一種鑒別半夏品種資源的方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑒別半夏品種資源的方法，包括基因組DNA提取、PCR擴增18SrDNA序列和序列測定與分析的步驟，其中半夏基因組DNA的提取采用將一定量待測半夏樣品的新鮮葉片組織放入離心管中，再加入溫水預熱后的適當體積配比的SDS與CTAB混合抽提液，混搖5min，用移液槍的槍頭伸入上述離心管底部，緩慢順時針旋轉挑取絲狀粘稠物質，獲得基因組DNA，然后采用植物18SPCR引物18SF和18SR進行18SrDNA序列PCR擴增，隨后測序，在NCBI的GenBank數據庫中比對分析，從而判斷其進化關系與種屬來源。本發明的方法快速有效、簡單便捷、可操作性強，能夠準確鑒定半夏種屬來源，確定道地半夏藥材資源，為保護半夏種質多樣性奠定理論基礎，具有較大的應用價值。
【專利說明】一種鑒別半夏品種資源的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物【技術領域】，涉及中藥材半夏通過分子生物學鑒定確定其品種資源的方法。
【背景技術】
[0002]半夏屬天南星科草本植物，其塊莖入藥，是我國大宗傳統中藥材之一，用藥歷史悠久。據報道，半夏具有降逆去燥、止咳化痰、抗腫瘤、抗早孕等多種藥理作用。近年來，市場對半夏需求的不斷加大，野生半夏資源的馴化和人工栽培應運而生。由于半夏繁殖率低，人工種植的半夏主產區種子供不應求，使得各地藥農不得不到外地引種，種質資源交流頻繁，造成道地藥材資源消失殆盡。
[0003]半夏的生產正如許多中藥材一樣，種莖的特性千差萬別，有的是不同物種(如掌葉半夏和水半夏)，它們屬于偽品，不符合現代藥材深加工對原材料的要求，對實施現代化中成藥生產極為不利。品種混雜，品質不均是目前半夏產業面臨的主要問題。然而，迄今為止，還沒有成熟的鑒別半夏品種資源的技術方法。
【發明內容】
[0004]針對現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種半夏品種資源的鑒定方法，該方法快速有效、簡單便捷、可操作性強，能夠準確鑒定半夏種屬來源。
[0005]具體來說，本發明所采用的技術方案如下:
一種鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
(1)半夏基因組DNA的提取:選取一定量的待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入離心管中；按每克葉片組織2000 μ L的比例加入溫水預熱后的適當體積配比的SDS與CTAB混合抽提液，混搖5min ;用移液槍的槍頭伸入上述離心管底部，緩慢順時針旋轉挑取絲狀粘稠物質，獲得基因組DNA，將其溶于水中；取溶解后溶液適量，進行1%_2%瓊脂糖電泳檢測；
(2)18SrDNA序列PCR擴增:將上述所得DNA溶液稀釋50-100倍；準備植物18SPCR引物18SF和18SR ;如下建立PCR擴增體系共50-100 μ L:水20-500 μ L,緩沖液1-5 μ L, 18SF引物1-5μ L，18SR引物1-5 μ L，上述稀釋后的DNA溶液作為模板1-5 μ L, dNTP 1_5μ L，MgC121-5 μ L，rTaq酶1-5 μ L ;將上述體系中的材料依次加入PCR管中，放入PCR儀中，設置PCR反應條件，開始反應，反應結束后，得到所需的18SrDNA序列；
(3)序列測定與分析:將上述所得的序列進行測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數據庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的ISSrDNA序列，運用分子信息分析軟件對所得半夏樣品ISSrDNA序列和網上報道的序列進行比對分析，從而判斷其進化關系與種屬來源。
[0006]優選地，步驟(1)的SDS與CTAB混合抽提液中SDS與CTAB的體積配比為1_10:1，更優選為2:1或3:1或4:1。
[0007]優選地，步驟(1)的“溫水預熱”是指在30-100°C的水溫下預熱Ι-lOOmin，更優選為在60-70°C的水溫下預熱30-40min。
[0008]優選地，步驟(2)的“引物18SF”的序列是指5' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3';“引物 18SR” 的序列是指 5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
[0009]優選地，步驟(2)的PCR反應條件是指每個循環條件如下:94°C:l_5min ；55°C:IO-1OOs ；72°C:l-10min ;共 10-100 個循環。
[0010]優選地，步驟(3)的“天南星科半夏屬植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌葉半夏(P.pedatisecta)、盾葉半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鷂落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂葉半夏(P.tripartita)。
[0011]有益效果:本發明的方法具有快速有效、簡單便捷、可操作性強等優點，能夠準確鑒定半夏種屬來源，對指導藥農種植《中國藥典》規定的半夏類藥材具有重要意義。此外，通過確定道地半夏藥材資源，為保護半夏種質多樣性奠定理論基礎，具有較大的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是實施例1中所鑒別的兩種湖北荊州半夏的型態特征。
[0013]圖2是實施例2中所鑒別的兩種南京半夏的型態特征。
【具體實施方式】
[0014]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種半夏品種資源的鑒定方法，從而準確鑒定半夏種屬來源，指導藥農種植《中國藥典》規定的半夏類藥材。
[0015]在一個實施方案中，本發明提供的方法可以如下實施:
(O半夏基因組DNA的提取:選取0.5g待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入商用EP管(規格1.5mL或2mL)中；加入溫水預熱后的適當體積配比的SDS與CTAB混合抽提液1000 μ L，混搖5min ;用移液槍的槍頭(規格200 μ L或1000 μ L)伸入上述EP管底部，緩慢順時針旋轉挑取絲狀粘稠物質，即所得基因組DNA，將其溶于50 μ L純水中；取溶解后溶液3-5 UL,進行1%-2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0016](2) 18SrDNA序列PCR擴增:將上述所得DNA溶液稀釋50-100倍；準備植物18SPCR引物18SF和18SR ;建立PCR擴增體系共50-100 μ L，如下:純水20-500 μ L，商用緩沖液l_5yL，18SF引物l_5yL，18SR引物1-5 μ L，上述稀釋后的DNA溶液作為模板1-5 μ L，商用dNTP 1-5 μ L,商用MgC12 1-5 μ L,商用rTaq酶1_5 μ L ;將上述體系中的材料依次加入商用PCR管(規格0.2mL或0.5mL)中，放入PCR儀中，設置PCR反應條件，開始反應。反應結束后，得到所需的18S rDNA序列。
[0017](3)序列測定與分析:將上述所得的序列送至測序公司測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數據庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的18SrDNA序列，運用MEGA等分子信息分析軟件對所得半夏樣品18S rDNA序列和網上報道的序列進行比對分析，從而判斷其進化關系與種屬來源。
[0018]所述步驟(1)的“SDS與CTAB混合抽提液”是指SDS與CTAB的體積配比為1_10:
I;優選2:1或3:1或4:1。所述步驟(1)的“溫水”是指30-100°C的水溫，優選60-70°C。所述步驟(1)的“預熱”時間為Ι-lOOmin,優選30_40min。[0019]所述步驟(2)的“引物18SF”的序列是指5' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3';所述步驟(2)的“引物 18SR” 的序列是指 5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
[0020]所述步驟(2)的“設置PCR反應條件”是指每個循環條件如下:94°C:l-5min ；55°C:IO-1OOs ；72°C:l-10min ;共 10-100 個循環。
[0021]所述步驟(3)的“天南星科半夏屬植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌葉半夏(P.pedatisecta)、盾葉半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鷂落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂葉半夏(P.tripartita)。
[0022]本發明的方法具有快速有效、簡單便捷、可操作性強等優點，能夠準確鑒定半夏種屬來源，對指導藥農種植《中國藥典》規定的半夏類藥材具有重要意義。此外，通過確定道地半夏藥材資源，為保護半夏種質多樣性奠定理論基礎，具有較大的應用價值。
[0023]下面將結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作進一步的描述。
[0024]實施例1:
選取兩種湖北荊州地區的半夏HBB-01和HBD-02，如圖1。分別取0.5g兩種待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入商用EP管(規格1.5mL)中；加入65°C溫水預熱后的體積配比為
2:1的SDS與CTAB混合抽提液1000 μ L，混搖5min ;用移液槍的槍頭(規格200 μ L)伸入上述EP管底部，緩慢順時針旋轉挑取絲狀粘稠物質，即所得基因組DNA，將其溶于50 μ L純水中；取溶解后溶液3 μ L，進行1%瓊脂糖電泳檢測。建立PCR擴增體系共50 μ L，如下:純水35 μ L，商用緩沖液5 μ L，18SF引物I μ L，18SR引物I μ L，上述所得DNA溶液稀釋100倍作為模板2 μ L,商用dNTP 4 μ L,商用MgC12 1.5 μ L,商用rTaq酶0.5μ L。將上述體系中的材料依次加入商用PCR管(規格0.2mL)中，放入PCR儀中，設置PCR反應條件，每個循環條件如下:94°C:4min ；55°C:30s ；72°C:2min ;共35個循環，進行反應。反應結束后，得到所需的ISSrDNA序列片段。將上述所得的序列送至測序公司測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數據庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的18SrDNA序列,運用MEGA等分子信息分析軟件對所得半夏樣品ISSrDNA序列和網上報道的序列進行比對分析，得出如下結論:HBB_01為半夏(Pinellia ternata),為《中國藥典》中規定的半夏類藥材品種；HBD-02為三裂葉半夏(P.tripartita)，為藥用半夏的混淆品。
[0025]實施例2:
選取兩種江蘇南京地區的半夏NJ-01和NJ-02，如圖2。分別取0.5g兩種待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入商用EP管(規格1.5mL)中；加入65°C溫水預熱后的體積配比為
3:1的SDS與CTAB混合抽提液1000 μ L，混搖5min ;用移液槍的槍頭(規格200 μ L)伸入上述EP管底部，緩慢順時針旋轉挑取絲狀粘稠物質，即所得基因組DNA，將其溶于50 μ L純水中；取溶解后溶液3 μ L，進行1%瓊脂糖電泳檢測。建立PCR擴增體系共100 μ L，如下:純水60 μ L，商用緩沖液10 μ L，18SF引物5 μ L，18SR引物5 μ L，上述所得DNA溶液稀釋100倍作為模板5 μ L,商用dNTP 10 μ L,商用MgC12 3 μ L,商用rTaq酶2μ L。將上述體系中的材料依次加入商用PCR管(規格0.2mL)中，放入PCR儀中，設置PCR反應條件，每個循環條件如下:94°C:4min ；55°C:30s ；72°C:2min ;共35個循環，進行反應。反應結束后，得到所需的ISSrDNA序列片段。將上述所得的序列送至測序公司測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數據庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的18SrDNA序列，運用MEGA等分子信息分析軟件對所得半夏樣品ISSrDNA序列和網上報道的序列進行比對分析，得出如下結論:NJ-01為半夏(Pinellia ternata),為《中國藥典》中規定的半夏類藥材品種；NJ_02為掌葉半夏(P.pedatisecta)，為藥用半夏的偽品。
[0026]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
[0027]上面結合附圖和具體實施例對本發明的實施方式作了詳細的說明，但是本發明不限于上述實施方式，在所屬【技術領域】普通技術人員所具備的知識范圍內，還可以在不脫離本發明宗旨的前提下做出各種變化。
【權利要求】
1.一種鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)半夏基因組DNA的提取:選取一定量的待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入離心管中；按每克葉片組織2000 μ L的比例加入溫水預熱后的適當體積配比的SDS與CTAB混合抽提液，混搖5min ;用移液槍的槍頭伸入上述離心管底部，緩慢順時針旋轉挑取絲狀粘稠物質，獲得基因組DNA，將其溶于水中；取溶解后溶液適量，進行1%_2%瓊脂糖電泳檢測； (2)18SrDNA序列PCR擴增:將上述所得DNA溶液稀釋50-100倍；準備植物18SPCR引物18SF和18SR ;如下建立PCR擴增體系共50-100 μ L:水20-500 μ L,緩沖液1-5 μ L, 18SF引物l-5yL，18SR引物1-5 μ L，上述稀釋后的DNA溶液作為模板1-5μ L,dNTP 1-5μ L,MgC121-5 μ L，rTaq酶1-5 μ L ;將上述體系中的材料依次加入PCR管中，放入PCR儀中，設置PCR反應條件，開始反應，反應結束后，得到所需的18SrDNA序列； (3)序列測定與分析:將上述所得的序列進行測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數據庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的ISSrDNA序列，運用分子信息分析軟件對所得半夏樣品ISSrDNA序列和網上報道的序列進行比對分析，從而判斷其進化關系與種屬來源。
2.根據權利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(1)的SDS與CTAB混合抽提液中SDS與CTAB的體積配比為1_10:1。
3.根據權利要求2所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(1)的SDS與CTAB混合抽提液中SDS與CTAB的體積配比為2:1或3:1或4:1。
4.根據權利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(1)的“溫水預熱”是指在30-100°C的水溫下預熱l-100min。
5.根據權利要求4所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(1)的“溫水預熱”是指在60-70°C的水溫下預熱30-40min。
6.根據權利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(2)的“引物18SF”的序列是指5 ' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3 ';“引物18SR”的序列是指5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
7.根據權利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(2)的PCR反應條件是指每個循環條件如下:94°C:l-5min ；55°C:10-100s ；72°C =1-1Omin ;共10-100個循環。
8.根據權利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(3)的“天南星科半夏屬植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌葉半夏(P.pedatisecta)、盾葉半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鷂落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂葉半夏(P.tripartita)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017892SQ201410280668
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月23日 優先權日:2014年6月23日
【發明者】張文濤, 陳集雙, 喻靜, 蔣海俠, 宋蓮, 張本厚 申請人:南京工業大學大豐海洋產業研究院