快速檢測hla-b*1502等位基因的引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程【技術領域】，公開了一種快速檢測HLA-B*1502基因的引物、含有該引物的試劑盒以及采用該引物和試劑盒快速檢測HLA-B*1502基因的方法。本發明使用了HLA-B*1502基因的特異性引物，且采用多重引物的組合設計，完全覆蓋了HLA-B*1502基因的SNP位點，增強了特異性的結合，更加有效地防止了假陽性的產生。此外，本發明將特異性引物，dNTPs，PCR緩沖液和染料預先混合，大大節省了操作時間和工作量，具有快速、簡便、準確、直觀的特點，在3小時內即可完成整個基因的篩查和分型實驗，解決了HLA-B*1502基因用于抗癲癇類等藥物安全性用藥指導的問題。
【專利說明】快速檢測HLA-B*1502等位基因的引物、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程【技術領域】，具體涉及快速檢測HLA-B*1502等位基因的引物、 試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 癲癇是一種古老的神經系統常見病，嚴重危害著人類的健康。我國約有900多萬 癲癇患者，其中600萬病人每年仍有發作，而且每年還會出現60萬新發病例。卡馬西平 (CBZ)、苯妥英鈉（PHT)、拉莫三嗪（LTG)、奧卡西平（0XC)和苯巴比妥（PB)是常見的芳香族 抗癲癇藥物（AEDs)。這些藥物廣泛應用于臨床且能有效地控制癲癇發作與神經痛，但是同 時他們也會導致皮膚型藥物不良反應（cADRs)。
[0003] 隨著人類基因組學和藥物基因組學研究的不斷深入，一些藥物所致嚴重皮膚反應 與人類白細胞抗原HLA基因的關系得到了確認。HLA基因位于人體第6號染色體，是一群緊 密連鎖的復等位基因，包括100多個基因座位，已發現9000多個等位基因，全長3600kb，占 人類整個基因組的1/3000。HLA是調控人體特異性免疫應答和決定疾病易感性個體差異的 主要基因系統。在不同的種族或同一種族不同群體中的分布顯示明顯的特異性。
[0004] 經過研究，抗癲癇藥物引起的皮膚不良反應的基因相關性得到了逐步揭示，其中 HLA-B*1502與CBZ-SJS/TEN的強相關性業已得到確認。因此，美國FDA已做出相關警告，建 議服用卡馬西平前進行HLA-B*1502基因分型檢測。英國藥品和健康產品管理局（MHRA)亦 發布了相關使用警告。
[0005] 目前檢測HLA-B*1502的主要方法為PCR-SBT (基于測序分型的聚合酶鏈反應）、 PCR-SSP(序列特異引物引導的聚合酶鏈反應）、PCR-SS0 (序列特異性寡核苷酸探針雜交聚 合酶鏈反應）和RT-PCR(熒光定量PCR反應）等檢測方法。其中PCR-SBT方法是對HLA基 因的B位點進行測序，進而確定HLA-B*1502高分辨率的方法，但其檢測的步驟繁瑣，費用昂 貴并且周轉時間較長（大于1天），不適合對于用藥安全性的快速指導。RT-PCR的檢測方 法需要特定的儀器，且試劑、耗材較貴，而且需要制備標準品，對實驗環境要求高。PCR-SSP 方法是利用與HLA等位基因序列互補的引物，對待測樣本DNA進行特異性PCR擴增，具有成 本低，時間短的特性。雖然，總的來說PCR-SSP是一種相對簡單方便、特異性高的方法，且目 前已有基于PCR-SSP方法進行單特異引物檢測HLA-B*1502的試劑盒，但目前市面上的試劑 盒涵蓋的基因型別較少，容易出現假陽性，遠遠不能滿足對用藥安全性的快速、簡便、高特 異性檢測HLA-B*1502基因的需求。
【發明內容】
[0006] 本發明針對現有技術中存在的上述缺陷，基于最新的HLA數據庫，考慮不同引物 設計的位置、序列、涵蓋的等位基因數量等因素，并應用單管多重PCR反應體系，通過兩個 反應即實現了基因型別的檢測，從而提供了一種快速，簡便、高特異性、易標準化地定性檢 測HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法。
[0007] 為此，本發明一方面提供了一種快速檢測HLA_B*1502基因的引物，其包含SEQ ID NO. 1-4所示的檢測引物EPR) 1、EPRO1、EPF02和EPR02，所述四種引物分別組成引物組P1和 P2,其中 P1 組為 EPR)1-EPR01-EPF02-EPR02, P2 組為 EPR)1-EPR02-EPF02-EPR01。
[0008] 在本發明優選的實施方案中，該引物還進一步包含SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所 示的內對照引物NCXF和NCXR。
[0009] 本發明另一方面提供了 一種快速檢測HLA-B* 1502基因的試劑盒，其包含PCR反應 混合液和Taq酶，所述PCR反應混合液中分別包含如上所述的引物組P1和P2,所述Taq酶 的濃度優選為5U/yL。
[0010] 在本發明更加優選的實施方案中，該試劑盒中快速檢測HLA-B*1502基因的引物 EPR)1、EPR01、EPF02 和 EPR02 的濃度均為 0· 5 μ M。
[0011] 在本發明另一優選的實施方案中，該試劑盒的PCR反應混合液中進一步包含如上 所述的內對照引物。
[0012] 在本發明更加優選的實施方案中，該試劑盒中內對照引物NCXF和NCXR的濃度均 為 0· 2 μ M。
[0013] 在本發明再一優選的實施方案中，該試劑盒的PCR反應混合液中進一步包含 dNTPs，染料和PCR緩沖液，染料進一步優選為甲酚紅。
[0014] 在本發明更加優選的實施方案中，該試劑盒中dNTPs濃度為0. 2mM，染料濃度為 0. 01 %，PCR緩沖液組成為：Tris-HCL濃度10mM，氯化鉀濃度50mM，氯化鎂濃度1. 5mM，明膠 濃度 0. 001%。
[0015] 本發明另一方面提供了一種快速檢測HLA-B*1502基因的方法，其包含以下步驟：
[0016] 1、提取待檢測樣品的DNA溶液；
[0017] 2、采用如上所述的引物或采用如上所述的試劑盒，以步驟1中提取的DNA溶液作 為模板，進行PCR擴增；
[0018] 3、PCR擴增產物經電泳后，進行結果判讀，當內對照條帶和HLA_B*1502基因條帶 同時出現時，表明該基因為HLA-B*1502基因陽性，而只出現內對照條帶時，則表明該基因 為HLA-B*1502基因陰性
[0019] 本發明再一方面提供了如上所述的引物或如上所述的試劑盒在快速檢測 HLA-B*1502基因中的應用。
[0020] 由上述描述可知，與現有技術相比，本發明基于PCR-SSP技術開發的HLA-B*1502 基因篩查試劑盒，由于使用了特異性引物，且采用多重引物的組合設計，完全覆蓋了 HLA-B*1502基因的SNP位點，增強了特異性的結合，更加有效地防止了假陽性的產生，具 有快速、簡便、準確、直觀的特點，并且實驗成本低，僅需微量檢材即可完成實驗檢測所需。 同時，本發明的檢測試劑盒可以很直觀地根據PCR擴增后電泳條帶的有無情況，即可判斷 HLA-B*1502的等位基因型，從而完成HLA-B*1502的快速篩查。
[0021] 此外，本發明將引物，dNTPs，PCR緩沖液和染料預先混合，可大大節省實驗者的操 作時間和工作量。并且，本發明將等位基因的多對引物混合，完成同時擴增，實現了兩個PCR 反應即可完成等位基因的分型，滿足了高通量的實驗需求，直接得出分型和篩查結果，具有 靈敏、穩定、準確、高效的特點。在擁有合格DNA樣品的情況下，本發明在3小時內即可完成 整個基因篩查和分型實驗，解決了 HLA-B*1502基因用于抗癲癇類藥物安全性用藥指導的 問題。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1 :檢測樣品的凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發明而非限定本 發明。應當指出，對于本領域技術人員而言，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發 明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也同樣落入本發明的保護范圍之內。
[0024] 實施例1 :快速檢測HLA_B*1502基因的引物設計
[0025] PCR引物設計所需要的所有HLA等位基因的數據來源于MGT/HLADatabase (R elease3. 15. 0, 2014-01-17)，具體網址為：http ://www. ebi. nc. uk/ipd/imgt/hla/。引 物設計采用人工方法，設計的引物在IMGT數據庫中進行比對，確認該引物能特異性結合 HLA-B*1502等位基因。在引物設計過程中，關鍵是使設計的引物在特定的PCR緩沖體系環 境下，能夠特異地擴增HLA-B*1502基因，即該引物為一種"具有序列特異性的SSP"。
[0026] 為了采用特異性的PCR-SSP對HLA-B*1502基因進行篩查，在HLA-B*1502基因 的SNP位點區域分別設計了特異性引物EPF01(SEQ ID N0. 1)、引物EPR01(SEQ ID N0. 2)、 引物EPR)2 (SEQ ID NO. 3)和引物EPR02 (SEQ ID NO. 4)，4個引物分別組合為P1和P2兩 組，以防止HLA-B*1502基因的漏檢，其中PI組為EPF01-EPR01-EPF02-EPR02, P2組為 EPFO1-EPR02-EPF02-EPR01〇
[0027] 同時，對下游引物的3'端引入了錯配堿基的特異性設計，以增強引物擴增的特異 性。
[0028] 為了保證反應體系的正常進行，還設計了一對上下游引物NCXF(SEQ ID N0. 5)和 NCXR (SEQ ID NO. 6)，作為內對照引物。
[0029] 具體設計的引物情況如表1所示。
[0030] 表1.快速檢測HLA-B*1502基因的引物
[0031]
【權利要求】
1. 一種快速檢測HLA-B*1502基因的引物，其包含SEQ ID NO. 1-4所示的檢測引 物EPTO1、EPR01、EPF02和EPR02，所述四種引物分別組成引物組P1和P2，其中P1組為 EPF01-EPR01-EPF02-EPR02, P2 組為 EPF01-EPR02-EPF02-EPR01。
2. 根據權利要求1所述的引物，其進一步包含SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的內對 照引物NCXF和NCXR。
3. -種快速檢測HLA_B*1502基因的試劑盒，其包含PCR反應混合液和Taq酶，所述PCR 反應混合液分別包含權利要求1所述的引物組P1和P2,所述Taq酶的濃度優選為5U/μ L。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其中快速檢測HLA-B* 1502基因的引物EPTO1、 EPR01、EPF02 和 EPR02 的濃度均為 0. 5 μ Μ。
5. 根據權利要求3或4所述的試劑盒，其中PCR反應混合液中進一步包含權利要求2 所述的內對照引物。
6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其中內對照引物NCXF和NCXR的濃度均為0. 2 μ M。
7. 根據權利要求3至6任一項所述的試劑盒，其中PCR反應混合液中進一步包含 dNTPs，染料和PCR緩沖液，染料優選為甲酚紅。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其中dNTPs濃度為0. 2mM，染料濃度為0. 01 %，PCR緩 沖液組成為：Tris-HCL濃度10mM，氯化鉀濃度50mM，氯化鎂濃度1. 5mM，明膠濃度0. 001 %。
9. 一種快速檢測HLA-B*1502基因的方法，其包含以下步驟： (1) 提取待檢測樣品的DNA溶液， (2) 采用權利要求1或2所述的引物，或采用權利要求3至8中任一項所述的試劑盒， 以步驟⑴中提取的DNA溶液作為模板，進行PCR擴增； (3) PCR擴增產物經電泳后，進行結果判讀，當內對照條帶和HLA-B*1502基因條帶同 時出現時，表明該基因為HLA-B*1502基因陽性，而只出現內對照條帶時，則表明該基因為 HLA-B*1502基因陰性。
10. 權利要求1或2所述的引物，或者權利要求3至8中任一項所述的試劑盒在快速檢 測HLA-B*1502基因中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104046696SQ201410293464
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月25日 優先權日:2014年6月25日
【發明者】鄭仲征, 潘捷, 謝志聰 申請人:上海荻碩貝肯生物科技有限公司