一株產阿魏酸酯酶的棒曲霉及其應用的制作方法

一株產阿魏酸酯酶的棒曲霉及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一株產阿魏酸酯酶的棒曲霉及其應用，所述棒曲霉的分類命名為棒曲霉（Aspergillusclavatus）煙青，由中國典型培養物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCCNO：M2013641，保藏日期為2013年12月8日，棒曲霉應用于產阿魏酸酯酶。本發明菌株以麥麩為發酵基質來發酵生產阿魏酸酯酶，并用阿魏酸酯酶斷裂植物細胞壁多糖及木質素和阿魏酸之間的酯鍵，獲得束縛型酚酸阿魏酸的方法，并且利用微生物生長周期短，不受氣候限制，易于實現大規模生產，為阿魏酸等束縛型酚酸類物質提取提供了新的生物方法。
【專利說明】一株產阿魏酸酯酶的棒曲霉及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一株產阿魏酸酯酶的棒曲霉及其應用。

【背景技術】
[0002] 小麥是世界上種植面積最為廣泛的作物之一，約占糧食作物種植面積的26%，我國 小麥年產量高，小麥麩皮的年產量可達2000萬噸以上，但是一直以來對于麩皮的開發利用 較少，基本上僅以作為飼料原料而加以利用。小麥麩皮中主要含有非淀粉多糖、淀粉、脂肪、 木質素、蛋白質、維生素和酚類物質等多種成分，其中以阿拉伯木聚糖為主的非淀粉多糖含 46%，是小麥細胞壁的主要成分。麩皮中還含有一定數量的酚酸類物質，如阿魏酸（ferulic acid)、P_香豆酸（p-coumaricacid)、咖啡酸（caffeicacid)、芥子酸（sinapicacid)和丁香 酸（syringicacid)等成分，其中以阿魏酸為主要成分，約為麩皮質量的0. 4%?0. 7%。阿魏 酸主要通過酯鍵與細胞壁多糖和木質素項鏈，一般可以使用強堿將酯鍵斷開而釋放出來。
[0003] 酚酸組要存在于麥麩皮層中，其具有較強的抗氧化活性和抗腫瘤作用，并對環境 中的有毒物質如多環芳烴和亞硝酸胺以及真菌毒素有抗誘變作用。有研究報道發現，在麥 麩膳食纖維的離體發酵試驗中，結腸微生物能通過發酵作用將結合在麥麩膳食纖維上的阿 魏酸釋放出來。而阿魏酸可顯著降低人子宮頸癌細胞的生存能力、存活和抗氧化水平，同時 提高癌細胞保內的活性氧水平并增加癌細胞的脂質過氧化及DNA損傷作用。另有報道認 為阿魏酸可通過對血管內皮生長因子（VEGF)、血小板源生長因子（PDGF)和缺氧誘導因子 (HIF)的作用來調節血管的形成。
[0004] 目前，研究表明酚類物質主要以游離型、結合型和束縛型等幾種形式存在于植物 機體內，一般來說，游離性和結合型酚類物質為可溶性酚類；束縛型則為不溶性酚類物質， 以酯鍵、糖苷鍵和醚苷鍵形式與其他物質(包括蛋白質、糖類、有機酸等）相結合。
[0005] 對于酚類物質的提取，一般采用有機溶劑為媒介，輔以超聲、微波、亞臨界等方法 進行。由于束縛型酚類物質一般與其他物質以不同的鍵型相連結，傳統的提取方法不足以 將酯鍵、糖苷鍵或醚鍵斷裂，因此對束縛型酚類物質的提取主要采用強酸強堿或生物方法 (酶法和發酵法)，其主要目的都是破壞細胞壁纖維成分致密的結構，以使束縛行酚類物質 釋放出來。
[0006] 盡管化學方法操作簡單、效率高，但是后續需要處理提取廢液，不利于可持續性發 展。因此相比較而言，采用生物方法更符合綠色、環保的發展要求。對于麥麩進行發酵方面 的多集中在低聚木糖生產和產酶活性等領域，另外已有大量文獻報道麥麩經發酵后等到膳 食纖維功能性質比發酵前有大幅改善，如持水性、持油性和對有害物質的結合能力等。
[0007] 阿魏酸作為麥麩中的主要酚酸，目前對其獲得的方式主要為酶法，以發酵方式的 報道較少，特別需要指出的是，麥麩中的阿魏酸基本適宜束縛型的形態存在的，其游離型： 結合型：束縛型的比例為〇. 1:1:100。近年來，對酚類物質存在形式的研究逐漸成為新的研 究熱點。目前已對一些游離型、酯化型、糖苷型、束縛型酚類物質的提取、測定及抗氧化活性 等方面的報道。酚類物質的存在形與其含量及抗氧化活性有重要關系，束縛型酚類物質不 僅含量遠遠高于游離型和結合型，且抗氧化性活性和抑制DNA損傷方面要高于其他兩種類 型。
[0008] 本發明旨在利用微生物資源采用發酵工程技術將農業資源轉化形成人類社會需 求的物質，解決抗氧化物質資源短缺的問題。


【發明內容】

[0009] 本發明所要解決的技術問題是：針對現有抗氧化供應的提供新的原料和方法，并 對小麥等大宗植物進行再利用，提供一株產阿魏酸酯酶的棒曲霉及其應用，其可利用小麥 麩皮發酵生產阿魏酸，由于微生物生長周期短、不受氣候限制，易于實現大規模生產，從而 解決阿魏酸不足等問題。
[0010] 本發明提供的一株產阿魏酸酯酶的棒曲霉，來源于華南植物園土壤，經過篩選，分 離純化得到的。該棒曲霉其分類命名為棒曲霉(As/76?r^77A/5· c/araiiAS)煙青，由中國典型 培養物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCC NO :M2013641，其ITS序列表如序列表 1所示，保藏日期為2013年12月8日，保藏地址為中國武漢武漢大學，中國典型培養物保 藏中心。
[0011] 本發明所得棒曲霉c/araim)煙青的平板觀察特征和顯微鏡特征 如下：棒曲霉（Aspergillus clavatus)煙青在察氏培養基上菌落生長速度較慢，培養7d直 徑30mm;質地絲絨狀至粉粒狀，菌絲體白色，分生孢子結構呈暗藍綠色，無滲出液。在麥芽 汁瓊脂上菌落生長速度較快，培養7d直徑45mm，平坦，質地粉粒狀，分生孢子結構多，灰綠 色，菌落反面紅褐色。在査氏酵母膏瓊脂上菌落培養7d直徑40mm，質地絲絨狀，瓶稍厚； 分生孢子結構多，呈灰藍色，邊緣較稀，呈白色，無滲出液。顯微鏡下可以觀察到分生孢子頭 幼時為棒形，分生孢子梗發生于基質，孢梗莖長短不一；頂囊由孢梗頂端逐漸膨大成為棍棒 形，直徑50?60mm，產孢子結構單層，瓶梗密集這生于頂囊的全部表面，瓶梗大小為8? 12 μ mX 2?3 μ m;分生孢子為橢圓形，分生孢子大小為4?5 μ mX 3 μ m,壁光滑。
[0012] 所述棒曲霉 dpergiBiAs c/aFaiiAs)煙青的 ITS 與棒曲霉 dpergiBws c/araiiAs)同源性達 100%。
[0013] 一種產阿魏酸酯酶的棒曲霉的制備方法，本發明的棒曲霉來源于華南植物園土 壤，采用不同的培養基進行篩選，篩選到多個菌株，逐一進行阿魏酸含量及牛津杯透明圈測 定實驗，得到高產阿魏酸酯酶的棒曲霉煙青，包括如下步驟：稱 取土壤樣品l〇g放入裝有9(Tl00 mL無菌的含玻璃珠的生理鹽水的300mL三角瓶中搖蕩 18~20min，作10倍遞增系列稀釋樣品勻液1:10、1:100、1:1000、及1:10000，取稀釋樣品 勻液1:100、1:1000、及1:10000各1. OmL分別加入到無菌平皿；再加10?15mL PDA培養基 混合均勻，靜置廣2 min，于28°C ±1°C倒置培養70?72h，將PDA培養基上單個的菌落轉 接到斜面PDA培養基上28°C ±1°C培養70?72h，再轉入初篩培養基，于28°C ±1°C培養 58?60h，用牛津杯透明圈實驗，篩選得到產阿魏酸酯酶的棒曲霉（Aspergillus clavatus) 煙青；所述土壤樣品從華南植物園采集。
[0014] 上述方法中，將從初篩培養基上獲得產阿魏酸酯酶的棒曲霉接種到三角瓶種子培 養基中，于28°c ±1°C培養58~ 60h，即為棒曲霉種子；再將棒曲霉種子接種到發酵培養基 中培養，為產阿魏酸的棒曲霉的提取物。
[0015] 初篩培養基：FeS04 · 7H20 0· Olg，NaN03 2· 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 · 7H20 0· 5 g， K2HP041.0g，鹿糖30 g，瓊脂20 g，蒸饋水1000m L，pH值自然；121°C滅菌20 min。滅菌后 培養基冷到60°C左右添加無菌的10%阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液100mL，搖勻至均勻 的乳白色倒平板。
[0016] 種子培養基：FeS04 ·7Η20 0· Olg，NaN03 2. 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 ·7Η20 0· 5 g， K2HP041.0g，麩皮 1000 g，蒸餾水 1000m L，pH 值自然。121°C滅菌 20 min。
[0017] PDA培養基：PDA (馬鈴薯瓊脂）40g，定容至lL，pH自然。121°C保溫滅菌20min。
[0018] 發酵培養基：麥麩：水為重量比1:1，pH值自然。
[0019] 本發明的另一個目的是提供所述棒曲霉煙青的生產阿魏酸的發酵應用。所述棒曲 霉煙青應用于產阿魏酸酯酶。
[0020] 上述應用，包括如下步驟：利用麥麩直接接種棒曲霉（Aspergillus clavatus)煙 青，于發酵培養基中進行曲盤發酵，獲得發酵提取物，利用高效液相色譜測量發酵培養基中 麥麩的阿魏酸釋放量。
[0021] 上述應用中，所述發酵的條件為：用麥麩在曲盤上進行固體發酵，麥麩厚度控制 在2~3cm內，棒曲霉種子接種量為0. 5% (含菌量為1?2 X 109個/g)，培養溫度為25? 28°C，進行通風培養，發酵時間為48?55h; pH自然。所述麥麩為天然麥麩。所述棒曲霉 種子由棒曲霉接種到三角瓶種子培養基中，于28°C ±1°C培養58?72h得到。
[0022] 與現有技術相比，本發明的有益效果是： 本發明提供了一種新的棒曲霉煙青，所述菌株具有產阿魏 酸酯酶的能力，極大的補充了提取束縛型阿魏酸菌的資料庫；所述棒曲霉(ergi/Λ/5· 煙青已經從生物界中分離純化出來，并且易于培養保存，繁殖迅速，生長能力強。
[0023] 本發明棒曲霉發酵產阿魏酸酯酶的酶活很高，可以作為從植物中提取束縛型酚酸 的生物菌。
[0024] 本發明提供了棒曲霉c/araim)煙青在植物中束縛型阿魏酸生物 法的應用，為束縛型酚酸的釋放及后續抗氧化工程，提供了新的生物方法以及強有力的技 術支持。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是本發明菌株與其他菌株發酵液的阿魏酸酯酶活力的透明圈圖。
[0026] 圖2是棒曲霉煙青在顯微鏡下400倍觀察的足細胞形態圖。
[0027] 圖3是棒曲霉煙青在顯微鏡下400倍觀察的分生孢子頭形態圖。
[0028] 圖4是棒曲霉煙青在PDA培養上的菌落圖。
[0029] 圖5為HPLC測定的阿魏酸標準品的色譜圖。
[0030] 圖6為HPLC測定的阿魏酸標準品的標準曲線。
[0031] 圖7為棒曲霉發酵色譜圖。

【具體實施方式】
[0032] 下面結合實施例對本發明作進一步地說明。
[0033] 以下實施例中用到的培養基配方： 初篩培養基：FeS04 · 7H20 0· Olg，NaN03 2· 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 · 7H20 0· 5 g， K2HP041.0g，鹿糖30 g，瓊脂20 g，蒸饋水1000m L，pH值自然；121°C滅菌20 min。滅菌后 培養基冷到60°C左右添加無菌的10%阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液100mL，搖勻至均勻 的乳白色倒平板。
[0034] 種子培養基：FeS04 · 7H20 0· Olg，NaN03 2. 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 · 7H20 0· 5 g， 1(2冊041.(^，麩皮 1000 8，蒸餾水 10001111^，？!1值自然。1211：保溫滅菌201^11。
[0035] PDA培養基：PDA (馬鈴薯瓊脂）40g，定容至lL，pH自然。121°C保溫滅菌20min。
[0036] 發酵培養基：麥麩：水重量比為1:1，pH自然。121°C保溫滅菌20min。
[0037] 實施例1 棒曲霉菌的初篩，牛津杯透明圈篩菌實驗篩選高產菌株。
[0038] 從華南植物園采集土壤樣品，稱取樣品10g放入裝有90mL無菌的含玻璃珠的生理 鹽水的300mL三角瓶中搖蕩20 min，作10倍遞增系列稀釋樣品勻液1:10、1:100、1:1000、 及1:10000，取稀釋樣品勻液1:100、1:1000、及1:10000各1. OmL分別加入無菌平皿；再加 15mL PDA培養基混合均勻，靜置lmin，于28°C倒置培養72h，將培養基上單個的菌落轉接到 斜面PDA培養基上28°C培養72h，再轉入含阿魏酸乙酯的初篩培養基28°C培養60h，篩選產 阿魏酸酯的菌株，備用； 用平皿牛津杯透明圈實驗做再次篩菌，將分離獲得的產阿魏酸酯的菌株采用液體發酵 方法在發酵培養基中28°C培養2天，獲得發酵液，將發酵液6000r/min離心后取200uL上清 液，放到初篩培養基上牛津杯中，置于37°C培養箱中培養5-27h觀察透明圈，發酵液的上清 液消解底物而產生透明圈，即可說明產阿魏酸酯酶活性的高低，以此方法在已經產阿魏酸 酯酶的菌株中對比篩選透明圈，透明圈大的即為高產阿魏酸酯酶的菌株。見附圖1所示，其 中a菌種即為本發明所得棒曲霉（Aspergillus clavatus)煙青，其透明圈相比于其他菌株 大。
[0039] 實施例2 菌株的微生物學特性及鑒定 棒曲霉在察氏培養基上菌落生長速度較慢，培養7d直徑30mm ;質地絲絨狀至粉粒狀， 菌絲體白色，分生孢子結構呈暗藍綠色，無滲出液。在麥芽汁瓊脂上菌落生長速度較快，培 養7d直徑45_，平坦，質地粉粒狀，分生孢子結構多，灰綠色，菌落反面紅褐色。在査氏酵母 膏瓊脂上菌落培養7d直徑40mm，質地絲絨狀，瓶稍厚；分生孢子結構多，呈灰藍色，邊緣較 稀，呈白色，無滲出液。
[0040] 顯微鏡下可以觀察到分生孢子頭幼時為棒形，分生孢子梗發生于基質，孢梗莖長 短不一；頂囊由孢梗頂端逐漸膨大成為棍棒形，直徑50?60_，產孢子結構單層，瓶梗密 集這生于頂囊的全部表面，瓶梗大小8?12μηιΧ2?3μηι;分生孢子為橢圓形，孢子大小 4?5μπιΧ3μπι，壁光滑(見附圖2-4所示)。
[0041] 所述棒曲霉 dpergiBiAs c/aFaiiAs)煙青的 ITS 與棒曲霉 dpergiBiAs c/araiiAs)同源性達 100%。
[0042] 實施例3 固態發酵測定束縛型阿魏酸釋放量 按種子培養基配方，稱10g麩皮加水10g混合入500mL三角瓶，種子培養基滅菌后接種 棒曲霉0^/76?τ^·/77?5· c/araim)煙青斜面菌株，接種量為0. 5%，28°C培養3d后，得到棒曲 霉種子； 按發酵培養基配方，稱200g麩皮加水200g混合后滅菌，置瓷盤冷卻，麥麩厚度控制在 2. 5cm內，棒曲霉種子接種量為0.5% (含菌量為1?2X109個/g)，培養溫度為28°C，進 行通風培養，發酵時間為48h。將固態發酵麩皮，按15g加90mL水比例在40°C水浴鍋中浸 提60min后，于4°C，12 000 r / min離心20 min，取上清液酶液置于冰箱中保存。
[0043] 取上清液3mL入10mL離心管加3mL甲醇混合，10000 r / min離心取上清液用 0. 45 μ m膜過濾入進樣瓶冰箱保存，作為液相測定用。樣品做空白對照即麩皮培養基不發 酵的按此方法處理即得。HPLC采用Venusil XBP C18(L)(4.6mmX250mm，5ym)，保護柱 為C18(4.6X7. 5 mm，5 μ m)條件為：10 μ L進樣量，流動相為1%冰乙酸：乙腈（4:1 )，波長 320nm,柱溫20°C，流速為0. 9mL ?π?ΓΓ1。取1. Omg阿魏酸標準品，經甲醇定容至lOmL，分別 配制成濃度為40、60、80、100、120、140μ g/mL的溶液，經上述色譜條件進行測定(見圖5為 某濃度阿魏酸標準品色譜圖)，并將阿魏酸濃度為橫坐標（X)，峰面積為縱坐標（Y)，最后得 回歸方程為：Y= 311134x + 202717, R2=0. 9969 (見圖6為阿魏酸標準品的標準曲線），再 根據樣品測定的阿魏酸的Y值(見圖7)，將Y值代入回歸方程Y=311134x + 202717,得到X 值，即為樣品阿魏酸濃度。利用液相色譜測定的束縛型阿魏酸釋放量達到〇. 3-0. 5%，而相關 文獻中束縛型阿魏酸的含量為〇. 3%-0. 7%。證明通過發酵后束縛型阿魏酸得到了極大的釋 放。該菌株為高產阿魏酸酯酶及相關酶系并能通過發酵的方法從植物中得到束縛型阿魏酸 的菌株。 序列表1 SEQUENCE LISTING 〈110>華南理工大學 〈120> -株產阿魏酸酯酶的棒曲霉及其應用 <130> <160> 1 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 594 <212> DNA 〈213> 棒曲霉（Aspergillus clavatus)煙青 <400> 1 tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taccgagtgc gggccctctg ggtccaacct 60 cccacccgtg tttatcgtac cttgttgctt cggcgggccc gccgtcttcg gacggccgcc 120 ggggaggcct ccgcgccccc gggcccgcgc ccgccgaaga ccacaacatg aactctgttc 180 tgaagttttg cagtctgagt tgattatcat aatcagttaa aactttcaac aacggatctc 240 ttggttccgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata actaatgtga attgcagaat 300 tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcaca ttgcgccccc tggtattccg gggggcatgc 360 ctgtccgagc gtcattgctg ccctcaagca cggcttgtgt gttgggcccc cgtccccggt 420 ttcccgggga cgggcccgaa aggcagcggc ggcaccgcgt ccggtcctcg agcgtatggg 480 gctttgtcac ccgctcttgt agggccggcc ggcgcctgtc gacaccaacc caatttttct 540 aaggttgacc tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt aagcatatca ataa 594
【權利要求】
1. 一株產阿魏酸酯酶的棒曲霉，其特征在于，所述棒曲霉的分類命名為棒曲霉 (Aspergi/AAS· c/araim)煙青，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO: M2013641，保藏日期為2013年12月8日，其ITS序列表如序列表1所示。
2. 權利要求1所述棒曲霉應用于產阿魏酸酯酶中。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，包括如下步驟：利用麥麩直接接種棒曲霉 (Aspergillus clavatus)煙青，于發酵培養基中進行曲盤發酵，獲得發酵提取物，利用高效 液相色譜測量發酵培養基中麥麩的阿魏酸釋放量。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述曲盤發酵的條件為：用麥麩在曲盤 上進行固體發酵，麥麩厚度控制在2~3cm內，棒曲霉種子接種量為0.5%即含菌量為1? 2X 109個/g，培養溫度為25?28°C，進行通風培養，發酵時間為48?55h ;pH自然。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述棒曲霉種子由棒曲霉接種到三角瓶 種子培養基中，于28°C ±1°C培養58?60h得到。
【文檔編號】C12R1/66GK104087514SQ201410299853
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】吳暉, 胡博涵, 賴富饒, 劉素純, 曾嵐 申請人:華南理工大學