一種分離純化大鼠肺微血管內皮細胞的方法
【專利摘要】一種大鼠肺組織中分離、純化微血管內皮細胞的方法，其特征在于將胸膜下肺邊緣組織用酶消化處理為單細胞懸液，CD31免疫磁珠分選得到目標細胞。取大乳鼠胸膜下肺邊緣組織，先用膠原酶II和中性蛋白酶混合液消化制備單細胞懸液，然后與CD31免疫磁珠孵育結合，再利用磁珠分選純化系統篩選CD31+細胞，磁珠釋放液去除CD31+細胞結合的磁珠，獲得高純度的大鼠肺微血管內皮細胞。本發明的優點是通過酶消化制備單細胞懸液和CD31免疫磁珠分選，可以從大鼠肺組織中分離提取到高純度的微血管內皮細胞。
【專利說明】一種分離純化大鼠肺微血管內皮細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種從大鼠肺組織中分離提取高純度微血管內皮細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 微血管內皮細胞位于微血管內表面，是營養物質、致病因子、細胞因子和藥物等由 血液循環系統進入血管外組織的必經屏障，功能具有多樣性，是凝血、充血、瘀血、水腫、炎 癥、免疫、腫瘤發生等基本病理變化的關鍵調節點。微血管內皮細胞的體外培養為深入了解 其生物學特性提供了重要途徑，對研究開發保護和治療微血管內皮細胞功能障礙所致疾的 途徑和藥物病具有重要意義。
[0003] 不同組織器官的微血管內皮細胞表型和功能有顯著異質性，某一臟器相關生理病 理機制的研究需要培養相應的微血管內皮細胞。盡管當前已有多種動物心、肺、皮膚、腦等 組織器官微血管內皮細胞體外培養的報道，但由于微血管的管徑小、分散于組織器官內部， 不能直接灌注消化液或有效分離出微血管段，微血管內皮細胞的分離純化技術仍是個難 題，難以避免非微血管內皮細胞的污染。
[0004] 肺微血管內皮細胞的體外培養當前主要采取酶消化法和組織貼塊法，酶消化法易 于短期內獲得大量微血管內皮細胞，但非微血管內皮細胞會均勻混雜其中，單純的手工操 作難以進行純化；組織貼塊法也因組織樣品和處理方法的差異無法確定最佳的去塊時間， 難以避免肺微血管內皮細胞的游出而污染。
[0005] 本發明將酶消化法和免疫磁珠技術相結合，可快速從大鼠肺組織中分離、純化到 高純度的微血管內皮細胞。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種分離培養高純度大鼠肺微血管內皮細胞的方法。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的。
[0008] -種從大鼠肺組織分離培養高純度微血管內皮細胞的方法，其步驟如下。
[0009] A.將大乳鼠斷頸處死，剖開胸腔，右心室灌注Hank' S液，無菌取出肺臟，剔除臟 胸膜，剪取肺邊緣組織，去除大血管，剪碎為小塊；所述右心室灌注Hank' s液于4°C預冷， 灌注至肺臟發白；所述剪碎為小塊的體積約為I mm3。
[0010] B.將所述肺組織小塊用Hank' s液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液為 0. 2%膠原酶！[和0. 1%中性蛋白酶混合溶液，消化溫度為37°C，消化時間為2(T30 min。將 所述消化后的溶液過200目細胞篩，收集濾液離心，沉淀細胞團用0.01 M PBS重懸為單細 胞懸液；所述離心處理，轉速為80(Tl200 rpm，時間為5?10 min;所述0.01 M PBS含有0.1% 牛血清白蛋白、2 mM EDTA;所述的單細胞懸液密度為IX IO7個/mL。
[0011] C.將所述的單細胞懸液中加入⑶31免疫磁珠，孵育得到細胞-抗體-磁珠復合 物。所述的CD31免疫磁珠為CD31單克隆抗體與磁珠孵育結合獲得，溫度為4°C，時間為過 夜，密度為4 X IO8個/mL，每毫升單細胞懸液加⑶31免疫磁珠25 μ L ;所述的孵育處理，置 于旋轉搖床，溫度為15?25 °C，時間為3(T60 min。
[0012] D.將所述的細胞-抗體-磁珠復合物從未結合磁珠和細胞中分離；所述的分離處 理使用KingFisher 96磁珠分選純化系統，程序設置為：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重復4次，細胞-抗體-磁珠復合物釋放于含5%胎牛血清、I mM氯化鈣和4 mM氯化鎂 的DMHM培養基。
[0013] E.將所述的細胞-抗體-磁珠復合物懸浮液中加入釋放緩沖液去除細胞表面結 合的磁珠；所述釋放緩沖液為DNase I溶液，每毫升細胞懸液加4 μ L，溫度為室溫，作用時 間為1〇~20 min ;所述去除磁珠用KingFisher 96磁珠分選純化系統，程序設置為：中速混 合I min，收集2次、每次I s，中速釋放3 s ;重復1次。
[0014] F.將所述去除磁珠的⑶31+細胞離心，用完全培養基重懸，接種孵育培養；所述 的離心處理，轉速為80(Tl200 rpm，時間為5~10 min;所述的完全培養基為DMEM培養基，含 20%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μ g/mL鏈霉素；所述的接種培養細 胞密度為IX IO5個/mL。
[0015] G.所述的接種培養細胞每3天換一次完全培養基，至亞匯合狀態時傳代培養；所 述的傳代培養用含0.05%胰蛋白酶和0.005% EDTA的0.01 M PBS溶液消化脫壁，傳代密度 為 IX IO5 個/mL。
【具體實施方式】
[0016] 實施例一。
[0017] 1.主要實驗材料。
[0018] ( 1)實驗動物：7日齡SD大乳鼠。
[0019] (2) Hank' s 液：購自 GIBCO 公司，貨號 14170-112。
[0020] (3) 0· 01 M PBS :取 NaCl 8. 0 g、Na2HP04 2. 9 g、KH2P04 0· 2 g、KCl 0· 2 g，溶解于 1000 mL超純水中，0. 22 μ m過濾除菌，于4°C冰箱貯存。
[0021] (4)消化液：用0· 01 M PBS配制，含0· 2%膠原酶Π (購自Worthington公司，貨號 LS004176)和0. 1%中性蛋白酶Π (購自Sigma公司，貨號D4693-1G)，0. 22 μπι無菌濾器過 濾除菌。
[0022] (5)完全培養基：DMEM基礎培養基(購自GIBCO公司，貨號11960-044)，含20% 胎牛血清(購自GIBCO公司，貨號10099-141)、2 mM L-谷氨酰胺(購自GIBCO公司，貨號 25030-081 )、1%雙抗溶液（100 IU/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素，購自GIBCO公司，貨號 15140-122)。
[0023] (6)小鼠抗大鼠 CD31單克隆抗體：購自AbD Serotec公司，貨號MCA 1334G，規格 為200 μ 1 (含200 μ g)，每25 μ 1磁珠使用0· 5 μ g抗體。
[0024] (7)小鼠 IgG磁珠試劑盒：包括5 ml密度為4X IO8個/mL包被抗小鼠 IgG的磁 珠，3管釋放緩沖液成分1 (每管為15000~20000 U凍干DNasel)，及2 ml釋放緩沖液成分 2。釋放緩沖液的配制為每管成分1加0. 3ml成分2溶解，分裝凍存，每毫升樣品加4 μ 1。
[0025] (8)樣品緩沖液：用0.01 M PBS配制，含有0. 1%牛血清白蛋白和2 mM EDTA，0. 22 μ m無菌濾器過濾除菌。
[0026] (9)磁珠清洗液：用0.01 M PBS配制，含有0. 1%牛血清白蛋白，0.22 μ m無菌濾 器過濾除菌。
[0027] (10) EDTA-胰蛋白酶溶液：用 0.01 M PBS 配制，含 0.005%。
[0028] 2.操作步驟。
[0029] 7日齡大乳鼠5只，斷頸處死，剖開胸腔，右心室灌注4°C預冷Hank's液至肺臟發 白，無菌取出肺臟，剔除臟胸膜，剪取肺邊緣組織，去除大血管，剪碎為I mm3小塊，Hank's液 漂洗，加入消化液37° C消化20 min，至無成形肺組織小塊。消化液過200目細胞篩，收集濾 液1000 rpm離心10 min，沉淀細胞團用10 ml樣品緩沖液重懸，密度約為I X IO7個/mL。
[0030] 取250 μ 1包被抗小鼠 IgG的磁珠，參照說明書用磁珠清洗液洗滌，重懸于250 μ 1磁珠清洗液，加入5 μ 1小鼠抗大鼠⑶31單克隆抗體，置于旋轉搖床于4° C孵育過夜， 用磁珠清洗液洗去未結合抗體，將結合有CD31抗體的磁珠重懸于250 μ 1磁珠清洗液，力口 入所述的10 ml樣品緩沖液，置于旋轉搖床，于20° C孵育30 min，使細胞與⑶31免疫磁珠 結合為細胞-抗體-磁珠復合物。
[0031] 利用KingFisher 96磁珠分選純化系統將細胞-抗體-磁珠復合物與未結合的細 胞和磁珠分離，程序設置為：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重復4次，細胞-抗體-磁 珠復合物釋放于含5%胎牛血清、I mM氯化鈣和4 mM氯化鎂的DMEM培養基。每I ml毫升 細胞-抗體-磁珠復合物中加入4 μ L釋放緩沖液，室溫孵育15 min，利用KingFisher 96 磁珠分選純化系統除去釋放的磁珠，程序設置為：中速混合I min，收集2次、每次I s，中速 釋放3 s ;重復1次，獲得去除磁珠的⑶31+細胞，1000 rpm離心10 min,沉淀細胞團重懸 于完全培養基重懸，按I X IO5個/mL密度接種培養。
[0032] 接種培養細胞每3天換一次完全培養基，至亞匯合狀態，用EDTA-胰蛋白酶溶液消 化脫壁和傳代，傳代密度為IX IO5個/mL。
[0033] 3.培養結果。
[0034] 原代培養的高純度⑶31+肺微血管內皮細胞在接種7天后生長至匯合狀態，細胞 呈短梭形或多角形，細胞核明顯，匯合后呈典型的"鵝卵石樣"外觀，單層鑲嵌狀排列生長， 見圖1。傳代培養后，5-7天再次生長至匯合狀態，具有良好的生長性能。
[0035] 圖1體外培養生長亞匯合狀態的肺微血管內皮細胞(標尺為200 μ m)
【權利要求】
1. 一種從大鼠肺組織中分離、純化微血管內皮細胞的方法，其特征在于：所述的方法 主要涉及動物肺組織的單細胞懸液的制備和⑶31+細胞的免疫磁珠分選，與傳統肺組織微 血管內皮細胞分離純化方法比較具有純度高的特點。
2. 根據權利要求1所述的一種從動物肺組織中分離、純化微血管內皮細胞的方法，其 特征在于該方法包括以下步驟： A. 將大乳鼠斷頸處死，剖開胸腔，右心室灌注Hank' s液，無菌取出肺臟，剔除臟胸膜， 剪取肺邊緣組織，去除大血管，剪碎為小塊；所述右心室灌注Hank's液于4° C預冷，灌注至 肺臟發白；所述剪碎為小塊的體積約為I mm3 ; B. 將所述肺組織小塊用Hank's液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液為0. 2%膠 原酶II和0. 1%中性蛋白酶混合溶液，消化溫度為37°C，消化時間為2(T30 min ; 將所述消化后的溶液過200目細胞篩，收集濾液離心，沉淀細胞團用0.01 M PBS重懸 為單細胞懸液；所述離心處理，轉速為80(Tl200 rpm，時間為5?10 min;所述0.01 M PBS含 有0. 1%牛血清白蛋白、2 mM EDTA ;所述的單細胞懸液密度為IX IO7個/mL ; C. 將所述的單細胞懸液中加入CD31免疫磁珠，孵育得到細胞-抗體-磁珠復合物； 所述的CD31免疫磁珠為CD31單克隆抗體與磁珠孵育結合獲得，溫度為4° C，時間為過 夜，密度為4 X IO8個/mL，每毫升單細胞懸液加⑶31免疫磁珠25 μ L ;所述的孵育處理，置 于旋轉搖床，溫度為15?25°C，時間為3(T60 min ; D. 將所述的細胞-抗體-磁珠復合物從未結合磁珠和細胞中分離；所述的分離處理使 用KingFisher 96磁珠分選純化系統，程序設置為：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重 復4次，細胞-抗體-磁珠復合物釋放于含5%胎牛血清、I mM氯化鈣和4 mM氯化鎂的DMEM 培養基； E. 將所述的細胞-抗體-磁珠復合物懸浮液中加入釋放緩沖液去除細胞表面結合的 磁珠；所述釋放緩沖液為DNase I溶液，每毫升細胞懸液加4 μ L，溫度為室溫，作用時間為 10~20 min ;所述去除磁珠用KingFisher 96磁珠分選純化系統，程序設置為：中速混合1 min，收集2次、每次I s，中速釋放3 s ;重復1次； F. 將所述去除磁珠的CD31+細胞離心，用完全培養基重懸，接種孵育培養；所述的離 心處理，轉速為80(Tl200 rpm，時間為5~10 min ;所述的完全培養基為DMEM培養基，含20% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μ g/mL鏈霉素；所述的接種培養細胞密 度為I X IO5個/mL ; G. 所述的接種培養細胞每3天換一次完全培養基，至亞匯合狀態時傳代培養；所述的 傳代培養用含〇. 05%胰蛋白酶和0. 005% EDTA的0. 01 M PBS溶液消化脫壁，傳代密度為 lX105f/mL。
【文檔編號】C12N5/071GK104371968SQ201410285772
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年6月25日 優先權日:2014年6月25日
【發明者】張濤, 姜代勛, 穆祥 申請人:北京農學院