧干燥機噴霧干燥。噴霧干燥條件:進風溫度170~190°C，蠕動泵18~20轉每分鐘，風速頻率為55~60Hz。將收集的噴霧干燥卵黃抗體粉裝入封口袋，密封保存。
[0041]5、大腸桿菌IgY滴度評估(微量凝集實驗)
[0042]將過夜培養的大腸桿菌液進行10倍濃縮，過夜培養菌含量為1.5 X 19個/mL。采用PEG6000沉淀法提取蛋黃中的IgY，具體過程為:蛋黃液與PBS按1:2混合，加入3.5%PEG6000, 1000rpm 離心 15min，收集上清并過濾，加入 8.5% PEG6000, 1000rpm, 15min，棄上清，用PBS懸浮沉淀，加入12% PEG6000再次沉淀，即可獲得較純的IgY。
[0043]按棋盤法對抗原抗體進行稀釋，抗原作1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8，抗體作1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024，各加 50 μ 1，37。。作用 I ~4h，每隔30min進行觀察,觀察沉淀的效果,結果顯示抗原在1:4~1:6,抗體在1:128~1:512,結果最為明顯。
[0044]實施例2本發明制備的卵黃抗體預防腹瀉效果
[0045]株洲某豬場，該場2013年10月份爆發腹瀉，仔豬出生后3~4天腹瀉嚴重，黃色水樣糞便，小豬死亡很多。經實驗室診斷為大腸桿菌導致的腹瀉。
[0046]隨機選擇30頭待產母豬，試驗組和對照組各15頭，按照欄位間隔排列。試驗組(A)母豬所產仔豬采用本發明制備的卵黃抗體灌服:卵黃抗體粉采用生理鹽水稀釋，I克卵黃抗體粉加生理鹽水2mL，出生后I小時內灌服3mL ;對照組(B)母豬所產仔豬不做任何處理。飼養管理條件一致。觀察并記錄仔豬腹瀉情況。試驗結果如下所示。
[0047]數字1、2、3分別表示不同程度的腹瀉:1表示輕微腹瀉，糞便變軟；2表示中度腹瀉，糞便水樣；3表示嚴重腹瀉，糞水分離狀態。表格中數字表示每天觀察到的腹瀉次數，根據漏糞板上糞便狀況而定。最終結果由腹瀉指數評定，數值越大，腹瀉越嚴重。腹瀉指數=糞便評分之和/供試驗仔豬總頭數。
[0048]表1卵黃抗體預防仔豬腹瀉效果
[0049]
【權利要求】
1.一種卵黃抗體的制備方法,其特征在于,米用滅活的保藏編號為CGMCC N0.9181的大腸埃希氏菌HNJD2014免疫蛋雞，然后從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體。
2.根據權利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，采用TSB液體培養基培養大腸埃希氏菌HNJD2014。
3.根據權利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，大腸埃希氏菌HNJD2014采用0.25%~0.35%甲醛在37°C滅活24小時。
4.根據權利要求3所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，大腸埃希氏菌HNJD2014采用0.3%甲醛在37°C滅活24小時。
5.根據權利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，用甲醛滅活并進行濃縮，細菌含量為(1.5~3) X 19個/mL，佐劑為白油佐劑，白油佐劑包括94重量份白油、6重量份司本80、2wt%硬脂酸鋁，水相與油相按體積比2:1混合，采用磁力攪拌器充分混勻。
6.根據權利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，選擇100羽180~220日齡蛋雞，胸肌分點免疫，0.8~1.0mL/羽，首次免疫后每隔15d進行加強免疫，首次免疫45~50d后，抽檢蛋樣滴度，當凝集效價大于1:512后作為高免雞蛋收集，其后每隔30~40d再加強免疫一次，即可得到凝集價為1:512的持續高效價IgY的雞蛋。
7.根據權利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體時，獲得的蛋黃充分攪勻，按照體積比1:1加入蒸餾水稀釋，充分攪勻；量取蒸餾水，按2.85%~3.15%質量比添加泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分攪勻，使包含蛋黃液的終體系中泊洛沙姆的含量為0.95~1.05wt% ;靜置使脂質充分沉淀。
8.根據權利要求7所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體時，獲得的蛋黃充分攪勻，按照體積比1:1加入蒸餾水稀釋，充分攪勻；量取蒸餾水，按3%質量比添加泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分攪勻，使包含蛋黃液的終體系中泊洛沙姆的含量為;靜置使脂質充分沉淀。
9.根據權利要求7或8所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，蛋黃脂質沉淀過后，將上清液過濾；添加8wt%~12wt%麥芽糊精、3wt%~5wt% β -環糊精、2wt%~4wt%微晶纖維素3種輔料，充分攪勻；然后噴霧干燥，噴霧干燥條件:進風溫度170~190°C，蠕動泵18~20轉每分鐘，風速頻率為55~60Hz。
10.一種用于制備卵黃抗體抗原的大腸桿菌，其特征在于，所述的大腸桿菌是大腸埃希氏菌 HNJD2014，保藏編號為 CGMCC N0.9181。
【文檔編號】C12N1/20GK104072609SQ201410304764
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】汪鎮南, 劉云福, 肖淑華, 顏愛, 李代林 申請人:湖南九鼎科技（集團）有限公司獸藥分公司