一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾rna的方法

一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾rna的方法
【專利摘要】本發明屬于生命科學領域，具體涉及一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法。本發明公開了一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法，反應底物包括乳糖酸或半乳糖衍生物、末端氨基修飾RNAi多核苷酸和EDC，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作為耦合反應的羧基供體和靶向耦合物的半乳糖基供體，末端氨基標記RNAi多核苷酸作為耦合反應的伯氨基供體，EDC作為零長度交聯劑。本發明所公開的方法操作簡便、產率高、活性好，實現了小干擾RNA與肝細胞特異性配基―半乳糖基的共價耦合，耦合物被肝細胞特異性攝取后，表現出針對目標基因的沉默活性。
【專利說明】-種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生命科學領域，具體涉及一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的 方法。

【背景技術】
[0002] RNA干擾（RNAi)為由一類小干擾RNA分子介導的轉錄后基因沉默現象，廣泛應用 于基因功能鑒定和基因治療研究領域。小干擾RNA分子通常是由19?23對堿基構成的雙 鏈結構，分子量13?15kd，攜帶38?40個凈負電荷，因此小干擾RNA裸分子自身無法穿越 負電荷細胞膜，常需要陽性脂質體包裹攜帶轉染細胞。此外，小干擾RNA系統使用時，其生 物分布十分廣泛，在肝、腎、心、脾、腸等多臟器廣泛分布，造成靶組織內RNAi活性不足，補 償性加量后易出現靶外基因沉默、免疫刺激和miRNA競爭抑制等副作用。因此，小干擾RNA 藥物轉化的主要障礙在于缺乏理想的高效細胞靶向轉遞手段。
[0003] 肝臟作為人體的重要代謝器官，易受病毒感染、代謝性疾病、腫瘤等的侵害。提高 小干擾RNA裸分子靶向進入肝細胞是加快RNAi治療肝疾時藥物轉化的關鍵。目前，協助小 干擾RNA肝細胞靶向轉遞媒介物大體可分為病毒載體和非病毒載體兩類。前者轉染效率 高，其靶向性的實現可通過肝細胞特異性啟動子獲得，但免疫排斥反應和基因重組風險限 制其臨床轉化。非載體類靶向轉遞可以借助陽離子復合物（脂質體或多聚體）或化學修飾 等手段，將有肝細胞特異識別能力的配基以共價鍵或非共價鍵的方式與小干擾RNA結合得 以實現。其中，非共價鍵結合是小干擾RNA肝細胞靶向轉遞研究的常見技術。
[0004] 非共價鍵結合小干擾RNA靶向復合物優勢在于方法靈活多樣，不改變小干擾RNA 分子結構，體外研究結果較為理想。如Oishi (2007年）將半乳糖化聚乙二醇和多聚賴氨酸 形成非共價鍵復合體，依靠靜電攜帶小干擾RNA(顆粒直徑llOnm)。體外示蹤表明復合物順 利地轉入了 Huh7細胞。再如，Kim(2007年）將脂質體、膽固醇、載脂蛋白apoA- I靜電結 合小干擾RNA，形成小干擾RNA非共價鍵復合物，體外轉遞肝細胞，其攝取量是無 apoA- I的 3倍。Sato (2007年）利用半乳糖化膽固醇衍生物（C4-chol)與中性脂質體DOPE及小干擾 RNA非共價鍵結合成75. 3 ± 5. 8nm的復合物顆粒，體內實驗表明約80 %的小干擾RNA復合 物分布于肝實質細胞。
[0005] 非共價靶向小干擾RNA復合物不足在于非共價鍵導致結構不穩定，易降解；直徑 過大（> 50nm)，難以通過毛細血管壁，容易被肝Kupffer細胞清除；激活補體系統，易被網 狀內皮系統清除；藥代指標不理想，藥物轉化空間不大。
[0006] 配基與小干擾RNA依靠共價鍵結合后肝細胞轉遞的優勢明顯，形成的耦合物分子 均質，可控性好，容易純化。配基化小干擾RNA單分子直徑小，容易通過肝血竇毛細血管壁， 藥代學指標清晰。如，利用膽固醇主要在肝臟代謝的特點，Lorenz和Soutschek(2004年） 將膽固醇與小干擾RNA正義鏈5'端共價稱合后發現，穩定性明顯提高（半衰期95min，血楽 清除率0. 5mL/min)。雖然其在心、肺、脂肪等多組織器官均有分布，但以肝臟和空腸攝取最 多。再如，Rozema (2007年）以半乳糖胺為配基，將丁基-氨基-乙烯醚聚合物通過側鏈羧 基二甲基酐鍵與聚乙二醇和N-乙酰半乳糖胺共價連接后，與小干擾RNA5'端二硫鍵共價結 合，形成大小為lOmii的單分子化合物。體外轉染證實其具有與陽性脂質體siQUEST相同的 肝細胞轉染效率，可降低目標基因表達80%。體內主要分布在肝細胞，只少量被肝竇非實質 細胞和腎、脾攝取。
[0007] 配基與小干擾RNA共價鍵結合相關技術較少見諸報道，主要障礙在于耦聯反應條 件要求較高，需要設計更為簡便、巧妙的中間橋聯分子。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的是提供一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法，該方法可 以實現小干擾RNA與肝細胞特異性半乳糖配基的共價連接，利用該方法合成的半乳糖化小 干擾RNA耦合物具有不依賴于脂質體的靶向轉遞肝細胞特性。
[0009] 為此，本發明公開了一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法，反應底物 包括乳糖酸或半乳糖衍生物、末端氨基修飾RNAi多核苷酸和1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙 基]碳化二亞胺（EDC)，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作為耦合反應的羧基供體和靶向耦合 物的半乳糖基供體，末端氨基標記RNAi多核苷酸作為耦合反應的伯氨基供體，EDC作為零 長度交聯劑。
[0010] 所述方法包括下列步驟：〇. 05M?0. 1M2-嗎啉乙磺酸鈉（MES)緩沖液pH4. 5中進 行，乳糖酸與末端氨基標記RNAi多核苷酸摩爾比例為1 :1?2000 :1，EDC與乳糖酸摩爾比 例為1 :1?100 :1。
[0011] 在一實施例中，所述方法為25mM乳糖酸、12. 5 μ Μ末端氨基標記RNAi多核苷酸與 0. 1M EDC三者混合于0. 1M MES pH4. 5緩沖液中，短暫振蕩后離心，于25°C反應2h或4°C過 夜，使羧基與伯氨基發生縮合反應，形成半乳糖化RNAi多核苷酸共價耦合物。
[0012] 本發明所公開的方法實現了小干擾RNA與肝細胞特異性配基一一半乳糖基的共價 耦合，在肝細胞膜表面去唾液酸糖蛋白受體介導下，在體外細胞水平表現出不依賴于陽性 脂質體轉染試劑的特異性肝細胞攝取。轉遞后，半乳糖化小干擾RNA耦合物能夠表現出針 對目標基因的沉默活性。基于同樣技術，本發明所建立的肝細胞靶向轉遞小干擾RNA技術 還可用于其它核酸分子的肝細胞靶向轉遞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖 lM:5bp DNA Marker ;1、裸 NH2-siRNA，4yg/100yL;2、半乳糖化小干擾 RNA， 1. 5 μ g/100 μ L
[0014] 圖2Huh7肝細胞攝取半乳糖化小干擾RNA共價耦合物
[0015] 半乳糖化小干擾 RNA濃度分別為 1 :0μΜ;2 :1μΜ;3 :2μΜ;4:4μΜ;5 :0. 2μΜ 的 裸 siRNA 和 X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent ;Α :Huh7 細胞，Β :MDA 細胞。

【具體實施方式】
[0016] 術語"RNA干擾（RNAi)多核苷酸"是能誘導RNA干擾的分子，其通過與哺乳動物細 胞的RNA干擾通路組成部分相互作用以序列特異方式降解或抑制轉基因的信使RNA(mRNA) 轉錄本翻譯。兩種主要RNAi多核苷酸是小（或短）干擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)。RNAi 多核苷酸可選自下組：siRNA、微RNA、雙鏈RNA (dsRNA)、短發夾RNA (shRNA)和編碼能誘導 RNA干擾的表達盒。siRNA包括的雙鏈結構通常含15-50個堿基對，優選21-25個堿基對，并 具有與細胞內所表達靶基因或RNA中編碼序列相同（完美互補的）或幾乎相同（部分互補 的）的核苷酸序列。siRNA還具有3'雙核苷酸突出。siRNA可由形成發夾結構的兩個退火 多核苷酸或單核苷酸組成。本發明的siRNA分子包含有義區域和反義區域。在一個實施方 式中，偶聯物的siRNA從兩種寡核苷酸片段中組裝，其中一種片段包含所述siRNA分子反義 鏈的核苷酸序列，且第二片段包含所述siRNA分子有義鏈的核苷酸序列。在另一實施方式 中，有義鏈通過接頭分子如多核苷酸接頭或非核苷酸接頭連接反義鏈。微RNA(miRNA)是約 22個核苷酸長度的非編碼小RNA基因產物，指導其mRNA靶標的破壞或翻譯抑制。若miRNA 和靶mRNA之間是部分互補，則所述靶mRNA的翻譯被抑制。若廣泛互補，則所述靶mRNA被切 害I]。對于miRNA，所述復合物結合通常位于mRNA3 ! UTR的靶位點，其通常僅與所述miRNA 部分同源。"種子區域"為miRNA5'末端的一段約七（7)個連續核苷酸，與其靶標形成完美 堿基配對-在miRNA特異性中起關鍵作用。RISC/miRNA復合物與mRNA的結合可導致蛋白 翻譯抑制或mRNA的切割和降解。近期數據表明若沿著全長miRNA和其靶標有完美同源性 而不是僅在種子區域顯示完美堿基配對，則mRNA切割優選發生（Pillai等，2007)。
[0017] RNAi多核苷酸表達盒可在細胞中轉錄產生小發夾RNA，其能作為siRNA、分離的有 義和反義鏈線性siRNA或miRNA行使功能。RNA聚合酶III轉錄的DNA含有選自下表的啟 動子：U6啟動子、H1啟動子和tRNA啟動子。RNA聚合酶II啟動子包括U1、U2、U4和U5啟 動子、snRNA啟動子、微RNA啟動子和mRNA啟動子。
[0018] 已知miRNA序列的列表可在研究組織維護的數據庫中找到，如維爾康姆基金會 桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute)、賓州生物信息中心（Penn Center forBioinformatics)、斯隆凱特林癌癥紀念紀念中心（Memorial Sloan Kettering CancerCenter)和歐洲分子生物實驗室等。已知的有效siRNA序列和關聯結合位點也在相 關文獻中充分記述。RNAi分子容易用本領域已知的技術設計和生產。此外，計算工具可 用于增加發現有效和特異性序列基序的可能性（Pei等2006, Reynolds等2004, Khvorova 等 2003, Schwarz 等 2003, Ul-Tei 等 2004, Heale 等 2005, Chalk 等 2004, Amarzguioui 等 2004)。
[0019] 本發明的RNAi多核苷酸可被化學修飾。該化學修飾的非限制性示例包括：硫代 磷酸酯核苷酸間連接、2' -0-甲基核糖核苷酸、2' -脫氧-2' -氟核糖核苷酸、2' -脫氧核糖核 苷酸、"通用堿基"核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和倒置脫氧脫堿基殘基摻入。用于各種多核苷 酸結構時，這些化學修飾顯示在細胞中保持多核苷酸活性，同時增加這些化合物的血清穩 定性。化學修飾的siRNA還可使人中干擾素活性激活的可能性最小化。
[0020] 在一個實施方式中，本發明的化學修飾RNAi多核苷酸包括具有兩條鏈的雙鏈體， 其一或二者可化學修飾，其中各鏈為約19?約29核苷酸。在一個實施方式中，本發明的 RNAi多核苷酸包括一種或多種修飾的核苷酸，同時保持在細胞內介導RNAi或在體外系統 中重建的能力。RNAi多核苷酸可經修飾，其中化學修飾包括一個或多個（例如約1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10或更多）核苷酸。本發明的RNAi多核苷酸可包括修飾的核苷酸，其占 RNAi多 核苷酸中所存在核苷酸總數的某一百分比。同樣，本發明的RNAi多核苷酸通常可在約5? 約 100% (如 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或100 %的核苷酸位置）的核苷酸位置上包括修飾的核 苷酸。給定RNAi多核苷酸中存在的修飾核苷酸的實際百分比取決于所述RNAi多核苷酸中 存在的核苷酸總數。若RNAi多核苷酸是單鏈，則修飾百分比可基于單鏈RNAi多核苷酸中存 在的核苷酸總數。同樣，若RNAi多核苷酸是雙鏈，則修飾百分比可基于有義鏈、反義鏈或有 義和反義鏈二者中存在的核苷酸總數。此外，給定RNAi多核苷酸中存在的修飾核苷酸的實 際百分比還可取決于所述RNAi多核苷酸中存在的嘌呤和嘧啶核苷酸總數。例如，其中RNAi 多核苷酸中存在的所有嘧啶核苷酸和/或所有嘌呤核苷酸經過修飾。
[0021] RNAi多核苷酸調控基因編碼的RNA表達。由于多種基因可彼此共有一定程度的序 列同源性，所以RNAi多核苷酸可設計為靶向具有足夠序列同源性的一類基因。因此，RNAi 多核苷酸可包括與不同基因靶標之間共有或對特異基因靶標獨特的序列互補的序列。因 此，RNAi多核苷酸可設計為靶向具有數種基因之間同源性的RNA序列的保守區域，從而靶 向基因家族中的數種基因（如不同基因同種型、剪接變體、突變基因等）。在另一實施方式 中，RNAi多核苷酸可設計為靶向對單一基因中特異RNA序列獨特的序列。
[0022] 術語"互補"指多核苷酸與另一多核苷酸序列通過常規沃森克里克或其他非常規 類型形成氫鍵的能力。涉及本發明的多核苷酸分子時，多核苷酸分子與其靶標（有效結合 位點）或互補序列的結合游離能量足以推進所述多核苷酸的相關功能，如酶的mRNA切割或 翻譯抑制。核酸分子結合游離能量的測定為本領域熟知（Frier等1986, Turner等1987)。 互補百分比表示第一多核苷酸分子中毗連鏈的堿基百分比，所述分子可與第二多核苷酸序 列形成沃森-克里克堿基配對。完美互補表示多核苷酸序列的毗連鏈中所有堿基與第二多 核苷酸序列中相同數量的連續堿基形成氫鍵。
[0023] 抑制、下調或敲減基因表達表示如用所述基因轉錄的RNA水平或從所述RNA翻譯 的多肽、蛋白或蛋白亞基水平所測量，所述基因的表達低于沒有阻斷本發明多核苷酸偶聯 物時觀察到的水平。用本發明組合物所遞送多核苷酸進行的基因表達抑制、下調或敲減，優 選低于存在對照失活核酸（序列雜亂的核酸或鈍化錯配的核酸）時或所述多核苷酸未偶聯 掩蔽聚合物時觀察到的水平。
[0024] RNAi多核苷酸偶聯物
[0025] RNAi多核苷酸偶聯物提供了改良的RNAi多核苷酸體內遞送。功能性遞送表示所 述RNAi多核苷酸遞送到細胞并預期具有生物學活性、基因表達的序列特異性抑制。給予哺 乳動物脈管系統的許多分子（包括多核苷酸）通常由肝臟從身體中清除。肝臟對多核苷酸 的清除中所述多核苷酸發生降解或另外加工以從身體中去除且其中所述多核苷酸沒有引 起基因表達的序列特異性抑制，所述清除不視作功能性遞送。
[0026] 通過共價連接所述RNAi多核苷酸和所述靶向配體部分形成RNAi多核苷酸偶聯 物。可以合成或修飾所述多核苷酸使其含有反應基團A。可以合成或修飾所述靶向部分使 其含有反應基團B。選擇反應基團A和B，從而其能用本領域已知的方法通過共價鍵而連接。
[0027] 所述靶向部分連接所述RNAi多核苷酸的3'末端。對于siRNA多核苷酸，所述靶 向部分可連接有義鏈或反義鏈，盡管優選有義鏈。在一些實施方式中，所述siRNA通過含有 反應基團A(例如伯胺基團）的短烷基鏈連所述接靶向部分。然后，反應基團A偶聯靶向部 分上的反應基團B (例如羧基基團）。
[0028] 為了靶向肝內的肝細胞，優選的靶向配體是半乳糖簇。半乳糖簇包含具有2?4 種末端半乳糖衍生物的分子。如本文所用，術語半乳糖衍生物包括半乳糖和對去唾液酸糖 蛋白受體的親和性等于或超過半乳糖的半乳糖衍生物。末端半乳糖衍生物通過其C-1碳連 接分子。去唾液酸糖蛋白受體（ASGPr)對肝細胞獨特并結合分支的半乳糖末端糖蛋白。優 選的半乳糖簇具有各自對去唾液酸糖蛋白受體具有親和性的3種末端半乳糖胺或半乳糖 胺衍生物。更優選的半乳糖簇具有3種末端N-乙酰-半乳糖胺。本領域其他常見術語包 括三觸角型（trl-antennary)半乳糖、三價半乳糖和半乳糖三聚體。已知三觸角型半乳糖 衍生物簇以比二觸角型或單觸角型半乳糖衍生物結構更強的親和性結合ASGPr (Baenziger 和 Fiete, 1980, Cell, 22,611-620 ;ConnoIIy 等，1982, J. Biol. Chem.，257,939-945)。需要 多價以獲得nM親和性。與遞送聚合物共給予時，提高單半乳糖衍生物濃度可以模擬出多觸 角型半乳糖衍生物的受體親和活性。
[0029] 半乳糖簇含各自連接中央分支點的三種半乳糖衍生物。所述半乳糖衍生物通 過所述糖的C-1碳結合中央分支點。半乳糖衍生物優選通過接頭或間隔子連接所述 分支點。優選的間隔子是靈活的親水間隔子（美國專利5885968 ;BieSSen等J. Med. Chem. 1995Vol. 39 P . 1538-1546)。優選的靈活親水間隔子是PEG間隔子。優選的PEG間隔 子是PEG3間隔子。分支點可為任何小分子，其允許所述三種半乳糖衍生物結合，還允許所 述分支點結合RNAi多核苷酸。示例性分支點基團是二賴氨酸。二賴氨酸分子含三種胺基 (可通過其結合三種半乳糖衍生物）和羧基反應基團（二賴氨酸可通過其結合RNAi多核 苷酸）。分支點與RNAi多核苷酸的結合可通過接頭或間隔子發生。優選的間隔子是靈活 的親水間隔子。優選的靈活親水間隔子是PEG間隔子。優選的PEG間隔子是PEG3間隔子 (三個乙烯單元）。所述半乳糖簇還可用本領域已知方法連接所述RNAi多核苷酸的3'或 5'末端。對于具有2條鏈的RNAi多核苷酸，例如siRNA，所述半乳糖簇可連接除反義鏈5' 末端的其余任意末端。
[0030] 優選的半乳糖衍生物是N-乙酰-半乳糖胺（GalNAc)。對去唾液酸糖蛋白受體具 有親和性的其他糖可選自含有以下的列表：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰 基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-異丁酰基半乳糖胺。已研究 大量半乳糖衍生物對去唾液酸糖蛋白受體的親和性（參見例如：lbst，S. T.和Drickamer， K.J.B.C. 1996, 271，6686)或其易用本領域一般方法確定。
[0031] 體內給藥方式
[0032] 藥理學和毒理學中，給藥途徑是使藥物、液體、毒劑或其他物質接觸身體的途徑。 通常，用于治療哺乳動物的藥物和核酸給予方法為本領域熟知，且可用于給予本發明組合 物。本發明化合物可通過任何合適途徑在根據所述途徑適當調整的制劑中應用，最優選腸 胃外。因此，可通過注射，例如靜脈內、肌內、皮內、皮下或腹膜內注射給予本發明化合物。因 此，本發明還提供含有藥學上可接受載體或賦形劑的藥物組合物。
[0033] 給予的腸胃外途徑包括脈管內（靜脈內、動脈內）、肌肉內、實質內、皮內、真皮下 (subdermal)、皮下（subcutaneous)、腫瘤內、腹膜內、鞘內、硬膜下、硬膜外和淋巴內注射， 使用注射器和針或導管。本文所述脈管內表示稱為脈管的管狀結構內，其連接體內的組織 或器官。所述管狀結構的腔內，體液流向或流自身體部分。體液的示例包括血液、腦脊液 (CSF)、淋巴液或膽汁。脈管的示例包括冠狀動脈、細動脈、毛細管、小靜脈、竇狀小管、靜脈、 淋巴管、膽管和唾液腺管或其他外分泌腺管。脈管內途徑包括通過諸如動脈或靜脈等血管 的遞送。血液循環系統提供藥物的全身擴散。
[0034] 所述RNAi多核苷酸靶向部分偶聯物在藥學上可接受載體溶液中注射。藥學上可 接受指藥理學/毒理學角度上哺乳動物可以接受的那些特性和/或物質。短語藥學上可接 受指給予哺乳動物時生理上可耐受且通常不產生過敏或其他不利或毒性反應的分子實體、 組合物和特性。本文所用術語"藥學上可接受"優選指被SFDA批準，或中國藥典或其它公 認藥典所列用于動物應用，更具體用于人。
[0035] 治療效果
[0036] RNAi多核苷酸靶向部分偶聯物用于研究目的或用于在治療細胞中產生變化。RNAi 多核苷酸靶向部分偶聯物用于研究試劑和各種治療、診斷、靶標確認、基因組開發、基因工 程改造和藥物基因組應用。
[0037] 肝臟是基因治療最重要的靶組織，因為其在代謝（如各種血膽脂醇過多中的脂蛋 白代謝）和循環蛋白（如血友病中的凝結因子）分泌中起關鍵作用。此外，常見獲得性疾 病如慢性肝炎和硬化且也可能用基于多核苷酸的肝臟療法治療。影響或被肝臟影響的許多 疾病或病癥可通過敲減（抑制）肝臟中基因表達來治療。該肝臟疾病和病癥可選自含有以 下的列表：肝癌（包括肝細胞癌，HCC)、病毒感染（包括肝炎）、代謝紊亂（包括高脂血癥 和糖尿病）、纖維癥和急性肝損傷。
[0038] 待給予的RNAi多核苷酸偶聯物的量（劑量）可憑經驗確定。用0. 1?10mg/kg動 物體重的siRNA-偶聯物和5?60mg/kg動物體重的遞送聚合物能有效敲減基因表達。小 鼠中的優選量為〇. 25?2. 5mg/kg siRNA-偶聯物。RNAi多核苷酸偶聯物的量容易提高，因 為其通常在大劑量下無毒。
[0039] 本發明選擇人磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH)基因為目標，觀察半乳糖化小干擾RNA 共價耦合物對肝細胞株Huh7的靶向轉遞能力，以及針對目標基因的RNAi沉默效應。下面 結合附圖和實施例對本發明作進一步描述。
[0040] 實施例1乳糖酸與末端氨基標記小干擾RNA耦合反應
[0041] 配制SI :0. 4M EDC于0. 2M MES緩沖液，pH4. 5，-20°C保存，使用前平衡至室溫；配 制S2 :0. 1M乳糖酸溶液于0. 2M MES緩沖液pH4. 5，-20°C保存，使用前平衡至室溫；配制S3 : 20D末端氨基標記小干擾RNA (6nmol，80 μ g)溶于DEPC處理的Rnase滅活水中，-80°C保存， 使用前平衡至室溫。1〇〇 □ μ 1 S1、100 □ μ 1 S2與200 □ μ 1 S3混合，稍離心，各組分于 400 □ μ 1反應總體積中的終濃度分別為0. 1Μ EDC，25mM乳糖酸，12. 5 □ μ Μ末端氨基標 記小干擾 RNA (正義鏈：guaugacaacagccucaagt_NH2 ;反義鏈：cuugaggcuguugucauactt),反 應體系為〇. 1M MES緩沖液，pH4. 5。反應液于25°C反應2h。用miRNAOUT柱脫鹽，重回收總 小干擾RNA。半乳糖化小干擾RNA共價耦合物連接產物經脫鹽處理后，行長距離20 %聚丙 烯酰胺凝膠電泳鑒定。圖1顯示，泳道1之RNA分子量較泳道2氨基標記小干擾RNA多出 約1個堿基大小，表明半乳糖化小干擾RNA共價耦合物正確合成。
[0042] 相較于文獻報道，本發明所合成的半乳糖化小干擾RNA耦合物采用一步法完成， 得率高（>90% )，見表1。小干擾RNA正義鏈3'端連接半乳糖配基導致該端解鏈溫度降低， 根據Schwarz法則，其干擾活性得到提高。
[0043] 表1三種糖氨耦合反應比較
[0044]

【權利要求】
1. 一種用于制備肝細胞靶向轉遞小干擾RNA的方法，反應底物包括乳糖酸或半乳糖衍 生物、末端氨基修飾RNAi多核苷酸和EDC，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作為耦合反應的羧 基供體和靶向耦合物的半乳糖基供體，末端氨基標記RNAi多核苷酸作為耦合反應的伯氨 基供體，EDC作為零長度交聯劑。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法在0. 05M?0. 1M MES緩沖液pH4. 5 中進行，乳糖酸與末端氨基標記RNAi多核苷酸摩爾比例為1 : 1?2000 : 1，EDC與乳糖 酸摩爾比例為1 : 1?100 : 1。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法為25mM乳糖酸、12. 5 μ Μ末端氨基 標記RNAi多核苷酸與0. 1Μ EDC三者混合于0. 1Μ MES ρΗ4. 5緩沖液中，短暫振蕩后離心， 于25°C反應2h或4°C過夜，使羧基與伯氨基發生縮合反應，形成半乳糖化RNAi多核苷酸共 價耦合物。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述RNAi多核苷酸為siRNA、微RNA、雙鏈 RNA、短發夾RNA或編碼能誘導RNA干擾的表達盒。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述RNAi多核苷酸可被化學修飾，該化學修 飾包括：硫代磷酸酯核苷酸間連接、2' -0-甲基核糖核苷酸、2' -脫氧-2' -氟核糖核苷酸、 2' -脫氧核糖核苷酸、5-C-甲基核苷酸、或倒置脫氧脫堿基殘基摻入。
【文檔編號】C12N15/113GK104087574SQ201410283413
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月23日 優先權日:2014年6月23日
【發明者】武文斌, 巴劍波, 陳雙紅, 郝蕙玲, 孫錦程, 徐雄利, 呂鴻雁 申請人:中國人民解放軍海軍醫學研究所