一種適用于幼齡兔卵母細胞體外受精方法及培養液配方的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種適用于幼齡兔卵母細胞體外受精方法及培養液配方。本發明在BO受精液中添加10μM EGCG，用于幼齡兔卵母細胞體外受精，在BO受精液中添加10μM EGCG，BO受精液為：NaCl 6.5453mg/mL，KCl 0.2997mg/mL，NaH2PO4·H2O 0.1145mg/mL，MgCl2·6H2O 0.1057mg/mL，CaCl2·2H2O 0.330mg/mL，葡萄糖2.518mg/mL，0.2％酚紅4％，100IU/mL青霉素，100IU/mL鏈霉素，NaHCO33.1080mg/mL，丙酮酸鈉0.1380mg/mL，肝素20μg/mL，BSA 20mg/mL。克服了現有幼齡家畜體外培養體系的缺陷。本發明在BO受精液中，不同濃度EGCG對幼齡兔卵母細胞體外受精具有顯著性的影響(P＜0.05)，受精液中EGCG添加濃度為5μM、10μM、15μM時，受精率顯著高于0和20μM(分別為43.26±5.92和46.34±3.57)，而添加5μM、10μM、15μM時，幼齡兔卵母細胞受精率差異不顯著，添加10μM時，高于5μM和15μM。
【專利說明】一種適用于幼齡兔卵母細胞體外受精方法及培養液配方
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物學領域，特別涉及一種適用于幼齡兔卵母細胞體外受精方法及培 養液配方。
【背景技術】
[0002] 幼畜體外胚胎生產和移植技術（Juvenile In Vitro Embryo Transfer，JIVET) 包括幼畜超數排卵、卵母細胞體外成熟（In Vitro Maturation，IVM)、體外受精（In Vitro Fertil ization，IVF)、胚胎體外培養（In Vitro Culture, IVC)及胚胎移植等技術。該技 術是通過外源性促性腺激素，誘導幼畜卵巢上卵泡的超數發育，而后通過取卵、卵母細胞體 外成熟、體外受精及受精卵體外培養等技術生產出優質胚胎，并移植母體內從而獲得優質 后代。體外受精技術是JIVET技術的一個重要環節，通過提高體外受精培養效果，能顯著提 高后期胚胎的生長及發育質量，有效地提高JIVET技術的生產效率。
[0003] 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG)是兒茶素中一種主要的酯型兒茶素，其分子 量為：458. 38,分子式：C22H18(VEGCG具有較強的抗氧化作用，能有效地清除氧自由基，能保 護細胞及其DNA免受損傷，EGCG的這些特點，使得其在抗氧化、防治糖尿病、抗癌變和神經 元保護功能等方面具有很強的功效。在體外受精過程中，精子在體外獲能及受精過程中會 產生多種有害物質，如細胞脂肪代謝產生的活性氧、氧自由基，過量的活性氧和氧自由基將 會大大降低體外胚胎生產效率。而EGCG具有很強的抗氧化作用，因此在體外胚胎生產培養 體系中，添加一定濃度EGCG能有效地提高卵母細胞成熟率、受精率及胚胎發育。
[0004] 在本發明之前，目前幼齡家畜的體外培養體系多參照成年家畜的體外培養體系， 但由于幼齡家畜卵母細胞結構及生長發育模式與成年家畜有所不同，因而需要建立一種適 用于幼齡家畜特有的培養體系及方法，才能有效地提高幼齡家畜胚胎體外生產效率。成年 兔體外受精培養過程中，常采用B0受精液。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的就是要克服上述缺陷，研制一種適用于幼齡兔卵母細胞體外受精方 法及培養液配方。
[0006] 本發明的技術方案是：
[0007] 本發明所述的一種適用于幼齡兔卵母細胞體外受精方法，其主要技術特征在于在 B0受精液中添加10 μ M EGCG，用于幼齡兔卵母細胞體外受精。
[0008] 本發明的另一技術方案是：
[0009] -種用于幼齡兔卵母細胞體外受精的受精培養液，其主要技術特征在于， 在 Β0 受精液中添加 10 μ M EGCG，Β0 受精液為：NaC16. 5453mg/mL，KC10. 2997mg/mL， NaH2P04 · Η200· 1145mg/mL，MgCl2 · 6Η200· 1057mg/mL，CaCl2 · 2Η200· 330mg/mL，葡萄糖 2. 518mg/mL，0. 2%酚紅 4%，lOOIU/mL 青霉素，lOOIU/mL 鏈霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮 酸納 0· 1380mg/mL，肝素 20 μ g/mL，BSA20mg/mL。
[0010] 本發明利用幼齡兔卵母細胞進行體外成熟，將成熟卵母細胞移入含不同濃度EGCG 受精液（0、5、10、15、20μΜ)中，將精子獲能后，加入受精液中，研究不同濃度EGCG對幼齡兔 卵母細胞體外受精的影響，選出最優添加濃度，建立一種高效的幼齡兔卵母細胞體外受精 培養體系，優化JIVET的相關技術。
[0011] 本發明的優點和效果在于：
[0012] 在Β0受精液中，不同濃度的EGCG對幼齡兔卵母細胞體外受精具有顯著性的影響 (P<0.05)，受精液中EGCG添加濃度為5μM、10μM、15μM時（受精率分別為56.05±5.22、 62. 41 ±3. 09和58. 99±2. 21)，其受精率顯著高于0和20 μ Μ(受精率分別為43. 26±5. 92 和46. 34±3. 57)，而添加5 μ Μ、10 μ Μ、15 μ Μ時，幼齡兔卵母細胞受精率差異不顯著（Ρ > 0.05)，但可以看出，添加10 μ Μ時，其受精率高于5 μ Μ和15 μ Μ(見表1)。
[0013] 在幼齡兔體外受精過程中，結合本實驗室前期對精子獲能效果的研究，得出EGCG 最佳添加濃度為10 μ Μ。（注：前期研究已證明添加10 μ Μ濃度EGCG能有效地提高精子獲 能效果）
[0014] 表1不同濃度EGCG對幼齡兔卵母細胞體外受精的影響
[0015]
【權利要求】
1. 一種適用于幼齡兔卵母細胞體外受精方法，其特征在于在BO受精液中添加10 μ Μ EGCG，用于幼齡兔卵母細胞體外受精。
2. -種用于權利要求1所述方法的受精培養液，其特征在于，在B0受精液中添加 10 μ M EGCG，B0 受精液為：NaC16. 5453mg/mL，KC10. 2997mg/mL，NaH2P04 · Η200· 1145mg/mL， MgCl2 · 6Η200· 1057mg/mL，CaCl2 · 2Η200· 330mg/mL，葡萄糖 2. 518mg/mL，0. 2 % 酚紅 4 %， lOOIU/mL 青霉素，lOOIU/mL 鏈霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮酸鈉 0· 1380mg/mL，肝素 20 μ g/mL, BSA20mg/mL。
【文檔編號】C12N5/075GK104232569SQ201410287367
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年6月23日 優先權日:2014年6月23日
【發明者】李擁軍, 張光景, 張佳慧, 楊波, 蔡繆熒 申請人:揚州大學