基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統及應用的制作方法

基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統及應用，由核酸酶TALEN和pMD18載體組成，核酸酶TALEN為剪切目的基因靶序列的轉錄激活子樣效應因子，TALEN由識別所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和識別所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R組成；pMD18載體為插入人類AR定點突變基因的PMD18同源重組模板質粒，pMD18載體由靶基因的相應上下游序列和嘌呤霉素篩選標記組成。本發明使細胞基因組在TALEN切斷雙鏈DNA分子時，利用pMD18載體提供的同源序列，高效精確地對基因組進行編輯；采用導入同源序列以重新編輯DNA序列的同時，帶入嘌呤霉素抗性基因，從而大大簡化篩選過程中的人工勞動。
【專利說明】基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統及應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及基于TALEN和pMD18載體的人類AR基因定 點突變系統及其基因組水平定點突變系統的應用。

【背景技術】
[0002] 基因組靶向修飾是近年來生命科學研究的熱點之一，特別是在基因治療人類疾病 方面，基因組靶向修飾具有廣闊的應用前景。通過轉基因或者基因敲除等操作改變基因的 遺傳組成，獲得滿足各種需要的基因工程工具。傳統較常用的轉基因方法為質粒穩定轉染 法、反轉錄病毒攜帶法和同源重組法。但質粒轉染穩定篩選的插入位點隨機，且需要抗生素 維持，容易導致非正常的細胞表型；而反轉錄病毒攜帶目的基因的效率雖高，但是插入位點 不確定，影響其它內源基因的表達，限制了該方法的應用；另外，同源重組法雖然可以定點 插入，但是成功率很低(重組概率為1〇_ 6-1〇_7)。
[0003] 目前，基因組工程學中的三大利器為：ZFN (Zinc Finger Nucleases)、TALEN (Transcription Activator-like Effector Nuclease)和 CRISPR/Cas9〇
[0004] ZFN是指鋅指蛋白，是轉錄因子，每個模塊識別3-4個堿基序列，將這些模塊混合 搭配，可以靶定任何序列，然后，通過C末端的Fok I核酸內切酶結構域可以切斷雙鏈DNA分 子。Sangamo生物科學公司和Sigma- Aldrich公司已經將ZFN技術商業化，推出CompoZr? ZFN平臺。但是，由于鋅指蛋白之間存在相互作用，鋅指模塊與DNA序列之間沒有一個簡單 的對應關系，所以以鋅指蛋白為基礎設計針對序列特異性DNA結合蛋白依然是個難題，并 且花費昂貴，經常要做大規模的篩選，構建過程長達幾周至數月。
[0005] CRISPR/Cas9系統是由短的向導RNA介導，Cas9核酸酶在特定的雙鏈DNA位點上 產生斷裂。CRISPR/Cas可通過添加多個向導RNA而實現多重編輯。然而，由于向導RNA序 列比ZFN或TALEN所祀定的序列短，致使脫祀效應高。但Church最近發現，通過利用Cas9 的一種突變形式(只切割單鏈DNA)和兩個緊挨著的向導RNA，有可能大大提高系統的切割 位點保真性，降低脫靶效應。
[0006] TALEN技術是一種嶄新的分子生物學工具。TALEN是轉錄激活樣效應因子，來源 于黃單胞桿菌。利用TALEN蛋白的核酸結合結構域的氨基酸序列與核酸序列有恒定的對 應關系，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，再通過添加非特異內切酶Fok I 結構域，TALEN蛋白在理論上可以靶向切割任意基因組DNA雙鏈。TALEN蛋白中DNA結 合域為高度保守的重復單元，每個重復單元含有34個氨基酸，除了第12和13位氨基酸 變化外，其它氨基酸都是相同的，這兩個可變氨基酸被稱為重復序列可變的雙氨基酸殘基 (repeatvariable di-residues，RVD)，與堿基識別相關。TALEN識別DNA的機制在于每個 重復序列的RVD可以特異識別DNA的1個堿基，HD特異識別C堿基，NI識別A堿基，NN識 另Ij G堿基，NG識別T堿基。另外，通過對天然TALEN的研究發現，TALEN蛋白框架固定識別 1個T堿基，所以TALEN的識別序列總是以T堿基開始。
[0007] 在真核細胞內，TALEN切割的雙鏈DNA，可以激活兩條保守的DNA修復通路。非同源 末端連接修復（non-homologous end joining, NHEJ)，細胞基本上磨平斷裂DNA的兩端，再 將其彼此拉近，將斷裂的染色體重新連接，這個過程往往產生移碼，或者在斷裂位點引進小 片段插入或刪除，影響基因功能或產生基因敲除效應。同源指導修復（homology-directed repair，HDR)是指利用相似序列的DNA供體模板，代替斷裂點周圍的DNA序列，從而實現特 定突變或導入外源DNA序列的目的。在本發明專利中，采用攜帶同源模板的pMD18載體共 同轉染細胞系的方法，使細胞基因組在TALEN切斷雙鏈DNA分子時，利用pMD18載體提供的 同源序列，高效精確地對基因組進行編輯。
[0008] TALEN技術可以廣泛的應用于基因組編輯的各個方面：細胞水平的基因敲除，定 點突變，結構域缺失，定點整合等等，在疾病治療領域具有廣泛的應用前景。目前TALEN技 術主要的缺陷是效率相對較低，一般在5%-20%，無法直接獲取100%編輯的細胞，只能通過 挑選陽性的單克隆細胞，擴增成為穩定株。在本發明專利中，采用導入同源序列以重新編輯 DNA序列的同時，帶入嘌呤霉素抗性基因，從而大大簡化篩選過程中的人工勞動。


【發明內容】

[0009] 基于此，本發明的目的是提供一種基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統及應 用，采用攜帶同源模板的PMD18載體共同轉染細胞系的方法，使細胞基因組在TALEN切斷雙 鏈DNA分子時，利用pMD18載體提供的同源序列，高效精確地對基因組進行編輯；采用導入 同源序列以重新編輯DNA序列的同時，帶入嘌呤霉素抗性基因，從而大大簡化篩選過程中 的人工勞動。
[0010] 為達到上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的： 一種基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統，由核酸酶TALEN和pMD18載體組成，所 述核酸酶TALEN為剪切目的基因靶序列的轉錄激活子樣效應因子，TALEN由識別所述靶序 列5'端的核酸酶TALEN-L和識別所述靶序列3'端的核酸酶TALEN-R組成；所述pMD18載 體為插入人類AR定點突變基因的pMD18同源重組模板質粒，pMD18載體由靶基因的相應上 下游序列和嘌呤霉素篩選標記組成。
[0011] 所述定點突變系統的定點突變方法為：切割目標基因組所形成的DNA斷裂位點通 過同源重組修復，將一對TALEN質粒和攜帶同源重組基因的質粒共同轉染受體細胞，TALEN 質粒表達的蛋白會在受體細胞基因組TALEN靶點的位置上切開一個口；外源基因會在切口 處同源重組入受體基因組；所述的目標基因為人類雄激素受體AR基因。
[0012] 一種基于TALEN和PMD18載體的定點突變系統的應用，包括細胞株的構建和定點 突變系統在人類基因組中改造人類雄激素受體AR基因的應用，所述細胞株的構建方法如 下：對轉染后的受體細胞進行稀釋培養，藥物篩選，獲得細胞克隆，鑒定外源基因在受體細 胞基因組上整合的情況，挑選出符合整合位置要求的陽性細胞克隆； 所述定點突變系統在人類基因組中改造人類雄激素受體AR基因的應用為采用權利要 求2所述的定點突變系統為將相應質粒轉入人類正常前列腺細胞系中，準確識別人類AR基 因的特定序列，并在基因組中實現定點突變，獲得的穩定細胞株可以穩定傳代。
[0013] 所述構建的細胞株為細胞株RWPE-AR-K0,所述細胞株為人正常前列腺離體細胞系 RWPE-I改造的細胞株，不表達AR蛋白。
[0014] 所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R ;所述pMD18載體包括 PMD18載體的第2外顯子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18載體的第2外顯子下游的同 源右臂序列核苷酸。
[0015] 所述構建的細胞株為細胞株RWPE-E872Q，所述細胞株RWPE-E872Q為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第872位氨基酸殘基由谷氨酸突變為谷氨酰 胺的AR蛋白。
[0016] 所述構建的細胞株為細胞株RWPE-H874Y，所述細胞株RWPE-H874Y為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第874位氨基酸殘基由組氨酸突變為酪氨酸 的AR蛋白。
[0017] 所述構建的細胞株為細胞株RWPE-T877A，所述細胞株RWPE-T877A為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第877位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為丙氨酸 的AR蛋白。
[0018] 所述構建的細胞株為細胞株RWPE-T877S，所述細胞株RWPE-T877S為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第877位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為絲氨酸 的AR蛋白。
[0019] 所述構建的細胞株為細胞株RWPE-M886I，所述細胞株RWPE-M886I為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第886位氨基酸殘基由蛋氨酸突變為異亮氨 酸的AR蛋白。
[0020] 所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R ;所述pMD18載 體包括PMD18載體的攜帶點突變位點的同源左臂序列核苷酸和pMD18載體的第8外顯子下 游的同源右臂序列核苷酸。
[0021] 所述人細胞株轉染的pMD18載體含有抗嘌呤霉素的基因，能將嘌呤霉素抗性基因 帶入基因組，從而表達抗嘌呤霉素的蛋白。
[0022] 本發明的有益效果如下： 本發明基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統及應用，由剪切目的基因靶序列的轉 錄激活子樣效應因子核酸酶TALEN和插入人類AR定點突變基因的pMD18同源重組模板質 粒組成，并將該相應質粒轉染入人類正常前列腺細胞系中，獲得穩定細胞株，表達點突變的 AR。該系統能夠準確識別人類AR基因的特定序列，并在基因組中實現定點突變，獲得的穩 定細胞株可以穩定傳代，遺傳背景清晰，準確表達定點突變的AR。
[0023] 本發明采用攜帶同源模板的pMD18載體共同轉染細胞系的方法，使細胞基因組在 TALEN切斷雙鏈DNA分子時，利用pMD18載體提供的同源序列，高效精確地對基因組進行編 輯；采用導入同源序列以重新編輯DNA序列的同時，帶入嘌呤霉素抗性基因，從而大大簡化 篩選過程中的人工勞動。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為人類雄激素受體AR蛋白的結構示意圖和mRNA的結構示意圖：其中，深色框 顯示AR蛋白的結構域，包括：轉錄激活區、DNA結合區、鉸鏈區和配體結合區，及各自對應的 外顯子；黑色框顯示Q重復區，為富含谷氨酰胺殘基的區域；箭頭標識突變位點； 圖2為人類雄激素受體AR基因的序列圖，AR基因由8個外顯子和7個內含子組成，下 劃線的序列為外顯子序列；框出的序列為TALEN的識別位點；箭頭指示出點突變的目標堿 基和本發明人工改造的替換堿基；其他序列已經省略； 圖3為pMD18載體骨架的示意圖； 圖4為TALEN識別序列的上游(左）同源臂序列； 圖5為TALEN識別序列的下游(右）同源臂序列； 圖6為TALEN MutlE872Q識別序列上游的同源臂序列，帶入突變體Mutl的突變位點 G/C ； 圖7為TALEN Mut2 H874Y識別序列上游的同源臂序列，帶入突變體Mut2的突變位點 C/T ； 圖8為TALEN Mut3 T877A識別序列上游的同源臂序列，帶入突變體Mut3的突變位點 A/G； 圖9為TALEN Mut4 T877S識別序列上游的同源臂序列，帶入突變體Mut4的突變位點 A/T ； 圖10為TALEN Mut5 M886I識別序列上游的同源臂序列，帶入突變體Mut5的突變位點 G/T ； 圖11為TALEN Mut識別序列下游的同源臂序列； 圖12為TALEN識別位點的上下游同源臂擴增電泳結果，TALEN Mut識別位點的上游5 種同源臂，分別帶入人類雄激素受體AR基因的5種定點突變，和TALEN Mut識別位點下游 的同源臂的擴增電泳圖，M為DL2000,自上而下的條帶大小分別為2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp 和 100bp。

【具體實施方式】
[0025] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不限于 此。
[0026] 本發明中基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統，由核酸酶TALEN和pMD18載 體組成，核酸酶TALEN為剪切目的基因靶序列的轉錄激活子樣效應因子，TALEN由識別所述 靶序列5'端的核酸酶TALEN-L和識別所述靶序列3'端的核酸酶TALEN-R組成；pMD18載 體為插入人類AR定點突變基因的pMD18同源重組模板質粒，pMD18載體由靶基因的相應上 下游序列和嘌呤霉素篩選標記組成。
[0027] 定點突變系統的定點突變方法為：切割目標基因組所形成的DNA斷裂位點通過同 源重組修復，將一對TALEN質粒和攜帶同源重組基因的質粒共同轉染受體細胞，TALEN質粒 表達的蛋白會在受體細胞基因組TALEN靶點的位置上切開一個口；外源基因會在切口處同 源重組入受體基因組；目標基因為人類雄激素受體AR基因，所述的DNA序列為核苷酸序列。
[0028] 本發明基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，包括細胞株的構建和定 點突變系統在人類基因組中改造人類雄激素受體AR基因的應用，所述細胞株的構建方法 如下：對轉染后的受體細胞進行稀釋培養，藥物篩選，獲得細胞克隆，鑒定外源基因在受體 細胞基因組上整合的情況，挑選出符合整合位置要求的陽性細胞克隆； 本發明定點突變系統在人類基因組中改造人類雄激素受體AR基因的應用為采用權利 要求2所述的定點突變系統為將相應質粒轉入人類正常前列腺細胞系中，準確識別人類AR 基因的特定序列，并在基因組中實現定點突變，獲得的穩定細胞株可以穩定傳代。
[0029] 本發明中構建的細胞株為細胞株RWPE-AR-K0,所述細胞株細胞株為人正常前列腺 離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，不表達AR蛋白。
[0030] 本發明中核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R，核酸酶TALEN-L 識別序列如SEQ ID NO. 1所示，核酸酶TALEN-R識別序列如SEQ ID NO. 2所示；pMD18載體 包括PMD18載體的第2外顯子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18載體的第2外顯子下游 的同源右臂序列核苷酸，PMD18載體的第2外顯子上游的同源左臂序列如圖4所示核苷酸， PMD18載體的第2外顯子下游的同源右臂序列如圖5所示核苷酸。
[0031] 本發明中構建的細胞株為細胞株RWPE-E872Q，細胞株RWPE-E872Q為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第872位氨基酸殘基由谷氨酸突變為谷氨酰 胺的AR蛋白。
[0032] 本發明中構建的細胞株為細胞株RWPE-H874Y，細胞株RWPE-H874Y為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第874位氨基酸殘基由組氨酸突變為酪氨酸 的AR蛋白。
[0033] 本發明中構建的細胞株為細胞株RWPE-T877A，細胞株RWPE-T877A為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第877位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為丙氨酸 的AR蛋白。
[0034] 本發明中構建的細胞株為細胞株RWPE-T877S，細胞株RWPE-T877S為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第877位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為絲氨酸 的AR蛋白。
[0035] 本發明中構建的細胞株為細胞株RWPE-M886I，細胞株RWPE-M886I為人正常前列 腺離體細胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第886位氨基酸殘基由蛋氨酸突變為異亮氨 酸的AR蛋白。
[0036] 本發明中核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R，核酸酶 TALEN Mut L識別序列如SEQ ID NO. 3所示，核酸酶TALEN Mut R識別序列如SEQ ID NO. 4 所示；PMD18載體包括pMD18載體的攜帶點突變位點的同源左臂序列核苷酸和pMD18載體 的第8外顯子下游的同源右臂序列核苷酸，pMD18載體的攜帶點突變位點的同源左臂序列 如圖6-11所示核苷酸，pMD18載體的第8外顯子下游的的同源右臂序列如圖12所示核苷 酸。
[0037] 本發明中人細胞株轉入的pMD18載體含有抗嘌呤霉素的基因，能將嘌呤霉素抗性 基因帶入基因組，從而表達抗嘌呤霉素的蛋白。
[0038] 本發明的第一方面，提供2對剪切目的基因靶序列的轉錄激活子樣效應因子核酸 酶TALEN質粒，分別在人類AR基因的2個位點切斷DNA雙鏈，造成定點插入外源同源重組 序列的位點。其中，TALEN-L的識別序列如SEQ ID NO. 1所示，TALEN-R的識別序列如SEQ ID NO. 2所示。TALEN Mut L的識別序列如SEQ ID NO. 3所示，TALEN Mut R的識別序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0039] 本發明的第二方面，提供5種定點改造人類AR基因的同源重組質粒，質粒的骨架 為PMD18載體，帶有嘌呤霉素抗性基因。定點改造的人類AR基因序列如圖6-11所示，擴增 同源序列的引物如SEQ ID NO. 9-19所示。
[0040] 進一步，提供AR敲除的同源臂擴增引物如SEQ ID N0.5-8所示。
[0041] 本發明的第三方面，提供一種構建穩定表達人類AR點突變體的細胞株的方法，該 細胞株的構建方法使用上述2對TALEN質粒中的一對，分別與5種同源重組模板pMD18質 粒組合。用脂質體包裹質粒混合物轉染人類正常前列腺細胞系RWPE-I，嘌呤霉素篩選出穩 定整合點突變AR基因的細胞株，并傳代、凍存、建系。
[0042] 本發明的第四方面，采用上述方法構建的5種細胞株：RWPE-E872Q，RWPE-H874Y， RWPE-T877A，RWPE-T877S和RWPE-M886I。遺傳背景清楚，可以穩定傳代，點突變AR表達穩 定，有嘌呤霉素抗性。
[0043] 具體操作過程按照下面步驟進行： (1) 根據需整合到受體細胞基因組上的位置而設計出識別特異序列的TALEN ; (2) 根據設計出的TALEN靶點序列構建TALEN質粒，同時，構建外源基因質粒； (3) 將TALEN質粒和外源基因共同轉染受體細胞，TALEN質粒表達的蛋白會在受體細 胞基因組TALEN靶點的位置上切開一個口；外源基因會在切口處整合進入受體基因組； (4) 對轉染后的受體細胞進行稀釋培養，嘌呤霉素篩選，獲得細胞克隆，鑒定外源基因 在受體細胞基因組上整合的情況，挑選出符合整合要求的陽性細胞克隆。
[0044] (5)所述的轉染后得到的細胞克隆采用核酸PCR技術或測序進行鑒定，對外源基 因在受體細胞基因組上整合的細胞克隆傳達、凍存、建系。
[0045] 本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法。通常按照常規條件，例如分子克隆 實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。涉 及的化學試劑盒、生物制品，如未特殊說明，表明它們均為商品化產品。
[0046] TALEN試劑盒購自上海斯丹賽生物技術有限公司。用于原代細胞/普通細胞/腫 瘤細胞基因打靶的專用TALEN載體包括10個，左右臂各5個，它們均含有CMV啟動子，NLS， N端，C端，Fok I，嘌呤霉素抗性基因(僅在左臂)等基本結構。載體間的不同之處在于TALEN 識別序列的最后一個堿基的不同，分為A/T/C/G四種，此外，包括一個帶有EGFP熒光標記的 TALEN右臂。左右臂骨架的Fok I序列不同，在TALEN作用時，Fok I酶會形成一個異源二 聚體的結構，大大增加TALEN切割的效率。
[0047] pMD18載體購自上海斯丹賽生物技術有限公司，經本發明發明人改建插入左右同 源重組臂。
[0048] 實施例中使用的細胞為人類正常前列腺細胞系RWPE-1，購自ATCC。
[0049] 實施例1 人類雄激素受體基因AR序列分析 從NCBI數據庫下載人類雄激素受體基因AR的序列（NG_009014. 2)。序列分析顯示該 基因包括8個外顯子，7個內含子，如圖2所示。按照基因敲除的一般原則，該基因的第二和 第三外顯子為理想的敲除靶標位點，本實施例以第二外顯子為敲除靶序列。
[0050] 序列的設計 根據人類雄激素受體基因AR的序列特征，我們選擇第二外顯子上的序列作為TALEN作 用的靶序列，人類雄激素受體基因AR第二外顯子核苷酸序列如圖2所示，根據TALEN原理 將結構為T (N11-18)的核苷酸序列SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2作為TALEN識別的靶位 點，其中N為A，G，T和C中的任一堿基。
[0051] 表達載體的構建 按照上海斯丹賽生物技術有限公司提供的試劑盒說明書構建核酸酶TALEN左右臂表 達載體。轉化大腸桿菌感受態細胞，擴增后送測序，選擇表達正確TALEN-L和TALEN-R的大 腸桿菌克隆進行大量擴增，提取質粒，用于后續試驗。
[0052] 同源重組模板質粒pMD 18的改建 按照人類雄激素受體AR基因的序列（如圖2所示)，在TALEN打靶位點的上下游 500-1000bp的距離內設計上下游同源臂的擴增引物，序列如SEQ ID NO. 5-8所示。
[0053] 高保真pfu酶擴增出的上游(左同源臂)片段(產物如圖4所示，PCR擴增后的電泳 結果如圖12所示)經BamH I和EcoR I雙酶切后，插入pMD18骨架載體中；下游(右同源臂） 片段(產物如圖5所示，PCR擴增后的電泳結果如圖12所示）經Hind III和Xba I雙酶切 后，插入PMD18骨架載體中。經連接、轉化、測序驗證得到正確插入上下游同源臂的pMD18 質粒。大量擴增后，提取質粒，用于后續試驗。
[0054] 建立敲除人類雄激素受體AR的前列腺細胞株RWPE-AR-KO 細胞的培養：人類正常前列腺細胞系RWPE-I購自ATCC，用含有10%胎牛血清的1640 培養基于37°C，5% C02孵箱中培養。將對數生長期的細胞用胰酶消化于轉染前一天鋪6孔 板，使其轉染時匯合率達到80%。
[0055] 質粒轉染：按照Fugene 6說明書進行操作。TALEN-L質粒和TALEN-R質粒每6孔 板各2ug，pMD18質粒每6孔板0. 5ug。另外，按質粒：脂質體=1:3比例預混脂質體混合物。
[0056] 嘌呤霉素篩選：轉染后24小時，換含0. 5ug/ml嘌呤霉素的完全培養液篩選3-4 天，待對照組細胞全部死亡，稀釋傳代于IOcm培養皿中培養，使細胞之間保持適當距離，便 于形成單個克隆，培養時可加嘌呤霉素也可不加嘌呤霉素，因為同源重組序列已經攜帶嘌 呤霉素抗性基因至基因組中，可以穩定遺傳。
[0057] PCR擴增及測序鑒定：提取細胞基因組DNA，采用同源臂擴增引物SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 8進行PCR擴增驗證和測序驗證。 實施例2 實施例2與實施例1的不同之處在于：①實施例2的目的是構建5種人類雄激素受體 AR點突變體，而實施例1的目的是敲除AR，使其失活；②基于實施例2與實施例1的目的不 同，TALEN-L和TALEN-R的識別位點在人類雄激素受體AR基因的第8外顯子下游，如圖2所 示；③基于實施例2中的點突變位點均位于AR基因的第8外顯子，故它們可以共用同源重 組右臂，如圖11所示，由引物SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 19擴增；④5種AR點突變體均 為人工設計合成引物帶入突變位點，突變位點均為下游引物（如SEQ ID NO. 10、12、14、15、 17所示）帶入，產物如圖6-10所示。并且，上下游同源臂(左右同源臂）之間帶有嘌呤霉素 抗性基因。
[0058] 本發明基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統及其應用，由剪切目的基因靶序 列的轉錄激活子樣效應因子核酸酶TALEN和插入人類AR定點突變基因的pMD18同源重組 模板質粒組成，并將該相應質粒轉入人類正常前列腺細胞系中，獲得穩定細胞株，表達點突 變的AR。該系統能夠準確識別人類AR基因的特定序列，并在基因組中實現定點突變，獲得 的穩定細胞株可以穩定傳代，遺傳背景清晰，準確表達定點突變的AR。
[0059] 本發明采用攜帶同源模板的pMD18載體共同轉染細胞系的方法，使細胞基因組在 TALEN切斷雙鏈DNA分子時，利用pMD18載體提供的同源序列，高效精確地對基因組進行編 輯；采用導入同源序列以重新編輯DNA序列的同時，帶入嘌呤霉素抗性基因，從而大大簡化 篩選過程中的人工勞動。
[0060] 上述實施例僅用于解釋說明本發明的發明構思，而非對本發明權利保護的限定， 凡利用此構思對本發明進行非實質性的改動，均應落入本發明的保護范圍。
【權利要求】
1. 一種基于TALEN和PMD18載體的定點突變系統，其特征在于：由核酸酶TALEN和 PMD18載體組成，所述核酸酶TALEN為剪切目的基因靶序列的轉錄激活子樣效應因子， TALEN由識別所述靶序列5'端的核酸酶TALEN-L和識別所述靶序列3'端的核酸酶TALEN-R 組成；所述PMD18載體為插入人類AR定點突變基因的pMD18同源重組模板質粒，pMD18載 體由靶基因的相應上下游序列和嘌呤霉素篩選標記組成。
2. 如權利要求1基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統，其特征在于所述定點突變 系統的定點突變方法為：切割目標基因組所形成的DNA斷裂位點通過同源重組修復，將一 對TALEN質粒和攜帶同源重組基因的質粒共同轉染受體細胞，TALEN質粒表達的蛋白會在 受體細胞基因組TALEN靶點的位置上切開一個口；外源基因會在切口處同源重組入受體基 因組；所述的目標基因為人類雄激素受體AR基因。
3. -種基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，其特征在于包括：細胞株的 構建和定點突變系統在人類基因組中改造人類雄激素受體AR基因的應用；所述細胞株的 構建方法如下：對轉染后的受體細胞進行稀釋培養，藥物篩選，獲得細胞克隆，鑒定外源基 因在受體細胞基因組上整合的情況，挑選出符合整合位置要求的陽性細胞克隆； 所述定點突變系統在人類基因組中改造人類雄激素受體AR基因的應用為采用權利要 求2所述的定點突變系統為將相應質粒轉入人類正常前列腺細胞系中，準確識別人類AR基 因的特定序列，并在基因組中實現定點突變，獲得的穩定細胞株可以穩定傳代。
4. 如權利要求3所述基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，其特征在于：所 述構建的細胞株為細胞株RWPE-AR-KO,所述細胞株為人正常前列腺離體細胞系RWPE-I改 造的細胞株，不表達AR蛋白。
5. 如權利要求4所述基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，其特征在于： 所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R ;所述pMD18載體包括pMD18載 體的第2外顯子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18載體的第2外顯子下游的同源右臂序 列核苷酸。
6. 如權利要求3所述基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，其特征在于：所 述構建的細胞株為細胞株RWPE-E872Q，所述細胞株RWPE-E872Q為人正常前列腺離體細胞 系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第872位氨基酸殘基由谷氨酸突變為谷氨酰胺的AR蛋 白。
7. 如權利要求3所述基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，其特征在于：所 述構建的細胞株為細胞株RWPE-H874Y，所述細胞株RWPE-H874Y為人正常前列腺離體細胞 系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第874位氨基酸殘基由組氨酸突變為酪氨酸的AR蛋白。
8. 如權利要求3所述基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，其特征在于：所 述構建的細胞株為細胞株RWPE-T877A，所述細胞株RWPE-T877A為人正常前列腺離體細胞 系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第877位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為丙氨酸的AR蛋白。
9. 如權利要求3所述基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，其特征在于：所 述構建的細胞株為細胞株RWPE-T877S，所述細胞株RWPE-T877S為人正常前列腺離體細胞 系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第877位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為絲氨酸的AR蛋白。
10. 如權利要求3所述基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應用，其特征在于： 所述構建的細胞株為細胞株RWPE-M886I，所述細胞株RWPE-M886I為人正常前列腺離體細 胞系RWPE-I改造的細胞株，穩定表達第886位氨基酸殘基由蛋氨酸突變為異亮氨酸的AR 蛋白。
11. 如權利要求6-10任一權利要求所述基于TALEN和PMD18載體的定點突變系統的應 用，其特征在于：所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R ;所述 PMD18載體包括pMD18載體的攜帶點突變位點的同源左臂序列核苷酸和pMD18載體的第8 外顯子下游的同源右臂序列核苷酸。
12. 如權利要求6-10任一權利要求所述基于TALEN和pMD18載體的定點突變系統的應 用，其特征在于：所述人細胞株轉入的PMD18載體含有抗嘌呤霉素的基因，能將嘌呤霉素抗 性基因帶入基因組，從而表達抗嘌呤霉素的蛋白。
【文檔編號】C12N9/22GK104212778SQ201410299205
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】宋春嬌, 茹國美, 郎娟, 郭艷, 張 林 申請人:紹興市人民醫院