Cyp119-t213g酶及其純化方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及CYP119-T213G酶及其純化方法。本發明要解決的技術問題是提供一種催化效率更高的CYP119酶。本發明的技術方案是一種CYP119-T213G酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本發明還提供了表達CYP119-T213G酶的載體。本發明還提供了CYP119-T213G酶的純化方法。本發明提供了一種催化效率更高的CYP119酶，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】CYP119-T213G酶及其純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及CYP119-T213G酶及其純化方法。
【背景技術】
[0002] CYP119酶（cytochrome P450 119)來自黃石公園火山口分離的嗜酸嗜熱硫礦硫葉 菌（Sulfolobus solfataricus)，因此該酶具耐酸抗高溫等作用。CYP119酶能催化月桂酸和 苯乙烯等底物發生環氧化反應，該反應綠色環保具有較高應用前景。目前文獻報道CYP119 酶在過氧化氫或假單孢氧還蛋白-還原酶（Pd/PdR)和輔酶NADPH條件下能催化月桂酸羥 基化和苯乙烯環氧化的反應。在常溫下CYP119酶催化苯乙烯環氧化反應的過氧化氫酶途 徑中，催化常數為Kcat = 0· Smirf1 (Laura S. Koo et al. 2000)。R和S構型的環氧苯乙燒 之比約為1:3。后來Rabe KS等，考察了 CYP119酶催化苯乙烯環氧化反應的最佳溫度和pH 值，結果表明，溫度為70°C，叔丁基過氧化氫（TBHP)為輔助氧化劑，pH8. 5的甘氨酸緩沖液 為野生型CYP119酶催化苯乙烯環氧化反應的最佳反應條件。通過動力學研究得到了其kMt =78. 2±20. θπ?ιΓ1，Km = 9. 2±4. 3Mm，比常溫下提高了 100多倍，但是隨著溫度的升高，其 對應選擇性降低。為改善酶的催化效率，Laura S.Koo (2000)小組將野生型酶進行突變，發 現突變體T214V能明顯改善與苯乙烯的結合能力，過氧化氫途徑下的苯乙烯環氧化反應速 率比野生型提高了近3倍，對應選擇性未發生改變。該小組發現213位是該酶的活性中心， 而214位在電子傳遞中起到關鍵作用（Laura S. K et al. 2002)。在213位進行了 A、V、S、F、 W幾種氨基酸的突變，僅T213A的催化效率接近野生型酶，其它幾種突變體催化效率明顯降 低。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決的技術問題是提供一種催化效率更高的CYP119酶。
[0004] 本發明的技術方案是一種CYP119-T213G酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0005] 進一步的，編碼CYP119-T213G酶的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0006] 本發明還提供了表達CYP119-T213G酶的載體。
[0007] 進一步的，所述的載體為質粒。
[0008] 本發明還提供了包含所述載體的宿主。
[0009] 進一步的，所述的宿主為大腸桿菌。
[0010] 本發明還提供了 CYP119-T213G酶的純化方法，包括如下步驟：
[0011] a、取發酵后的菌液離心收集菌體，PBS懸浮菌體，破碎細胞，離心，收集上清液，獲 得粗酶液；
[0012] b、0. 22 μ m過濾膜過濾粗酶液，利用Ni-NTA柱進行純化，收集洗脫液；
[0013] c、對洗脫液用超濾膜濃縮，再用50mM pH7. 4的PBS置換洗脫液3次，濃縮至酶液呈 現鮮紅色或紅黑色，得到純品。
[0014] 具體的，步驟b中的洗脫條件為：平衡液I洗脫5個柱體積；將0. 22 μ m過濾膜過 濾后的粗酶液上柱；平衡液I洗5個柱體積；平衡液II洗5個柱體積；洗脫液I洗6個柱 體積；洗脫液II洗5個柱體積，收集洗脫液；平衡液I為50mM PBS，pH7. 4, 5mM咪唑；平衡 液 II 為 50mM PBS，0· 5M NaCl，ρΗ7· 4, 5mM 咪唑；洗脫液 I 為 50mM PBS，ρΗ7· 4, 20mM 咪唑；洗 脫液 Π 為 50mM PBS，ρΗ7· 4,80mM 咪唑。
[0015] 本發明提供了一種催化效率更高的CYP119酶，是在213位將蘇氨酸突變為甘氨酸 得到的突變體。在常溫下，CYP119-T213G酶催化苯乙烯環氧化反應的催化能力提高了近80 倍，且對應選擇性也比野生型酶高，R/S= 1:5,具有出人意料的技術效果。以上結果說明突 變后的CYP119-T213G酶能提高酶對苯乙烯的環氧化反應，且具有較高的對應選擇性，具有 廣泛的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1CYP119-T213G催化苯乙烯環氧化反應米氏方程
【具體實施方式】
[0017] 實施例1CYP119-T213G酶表達載體構建
[0018] CYP119酶的突變：根據pET30a-CYP119-T213G載體設計突變位點的引物序列為： SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4。利用 QuickChange Lighting Site-directed Mutagenesis Kit 定點突變試劑盒進行定點突變，轉化大腸桿菌DH5 α。挑選陽性克隆測序，確認是否完成突 變及突變后位點的準確性。
[0019] SEQ ID No. 3 :擴增 CYP119-T213G 酶的上游引物
[0020] 5' -TTCTCATAGCGGGTAATGAG GGT ACAACTAACTTAATATCAAA-3'，加粗下劃位點為突 變位點。
[0021] SEQ ID No. 4 :擴增 CYP119-T213G 酶的下游引物
[0022] 5' -TTTGATATTAAGTTAGTTGT ACC CTCATTACCCGCTATGAGAA-3'，加粗下劃位點為突 變位點。
[0023] 實施例2CYP119-T213G酶的大量表達
[0024] 將pET30a-CYP119-T213G質粒轉化BL21 (DE3)plysS大腸桿菌感受態細胞。挑選 陽性單菌落，接種于5mL雙抗LB液體培養基中，37°C震蕩培養過夜。取2mL過夜培養的菌 液于1L雙抗的TB培養基培養基。加入250μ l/LTraceElement，37°C，震蕩培養至0D0.6。 加入0. 4mM IPTG至終濃度0. 4mM，32°C，誘導45h。
[0025] 實施例3CYP119-T213G酶的純化
[0026] 取實施例2發酵好的菌液，12000rpm，4°C離心lOmin，棄上清，加入20mLpH7.4， 50mMPBS溶液充分懸浮菌體。將樣品置于冰水上，超聲破胞儀，50%功率，3s-3s，20min分兩 次破完。破胞后在55°C水浴中加熱15min，12000rpm，4°C，離心40min，取上清液即為粗酶 液。
[0027] 然后將粗酶液進行純化，平衡液I洗脫5個柱體積；將0. 22 μ m過濾膜過濾后的粗 酶液上柱；平衡液I洗5個柱體積；平衡液II洗5個柱體積；洗脫液I洗6個柱體積；洗脫 液Π 洗5個柱體積，收集洗脫液。
[0028] 將收集的洗脫液II用超濾膜（Amicon? Ultra-1510K)濃縮至800μ L左右，再用 50mMPBS，pH7. 4置換緩沖液3次，濃縮至600 μ L左右，酶液呈現鮮紅色或紅黑色。將濃縮 酶稀釋201倍后，紫外分光光度計測得A415 = 0. 4183,據此算出酶量為20. 85mg/L。-80°C 保存。
[0029] 經過此純化后，蛋白的純度可達90%以上，能滿足后續工作的要求。
[0030] 純化所需試劑配方：
[0031] 平衡液 I :50mM PBS，ρΗ7· 4, 5mM 咪唑
[0032] 平衡液 II :50mMPBS，0. 5MNaCl，ρΗ7· 4,5mM 咪唑
[0033] 洗脫液 I :50mM PBS，ρΗ7· 4, 20mM 咪唑
[0034] 洗脫液 II :50mMPBS，ρΗ7· 4,80mM 咪唑。
[0035] 實施例4CYP119-T213G酶的性質研究
[0036] 1、米氏方程
[0037] 利用CYP119-T213G酶催化苯乙烯環氧化反應，根據米氏方程得到此突變酶的Km， vmax和KMt等酶動力學常數。
[0038] 叔丁基過氧化氫（TBHP)為輔助氧化劑，苯乙烯溶解在乙腈中，反應溫度為35°C。 反應緩沖體系為50mM bis-Tris buffer, pH7. 4。總體系80 μ L。反應完成后用720 μ L乙 腈淬滅反應后，于HPLC檢測產物。液相色譜檢測條件：戴安（Di〇neXU-3000)，C18柱，30% (1(140,70 1%乙腈作為流動相，檢測波長220nm,流速：lmL/min。苯乙烯保留時間4. 9min，環 氧苯乙燒2. 5min。
[0039] 反應體系見表1。每個濃度梯度重復三次反應，求得產物（環氧苯乙烷）的平均 值。根據環氧苯乙烷生成速率的倒數和苯乙烯濃度的倒數作圖，獲得米氏方程，見圖1。
[0040] 表1反應體系
[0041]
【權利要求】
1. 一種CYP119-T213G酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. 如權利要求1所述的CYP119-T213G酶，其特征在于：編碼CYP119-T213G酶的核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。
3. 表達CYP119-T213G酶的載體。
4. 如權利要求3所述的載體，其特征在于：所述的載體為質粒。
5. 包含權利要求3或4所述載體的宿主。
6. 如權利要求5所述的宿主，其特征在于：所述的宿主為大腸桿菌。 7. CYP119-T213G酶的純化方法，其特征在于：包括如下步驟： a、 取發酵后的菌液離心收集菌體，PBS懸浮菌體，破碎細胞，離心，收集上清液，獲得粗 酶液； b、 0. 22 μ m過濾膜過濾粗酶液，利用Ni-NTA柱進行純化，收集洗脫液； c、 對洗脫液用超濾膜濃縮，再用50mM pH7. 4的PBS置換洗脫液3次，濃縮至酶液呈現鮮 紅色或紅黑色，得到純品。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟b中的洗脫條件為：平衡液I洗脫5個 柱體積；將0. 22 μ m過濾膜過濾后的粗酶液上柱；平衡液I洗5個柱體積；平衡液II洗5 個柱體積；洗脫液I洗6個柱體積；洗脫液II洗5個柱體積，收集洗脫液；平衡液I為50mM PBS，pH7. 4,5mM 咪唑；平衡液 II 為 50mMPBS，0. 5MNaCl，pH7. 4,5mM 咪唑；洗脫液 I 為 50mM PBS，ρΗ7· 4, 20mM 咪唑；洗脫液 II 為 50mM PBS，ρΗ7· 4,80mM 咪唑。
【文檔編號】C12N15/70GK104059893SQ201410299535
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】張春, 王欽, 李靜, 郭建敏, 杜曦, 何芳 申請人:瀘州醫學院