一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的snp標記的檢測引物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物及其應用。檢測引物包括：ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；AS?SN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。利用本發明的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物，能夠擴增出肌肉生長抑制素基因的SNP位點，該位點顯著與肌肉重量相關聯，再根據PCR擴增電泳圖可直觀地比較個體間閉殼肌重的大小，可直接用于后續的分子標記輔助育種，如可在生長早期篩選目標性狀，進而篩選特定的個體進行品種培育。
【專利說明】-種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物 及其應用
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于水產動物遺傳及分子標記輔助育種【技術領域】，具體涉及一種與馬氏珠 母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物及其應用。
【背景技術】：
[0002] 馬氏珠母貝是我國及世界上海水珍珠養殖的主要物種。我國自1965年成功地開 展了馬氏珠母貝人工育苗以來，海水珍珠產業發展迅速，已成為廣東、廣西及海南部分沿海 地區海水養殖支柱產業之一。近10多年，我國海水珍珠的質量和產量明顯下降，國際競爭 力減弱，養殖經濟效益下滑。就其原因，除了養殖環境惡化、養殖技術落后外，還有一個重要 原因是：多年來不注重種貝的選育和保留，缺乏優良品種；種苗質量參差不齊，育珠母貝性 狀退化，如生長慢、個體小型、育珠能力減弱等。為了我國海水珍珠養殖業的健康穩定發展， 培育適合我國海區養殖的馬氏珠母貝優良品種已迫在眉睫。
[0003] 育種技術有雜交、選擇育種，生物技術育種及分子育種等多種方法。分子育種是 目前國內外研究的熱點，是育種技術發展的主要方向，它具有高效、快捷的特點。分子育 種離不開分子標記的開發，用在海洋貝類遺傳育種研究的分子標記主要有限制片段長度 多態性（RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、擴增片段長度多態性（AFLP)、錨定簡單重復 序列（ISSR)、簡單重復序列（SSR)、單核苷酸多態性（SNP)、表達序列標簽（EST)、線粒體 DNA(mtDNA)、核糖體DNA內轉錄間隔區標記（ITS)分子標記等。Qiu等對合浦珠母貝不 同群體進行EST-SSR標記與生長及珍珠層性狀的關聯分析，結果表明在野生群體中基因 PmartE05、PmartE35與殼高、總重顯著相關，基因 PmartE64與珍珠層厚度顯著相關，在養殖 群體中發現基因 PmartE05與殼高顯著的相關。Cong等利用SNP標記研究太平洋牡蠣的胰 島素相關多肽基因（〇IRP)的多態性與生長性狀的關聯分析，發現在〇IRP基因1.5kb處發 現31個SNPs，其中6個與生長性狀顯著相關，特別是標記T1358G和標記G1437A與殼高、殼 長、殼寬、總重、軟體部重5個生長性狀顯著相關。
【發明內容】
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[0004] 本發明的第一個目的是提供一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢 測引物。
[0005] 本發明的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物，其特征在于，包 括：
[0006] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0007] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0008] ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0009] ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
[0010] 本發明的第二個目的是提供一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記，其特 征在于，其特異性檢測引物為：
[0011] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0012] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0013] ASSN815F0 ： TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0014] ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
[0015] 本發明的第三個目的是提供與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記在鑒定馬 氏珠母貝閉殼肌重大小中的應用，其特征在于，包括以下步驟：
[0016] a、提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA ;
[0017] b、采用上述引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0 對馬氏珠母貝樣 品基因組DNA進行PCR擴增；
[0018] c、根據PCR擴增產物對馬氏珠母貝樣品進行鑒定，當出現具有207bp和180bp大 小2條帶的為AG型，個體為閉殼肌重小的樣品；當只出現180bp大小1條帶的為GG型，個 體為閉殼肌重大的個體。
[0019] 優選，所述的PCR擴增，其PCR反應體系為：12. 5yL PCR反應體系如下：包含馬 氏珠母貝樣品基因組 DNA40ng，lXPCR Mixture，引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、 ASSN815R0 各 0·5μΜ，0·125υ Taq DNA 酶，余量為水；反應條件為：94°C，5min;94°C35s， 62°C 40s ;72°C 40s，5 個循環；94°C 35s，6(TC 40s，72°C 40s，15 個循環；94°C 35s，58°C 40s， 72°C 40s，15 個循環：72°C延伸 lOmin。
[0020] 本發明的第四個目的是提供與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記在馬氏珠 母貝分子標記輔助育種中的應用。
[0021] 利用本發明的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物，能夠擴增出 肌肉生長抑制素基因的SNP位點，該位點顯著與肌肉重量相關聯，再根據PCR擴增電泳圖可 直觀地比較個體間閉殼肌重的大小，可直接用于后續的分子標記輔助育種，如可在生長早 期篩選目標性狀，進而篩選特定的個體進行品種培育。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0022] 圖1是與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的擴增電泳圖，其中泳道1-12為 馬氏珠母貝樣品，Μ為marker。
【具體實施方式】：
[0023] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0024] 實施例1 :
[0025] 隨機取來至于同一群體的50個馬氏珠母貝個體，清洗干凈后，取其閉殼肌組織用 電子天平稱重并一一對應記錄，然后取一小塊閉殼肌組織置于95%乙醇中，于_20°C保存。 使用HiPure Universal DNA Kit (廣州美基生物公司）對閉殼肌的基因組DNA進行提取， 相關操作參見試劑盒說明書進行。DNA提取后，于1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性， 紫外分光光度計測量DNA的濃度和純度，于-20°C保存。
[0026] 與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物為：
[0027] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0028] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0029] ASSN815F0 ： TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0030] ASSN815R0 ：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC
[0031] 用上述引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0 對馬氏珠母貝樣品基 因組DNA在PCR儀上進行PCR擴增。PCR反應體系如下：擴增體系12. 5ul，包含馬氏珠母 貝樣品基因組 DNA0. 4μ L，6. 25μ L2XPCR Mixture, ΙΟμΜ 引物（ASSN815FI、ASSN815RI、 ASSN815F0、ASSN815R0)各0· 5 μ L, 0· 125U Taq DNA酶（廣州東盛生物科技有限公司），雙 蒸水補足至 12. 5μ L。反應條件為：94°C，5min ;94°C 35s，62°C 40s ;72°C 40s，5 個循環； 94°C 35s，60°C 40s，72°C 40s，15 個循環；94°C 35s，58°C 40s，72°C 40s，15 個循環：72°C延伸 lOmin。PCR產物用3%瓊脂糖（廣州康龍科技生物公司）凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察 電泳圖譜。分型電泳圖如圖1所示，出現具有207和180bp大小2條帶的AG型（泳道6和 8)，只出現180bp大小1條帶的為GG型（泳道2-4、7、9-12)。在這50個個體中，AG型個體 29個，肌肉重0. 68±0. 34g，GG型個體有21個，閉殼肌重1.07±0. 37g。采用SPSS17. 0軟 件中的單因素方差分析（One-way AN0VA)對SNP位點與肌肉重進行關聯分析，GG型個體的 閉殼肌重顯著大于AG型個體（p〈0. 01)，即認為它們之間具有極其顯著的統計學差異。
[0001] 說明書 序列犮 <110>中國科學院南海海洋研究所 <12?>-種與馬氏珠母K閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物及其應用 <160 >4 -210-1 <211 >22 <212>DNA <213>人工序列 <400〉1 TCCATCGTGG ACAAACGTGT AA 22 <2102 <211>27 <212>DNA <213>人1:序列 CjTCjTC \A/\GT AAACTGTATC TCGTGCC 27 <210>3 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 [0002] <4003 TAGAATTGGC AAAGGAACAA GCAT 24 <210>4 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <400>4 AATAATTCCT AACAGGTGCC CGTC 24
【權利要求】
1. 一種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記的檢測引物，其特征在于，包括： ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ； ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ； ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ； ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
2. -種與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記，其特征在于，其特異性檢測引物為： ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ； ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ； ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ； ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
3. 與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記在鑒定馬氏珠母貝閉殼肌重大小中的應 用，其特征在于，包括以下步驟： a、 提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA; b、 采用權利要求1所述的檢測引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0對 馬氏珠母貝樣品基因組DNA進行PCR擴增； c、 根據PCR擴增產物對馬氏珠母貝樣品進行鑒定，當出現具有207bp和180bp大小2 條帶的為AG型，個體為閉殼肌重小的樣品；當只出現180bp大小1條帶的為GG型，個體為 閉殼肌重大的個體。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的PCR擴增，其PCR反應體系為： 12.5yL PCR反應體系如下：包含馬氏珠母貝樣品基因組DNA40ng，lXPCR Mixture，檢測 引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0各0·5μM，0·125UTaqDNA酶，余量 為水；反應條件為：941：，51^11 ;941：358,621：4〇8;721：4〇8,5個循環；941：358,6〇1：4〇8， 72°C 40s，15 個循環；94°C 35s，58°C 40s，72°C 40s，15 個循環：72°C延伸 lOmin。
5. 權利要求2所述的與馬氏珠母貝閉殼肌重相關聯的SNP標記在馬氏珠母貝分子標記 輔助育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104099415SQ201410289345
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】何毛賢, 李琴 申請人:中國科學院南海海洋研究所