一種核酸片段及其用途
【專利摘要】本發明公開了一種核酸片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明還公開了所述核酸片段在制備診斷乳腺癌和/或子宮內膜癌的試劑中的用途，以及由該診斷試劑組成的試劑盒。本發明還公開了該核酸片段在制備雌激素受體拮抗劑中的用途，可用于制備治療乳腺癌的藥物，具有實際應用價值。
【專利說明】-種核酸片段及其用途 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及一種核酸片段及其用途。 【背景技術】
[0002] 自20世紀70年代末開始，乳腺癌的發病在全球范圍內一直位居女性腫瘤的首位， 我國雖不是乳腺癌的高發國家，但發病率卻呈逐年上升的趨勢。根據雌激素受體（ER)表達 情況，乳腺癌可分為雌激素受體依賴性乳腺癌和非激素受體依賴性乳腺癌。雌激素受體依 賴性乳腺癌表達雌激素受體，并依賴雌激素生長，對激素敏感、抗性弱，可以采用抗雌激素 藥物治療，而非激素受體依賴性乳腺癌不表達雌激素受體，不依賴雌激素生長，對激素的敏 感性差、抗性強，不能采用抗雌激素藥物治療。據研究，約70%的乳腺癌為雌激素受體依賴 性乳腺癌，因此，檢測乳腺癌組織中的雌激素受體表達情況，確定乳腺癌是否為雌激素受體 依賴性乳腺癌，對治療和預后具有重要意義。
[0003] 子宮內膜癌是婦科常見的惡性腫瘤，發病率僅次于子宮頸癌。根據雌激素受體表 達情況，子宮內膜癌可分為雌激素受體依賴性子宮內膜癌和非激素受體依賴性子宮內膜 癌。雌激素受體依賴性子宮內膜癌的預后較好，而非激素受體依賴性子宮內膜癌的預后較 差。據研究，約80%的子宮內膜癌為雌激素受體依賴性子宮內膜癌，因此，檢測子宮內膜癌 組織中的雌激素受體表達情況，確定乳腺癌是否為雌激素受體依賴性子宮內膜癌，對治療 和預后具有重要意義。
[0004] 現有的雌激素受體檢測方法通常采用雌激素和雌激素受體抗體進行檢測，其中， 雌激素因分子量太小，不能用于免疫組化檢測乳腺癌和子宮內膜癌組織，難以有效定位，雌 激素受體抗體可以用于免疫組化檢測，但是抗體生產是一個耗費時間的復雜過程，而且需 要動物養殖和/或細胞培養的設施。因此，急需一種更容易和更少代價的方法來對乳腺癌 中ER進行檢測。
[0005] 雌激素依賴性乳腺癌的治療方式眾多，包括外科治療、化學治療、放射治療和中醫 中藥治療，其中，抗雌激素藥物是最重要的治療藥物之一，其可以通過消除雌激素與雌激素 受體的相互作用促使癌細胞凋亡，包括雌激素受體拮抗劑例如它莫西芬，芳香化酶抑制劑 如依西美坦等。它莫西芬是目前最為常見的雌激素依賴性乳腺癌治療藥物，它通過競爭性 結合雌激素受體，抑制雌激素與雌激素受體結合，治療乳腺癌。然而，使用它莫西芬存在嚴 重的耐藥性，因而需要開發新的抗雌激素藥物。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述問題，本發明涉及一種核苷酸序列及其用途，具體涉及一種能夠與 雌激素受體特異性結合的核酸適體，及其在制備診斷乳腺癌和/或子宮內膜癌的試劑中的 用途和制備雌激素受體拮抗劑中的用途。
[0007] 本發明公開的的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述核酸片段是雌激素受體的核酸適體（Aptamer)(即ER-Aptamer)，對雌激素受 體有高親和力。
[0009] 核酸適體（aptamer)指的是經體外篩選技術SELEX (指數富集配體系統進化）篩 選出的能特異結合蛋白質或其他小分子物質的核酸片段。
[〇〇1〇] 本發明還提供了所述核酸片段在制備診斷表達雌激素受體的組織和/或細胞的 試劑中的用途。優選地，所述診斷表達雌激素受體的組織和/或細胞的試劑是診斷雌激素 受體依賴性乳腺癌或雌激素受體依賴性子宮內膜癌的試劑。
[〇〇11] 雌激素受體依賴性乳腺癌，是指表達雌激素受體的乳腺癌。
[〇〇12] 雌激素受體依賴性子宮內膜癌，是指表達雌激素受體的子宮內膜癌。
[〇〇13] 一種診斷表達雌激素受體的組織和/或細胞的試劑，它是含有標記物的權利要求 1所述的核酸片段，所述標記物為生物素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、地高辛或熒光素。
[0014] 一種檢測乳腺癌和/或子宮內膜癌的試劑盒，包括前述診斷試劑。
[0015] 優選地，它包括生物素標記的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段、鏈親和 素-辣根過氧化物酶和DAB溶液；
[0016] 或者，它包括辣根過氧化酶標記的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段和 DAB溶液。
[0017] DAB溶液，即二氨基聯苯胺溶液。
[0018] 所述的核苷酸序列在制備雌激素受體拮抗劑中的用途。
[0019] 所述雌激素受體拮抗劑是治療雌激素受體依賴性乳腺癌的藥物。
[0020] 雌激素受體拮抗劑，是指競爭性結合雌激素受體，抑制雌激素與雌激素受體結合 的物質。
[0021] 本發明核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所不的ER-核酸適體，與ER分子的未和力與 雌激素相當，且其分子量大，可以用于免疫組化檢測表達雌激素受體的組織和/或細胞，如 乳腺癌和子宮內膜癌，同時，其還是一種雌激素受體拮抗劑，可以有效抑制乳腺癌細胞的增 殖，是一種新的乳腺癌的治療藥物，同時，本發明核酸片段的制備方法簡單，成本低廉。
[0022] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0023] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1表示生物素標記的寡核苷酸與從MCF-7乳腺癌細胞株制備的雌激素受體（ER) 結合的飽和曲線。
[0025] 圖2圖1所示飽和曲線的斯卡查德（Scatchard)作圖，分析寡核苷酸與雌激素受 體結合的親和度和結合量。根據斯卡查德公式，BS = BT - BN，結果以圖形方式表示，其中BT 為總結合，BN為非特異性結合，BS為特異性結合。根據曲線的斜率和在橫軸上的截距計算 出寡核苷酸與雌激素受體結合的解離常數（Kd)和結合量（Bmax)。該圖為一個代表性的試 驗，該實驗重復3次。
[0026] 圖3生物素標記核苷酸序列和特異的抗ER單克隆抗體對乳房癌組織的免疫染色 比較。乳腺癌入選病例為已經病理學檢測確認的癌癥病例。第一行是用生物素標記核苷酸 序列的乳房癌免疫染色，第二行是用抗ER單克隆抗體的乳腺癌免疫染色。該圖顯示該寡核 苷酸和抗體均識別相同的癌細胞，但不識別相鄰的非腫瘤組織。所有的照片都是在光學顯 微鏡X200的放大倍率下拍攝。
[0027] 圖4使用合成的生物素標記寡核苷酸對石蠟包埋的乳腺癌和子宮內膜癌組 織切片進行免疫染色。A和E分別是子宮內膜癌和乳腺癌的樣本；用生物素標記寡核 苷酸+str ept〇avidin-HRP染色。B和F分別為子宮內膜癌和乳腺癌陰性對照；僅用 str印toavidin-HRP染色。C和G分別為子宮內膜癌和乳腺癌陰性對照；將生物素標記寡核 苷酸與純化ER蛋白進行預孵育，然后再應用到切片上。D和Η分別為子宮內膜癌和乳腺癌 陰性對照；將生物素標記的對照DNA寡核苷酸（與ER-核酸適體的序列長度相同）應用到 切片上。入選病例為已經病理學檢測確認的癌癥病例。該圖顯示生物素標記的核苷酸序列 特異性地定位組織切片中的腫瘤細胞，但不與相鄰的非惡性組織發生交叉反應，而乳腺癌 和子宮內膜癌的陰性對照切片均未見特異性染色。所有圖像均是光學顯微鏡Χ200的放大 倍率下拍攝。
[0028] 圖5從10到1000 μ Μ時，它莫西芬（□)或ER-核酸適體（）對MCF-7細胞增殖 存在劑量依賴性影響。細胞增殖的用ΜΤΤ法測定。數據取3次重復測量的均數土 SE。未處 理的對照定義為100%，細胞增殖的百分比與對照比較。*與對照組相比時Ρ〈〇. 05。
[0029] 圖6ER-核酸適體（Α)和它莫西芬（Β)對雌激素誘導的MCF7細胞增殖的拮抗作 用。雌二醇以劑量依賴的方式增加 MCF7細胞的增殖（柱形圖），而ER-核酸適體()或它 莫西芬（〇）可抑制雌二醇作用。細胞增殖采用MTT法檢測。數據取3次重復測量的均數 土SE。未處理的對照定義為100%，細胞增殖的百分比與對照比較。*與雌二醇處理相比時 P〈0.05。 【具體實施方式】
[0030] 實施例1本發明核酸片段（ER-核酸適體）的制備及其與雌激素受體的結合能力 鑒定
[0031] 1、本發明雌激素受體的核酸適體的制備
[0032] 采用體外篩選技術SELEX (指數富集配體系統進化）篩選雌激素受體的核酸適體， 得到一個與雌激素受體具有高親和力的核酸片段，其序列（SEQ ID NO. 1)如下：
[0033] 5'-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCA AAGTTAATG-3'。
[0034] 送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0035] 2、核酸適體與雌激素受體結合能力的驗證
[0036] 為了測定上述SEQ ID NO. 1所示核酸適體與雌激素受體的親和力，采用基于ELISA 的配體-受體結合測定方法測定。
[0037] 實驗步驟：
[0038] (1)對合成的SEQ ID NO. 1所示ER-核酸適體的5'末端進行生物素標記。
[0039] (2)MCF_7細胞勻漿細胞質總受體蛋白從培養的獲得：將MCF-7細胞在細胞溶質 制備緩沖液（10mM的Tris-HCl，pH值7·5，lmM的EDTA，lmM的二硫蘇糖醇（DTT)，10%甘 油，150mM的谷氨酸鉀和Sigma蛋白酶抑制劑混合物）中勻漿，再采用高速（10, OOOg)，低溫 (4°C )離心lh而獲得細胞質總受體蛋白。
[0040] (3)將步驟⑵的提取物包被在96孔的酶標板（2 μ g/孔）。加入不同濃度生物 素標記的核酸適體或雌二醇，在37°C孵育1小時。所有的濃度均做復孔。未結合的核酸適 體通過用PBS-吐溫洗液洗漆4次除去。再用Streptavidin-辣根過氧化物酶（HRP)結合 物與結合的核酸適體中生物素反應。以TMB作為底物，比色確定核酸適體的結合值。生物 素標記的核酸適體與受體的特異性結合值則是將總的結合值（無未標記的核酸適體或雌 二醇）減去非特異性結合值（加入100倍未標記的核酸適體或雌二醇）確定。
[0041] (4)根據斯卡查德（Scatchard)方程，將得到的數據進行作圖。對結合親和力（Kd) 和能力（結合位點的數目）進行計算，得到生物素標記的核酸適體與ER結合得的親和力和 最大結合量。
[0042] 實驗結果：
[0043] 生物素標記的ER-核酸適體與ER結合的飽和曲線見圖1，生物素標記的ER-核酸 適體結合的Scatchard作圖見圖2。
[0044] 如圖1?2所示，生物素標記的ER-核酸適體與ER復合物的解離常數（Kd) 為0. 34±0. 05nM(n = 3 ;r = 0. 989)。該Kd值與已報道的雌激素在乳腺癌MCF-7細 胞結合值相吻合（〇· 35ηΜ+0· 05) (Wooge C. H.，Nilsson G. M.，Heierson A.，McDonnell D.P.,Katzenellenbogen B.S. Structural requirements for high affinity ligand binding by estrogen receptors:a comparative analysis of truncated and full length estrogen receptors expressed in bacteria, yeast, and mammalian cells. Mol Endocrinol. 1992 ；6:861-869)
[0045] 實驗結果說明，本發明SEQ ID NO. 1所示ER-核酸適體與雌激素受體（ER)結合具 有非常強的親和力，與雌激素相當，是一種檢測表達雌激素受體的組織或細胞的診斷試劑。
[0046] 實施例2本發明檢測試劑盒
[0047] 1、試劑盒一
[0048] 試劑盒組成（50人份）：
[0049]
【權利要求】
1. 一種核酸片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 權利要求1所述的核酸片段在制備診斷表達雌激素受體的組織和/或細胞的試劑中 的用途。
3. 根據權利要求2所述的用途，其特征在于：所述診斷表達雌激素受體的組織和/或 細胞的試劑是診斷雌激素受體依賴性乳腺癌或雌激素受體依賴性子宮內膜癌的試劑。
4. 一種診斷表達雌激素受體的組織和/或細胞的試劑，其特征在于：它是含有標記物 的權利要求1所述的核酸片段，所述標記物為生物素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、地高辛 或熒光素。
5. -種檢測表達雌激素受體的組織和/或細胞的試劑盒，其特征在于：它包括權利要 求4所述的試劑。
6. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：它包括生物素標記的權利要求1所述 的核酸片段、鏈親和素-辣根過氧化物酶和DAB溶液； 或者，它包括辣根過氧化酶標記的權利要求1所述的核酸片段和DAB溶液。
7. 權利要求1所述的核酸片段在制備雌激素受體拮抗劑中的用途。
8. 根據權利要求7所述的用途，其特征在于：所述雌激素受體拮抗劑是治療雌激素受 體依賴性乳腺癌的藥物。
【文檔編號】C12Q1/68GK104109667SQ201410289326
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】葉尚勉 申請人:葉尚勉, 四川禾力生物制藥有限公司