一種具有抗癌活性的黑根霉多糖及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種具有抑制BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖及其應用，一株具有產抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖的黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9，該菌株于2013年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC?NO.8436。本發明還提供黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9在制備具有抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖中的應用。本發明所述黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9具有產抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖的功能。
【專利說明】一種具有抗癌活性的黑根霉多糖及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種具有抑制BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖及其應用，屬于生物醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]隨著世界總人口持續增長和人口老齡化的加劇，以及逐年增多的患癌高危行為，使得全球癌癥患者數量急劇增加。據美國癌癥協會(ACS)統計數據顯示，2008年全球約有760萬癌癥患者死亡，其中胃癌死亡病例達74萬，中國每年約有23萬人死于胃癌。不合理飲食和幽門螺旋桿菌感染是導致胃癌的重要原因。在我國山東省臨朐縣、遼寧省莊河縣、福建省長樂縣最具代表性的胃癌高發地區。
[0003]大部分胃癌患者在確診時已處于晚期階段并往往伴發多種疾病，使得胃癌的治愈尤為困難。手術合并化學療法是胃癌治療的主要手段，但是化療藥物會導致嚴重的副作用，迫切需要尋找高效、低毒的新型腫瘤治療藥物。
[0004]多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的多羥基聚合物及其衍生物。天然功能性多糖作為一類重要的生物活性物質，具有抗腫瘤、免疫調節、抗病毒、抗氧化等多種功能。天然活性多糖的細胞毒性小、免疫原性極低、安全性高，是開發癌癥治療藥物的重要來源。 目前，已有多種抗腫瘤輔助多糖藥物作為輔助治療腫瘤的藥物在臨床應用，如香菇多糖、云芝多糖等。
[0005]1969年Chiharals首次發表關于真菌多糖的抗腫瘤的研究結果后，多種具有免疫調節、抗腫瘤等活性的多糖被陸續發現。多糖是重要的生物效應調節劑(BiologicalResponse Modifier, BRM),主要通過激活機體的淋巴細胞,提高免疫系統響應能力，間接的發揮抗腫瘤作用。然而越來越多的研究發現，一些真菌多糖可以在體外直接抑制腫瘤細胞增殖，甚至殺死腫瘤細胞。這些多糖通過引起細胞應激，調控腫瘤細胞中信號分子的表達，改變細胞膜特性，誘導細胞凋亡、周期阻滯和自噬。
[0006]多糖對腫瘤細胞有廣泛的影響，若干多糖通過改變腫瘤細胞膜的生化特性來殺死腫瘤細胞，此作用主要與唾液酸與磷脂轉換有關。唾液酸主要位于細胞表面糖蛋白和糖脂的聚糖鏈末端。唾液酸增多可影響細胞表面電荷特性、抗原決定簇的暴露、膜的物質轉運過程、膜表面受體功能等。茯苓多糖作用于S180和K562細胞后，可升高腫瘤細胞膜上的唾液酸含量，干擾細胞膜的肌醇磷脂代謝和磷脂酰肌醇轉換，抑制細胞生長。虎奶菇菌核中分離出的水溶性羧甲基葡聚糖CMPTR可以降低乳腺癌MCF-7細胞中抗凋亡蛋白Bcl_2的表達，增高促凋亡蛋白Bax的表達,促進細胞凋亡。黃濤濤等研究發現，擬康氏木霉胞外多糖EPS體外處理白血病K562細胞后，誘導K562細胞染色質聚縮，磷脂酰絲氨酸的外翻，線粒體膜電位下降，細胞內活性氧及游離鈣離子濃度的提高，表明EPS可能通過線粒體途徑誘導K562細胞發生凋亡。真菌多糖的抗腫瘤作用是可靠的、普遍的，開發治療或輔助治療腫瘤的天然藥物具有堅實的基礎。
[0007]天然多糖幾乎不可合成，而目前臨床使用的或正在研究的多數多糖藥物都受資源限制，開發成本高昂。真菌多糖優勢在于活性高、生產周期短，不受季節、氣溫等條件限制，且產量高、純化簡單，所以真菌多糖具有較強的市場競爭力和廣闊的發展前景。保存在中國普通微生物菌種保藏管理中心菌種保藏號為CGMCC N0.8436的黑根霉(Rhizopusnigricans)是從秸桿中分離獲得，屬于真菌門接合菌亞門的根霉屬，具有極強的生長勢。黑根霉是目前發酵工業中常用的微生物菌種，被廣泛應用于食品醫藥行業，如生物轉化和有機酸的生產等。通過液體深層發酵技術，可以生產大量的黑根霉菌絲。黑根霉菌絲中含有豐富的多糖，可以從中分離具有潛在抗腫瘤作用的活性多糖，進行臨床前研究。
【發明內容】
[0008]本發明針對現有技術的不足，提供一種具有抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖及其應用。
[0009]術語說明
[0010]seveage試劑:一種蛋白質變性劑,可以使蛋白質變性從溶液中析出。
[0011]本發明的技術方案如下:
[0012]一株具有產抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9,該菌株于2013年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏號 CGMCC N0.8436。
[0013]上述黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9在制備具有抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖中的應用。
[0014]上述應用，步驟如下:
[0015](I)將菌種保藏號為 CGMCC N0.8436 的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9 接種于PDA (馬鈴薯蔗糖)培養基中活化24小時，制得活化菌絲；
[0016](2)將步驟(1)制得的活化菌絲轉接于馬鈴薯蔗糖液體培養基中，培養溫度為27~29°C，120rpm,培養10天，4層紗布過濾，制得液體發酵菌絲；
[0017](3)將步驟(2)制得的液體發酵菌絲在75°C下，經95%的乙醇回流脫脂8小時；
[0018](4)將步驟(3)制得的脫脂菌絲通過熱水浸提獲取熱水提取液，60°C減壓濃縮至原體積的20% -30%，然后向冷卻至室溫的濃縮液中加入三倍體積的體積百分比為95%的乙醇溶液，4°C過夜，離心，收集沉淀；
[0019](5)將步驟(4)收集的沉淀用去離子水溶解,然后加入1/3體積的seveage試劑，劇烈振蕩脫去蛋白質，制得粗糖溶液；
[0020](6)將步驟(5)制得的粗糖溶液通過弱堿性陰離子交換樹脂D-301R脫色后，采用DEAE-Fast Flow陰離子交換凝膠和S印hacryl S-500HR凝膠分離純化，制得黑根霉菌絲多糖(RPS)溶液；
[0021](7)將步驟(6)制得的黑根霉菌絲多糖溶液經真空冷凍干燥后，制得黑根霉菌絲多糖。
[0022]所述步驟(1)中活化的時間為20~26h，活化溫度為25°C~30°C。
[0023]所述步驟(3)中的脫脂溫度為75°C，時間為8小時。
[0024]所述步驟(4)中的離心條件為:1000Orpm離心5min。[0025]所述步驟(5)的seveage試劑由氯仿與正丁醇按體積比4:1的比例混合。
[0026]上述黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9在制備具有抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的藥物中的應用。
[0027]有益效果
[0028]1、本發明所述黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9具有產抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖的功能，該多糖可以在體外激活線粒體凋亡通路誘導BGC-823細胞發生凋亡，從而抑制BGC-823細胞生長；體內給藥可以增加荷瘤小鼠體重，減小腫瘤體積和重量，抑制腫瘤生長，因而該多糖可應用于制備抗腫瘤藥物或輔助藥物。
[0029]2、本發明所述黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9具有較高的產黑根霉菌絲多糖的能力，按常規方式發酵培養，產率可達到50mg/L。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1A黑根霉菌絲多糖高效凝膠滲透色譜分析；
[0031]圖1B單糖標準品的高效液相色譜圖；
[0032]圖1C黑根霉菌絲多糖單糖組成分析；
[0033]圖2黑根霉菌絲多糖體外給藥對胃癌BGC-823細胞體外增殖活性影響的柱狀圖；
[0034]圖3黑根霉菌絲多糖體外給藥誘導胃癌BGC-823細胞發生凋亡的影響結果；
[0035]圖4黑根霉菌絲多糖體外給藥對胃癌BGC-823細胞線粒體膜電位的影響；
[0036]圖5黑根霉菌絲多糖體外給藥對胃癌BGC-823細胞Caspase-3和Caspase-9活力影響的柱狀圖；
[0037]圖6A黑根霉菌絲多糖體外給藥提高自噬性死亡的BGC-823細胞比例；
[0038]圖6B黑根霉菌絲多糖體外給藥提高BGC-823細胞內酸性囊泡數量；
[0039]其中:*表示t檢驗后，與對照組相比呈顯著性差異(P ( 0.05)
[0040]**表示t檢驗后，與對照組相比呈極顯著性差異(P≤0.01)
【具體實施方式】
[0041]下面結合實施例對本發明做進一步闡述，但本發明所保護范圍不限于此。
[0042]試劑說明
[0043]DEAE-Fast Flow陰離子交換凝膠、Sephadex G-100凝膠購自GE公司；
[0044]弱堿性陰尚子交換樹脂D-301R購自天津南大樹脂有限公司；
[0045]MTT (3- (4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) _2，5-diphenyltetrazoIium bromide)、結晶紫、吖啶橙購自Sigma-Aldrich公司；Hoechst33258染色液、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、韓離子檢測試劑盒、Caspase-3,9活性檢測試劑盒、細胞裂解液購自碧云天生物技術有限公司；
[0046]胃癌BGC-823細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；
[0047]其他試劑均為本領域常用市售試劑，分析純。
[0048]實施例1
[0049]一株具有產抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9,該菌株于2013年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏號 CGMCC N0.8436。
[0050]菌株特征:匍匐菌絲，臌根發達，分枝多，褐色，兩節間距離I~3毫米；孢子囊球形或橢圓形，褐色，直徑65— 350微米，膜上有小結晶，易消融；囊軸球形、橢圓形、卵形或不規則，膜薄平滑，淡褐色，直徑約70微米，高約90微米；中軸基存在，直徑25~214微米；孢子形狀不對稱，近球形、卵形或多角形，表面有線紋，呈蜜棗狀，褐色，5.5~13.5X7.5~8微米；接合孢子球形、卵形，外膜剛硬，黑色，有瘤狀突起，直徑160~220微米；無厚垣孢子
[0051]實施例2
[0052]實施例1所述黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9在制備具有抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖中的應用，步驟如下:
[0053](1)將菌種保藏號為 CGMCC N0.8436 的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9 接種于PDA培養基中，在28°C條件下活化24h，制得活化菌絲；
[0054]所述PDA培養基，每升組分如下:馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂2g，自來水定容至1000mL,自然 pH;
[0055](2)將步驟 (1)制得的活化菌絲轉接于PDB發酵培養基中，培養溫度28±1°C，120rpm搖床培養10天,4層紗布過濾,制得液體發酵菌絲；
[0056]所述馬鈴薯蔗糖液體培養基，每升組分如下:馬鈴薯200g，蔗糖20g，自來水定容至 1000mL,自然 pH ;
[0057](3)將步驟⑵制得的菌絲，經95%乙醇(體積濃度)、75°C回流脫脂8小時，
[0058](4)將步驟(3)制得的脫脂菌絲通過100°C熱水浸提，獲取熱水提取液，然后60°C減壓濃縮至原體積的25%。向冷卻至室溫的濃縮液中加入三倍體積的95%乙醇(體積濃度)，4°C過夜，1000Orpm離心5min,收集沉淀；
[0059](5)將步驟(4)收集的沉淀用去離子水溶解,得溶解液,然后加入溶解液體積1/3的seveage試劑劇烈振蕩脫去蛋白質，seveage試劑由氯仿與正丁醇按體積比4:1的比例混合制得，制得粗糖溶液；
[0060](6)將步驟(5)制得的粗糖溶液通過弱堿性陰離子交換樹脂D-301R脫色后，采用DEAE-Fast Flow陰離子交換凝膠和S印hacryl S-500HR凝膠分離純化，制得黑根霉菌絲多糖溶液；
[0061](7)將步驟(6)制得的黑根霉菌絲多糖溶液經真空冷凍干燥后，制得具有抑制BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖(RPS)。
[0062]經上述方法制得的RPS為白色固態，呈絮狀；
[0063]經紅外光譜檢測，發現其有多糖的特征峰吸收，證明RPS為多糖；
[0064]碘-碘化鉀反應、雙縮脲反應、紫外吸收檢測結果表明RPS中不含淀粉、蛋白質、核酸雜質；
[0065]高效凝膠滲透色譜分析檢測其分子量為1.617X IO7Da,單糖組成為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖、鼠李糖，摩爾比為92.2:5.1:1.3:1.6:2.3:1.0(如圖1A，B, C所示)ο
[0066]實施例3
[0067]RPS體外給藥對胃癌BGC-823細胞增殖活性的影響[0068]MTT 全稱為 3-(4，5-Dimethylthiazol_2-yl)_2，5-diphenyltetrazoliumbromide，漢語化學名為3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽。MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。
[0069]實驗方法
[0070]取對數生長期的胃癌BGC-823細胞，制成密度為2X104個/ml細胞懸液，接種于96孔板內，180 μ I/孔。培養24小時后，每孔加不同濃度的黑根霉菌絲多糖溶液20μ I(終濃度為0、50、100、200、400、600、800、1000μ g/ml)，每孔總液量為200 μ 1，每個藥物濃度設6個復孔，并設空白對照(沒有細胞，加入完全RPM1-1640培養液)和正常對照孔(不加藥物，加等量完全RPM1-1640培養液)，37°C、5% CO2 (下述細胞培養條件同此)培養24、48、72小時。培養結束前4小時，每孔加入20 μ I MTT溶液(5mg/ml)，孵育4小時。培養結束后，棄去培養液，每孔加入150 μ I 二甲基亞砜，振蕩5min，直至染料全部溶解，使用酶標儀在570nm處測定OD值并記錄。
[0071 ] 細胞活力=(處理組OD值/對照孔OD值)X 100 %
[0072]實施例1制得的黑根霉菌絲多糖在體外對胃癌BGC-823細胞的增殖活性有抑制作用，實驗結果見圖2。黑根霉菌絲多糖顯著抑制了胃癌BGC-823細胞的體外增殖，并具有時間和劑量依賴性。不同濃度黑根霉菌絲多糖處理24h、48h和72h，對胃癌BGC-823細胞的生長均產生了抑制作用，抑制率最高達到68%。 [0073]實施例4
[0074]RPS體外給藥誘導胃癌BGC-823細胞發生凋亡
[0075]細胞膜上磷脂酰絲氨酸外翻是細胞早期凋亡的重要標志之一，Annexin V是一種對磷脂酰絲氨酸具有高親和性的鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，可以作為檢測翻轉至細胞膜外表面的磷脂酰絲氨酸的特異性探針。
[0076]實驗方法
[0077]取對數生長期胃癌BGC-823細胞，調整濃度為5X IO5個/ml，種于六孔板內。次日加入不同濃度黑根霉菌絲多糖溶液，處理12h后收獲細胞。取5-10萬細胞，加入195 μ IAnnexin V-FITC結合液，然后加入5 μ I Annexin V-FITC，室溫避光孵育10分鐘，1000g離心5分鐘，棄上清，加入190 μ I Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入10 μ I碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即采用流式細胞儀檢測，FL-1檢測Annexin V-FITC的綠色熒光，FL-2檢測碘化丙啶的紅色熒光。
[0078]實施例1制得的黑根霉菌絲多糖體外給藥誘導胃癌BGC-823細胞發生凋亡，結果見圖3。胃癌BGC-823細胞經黑根霉菌絲多糖處理12h后，相對于對照組，處理組胃癌BGC-823細胞的早期凋亡細胞(右下象限)比例從2.24%上升至24.93%、17.20%和20.14%，晚期凋亡和壞死細胞(右上象限)數目也相應提高，隨濃度提高，凋亡細胞數目逐步增加。
[0079]實施例5[0080]RPS體外給藥誘導胃癌BGC-823細胞線粒體膜電位下降
[0081]線粒體途徑是細胞凋亡的經典信號途徑。線粒體作為細胞內能量代謝中心，在細胞凋亡調控中發揮重要作用。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的標志事件，為檢測RPS誘導BGC-823細胞凋亡是否通過線粒體途徑，我們采用一種陽離子染料JC-1檢測細胞線粒體膜電位的變化。在線粒體膜電位正常時，JC-1以二聚體形式存在于線粒體基質中，發射出紅色熒光；膜電位下降時，JC-1以單體形式分布于細胞質中，發射出綠色熒光。根據JC-1從紅色熒光到綠色熒光的改變可以準確的判斷線粒體膜電位的變化。
[0082]實驗方法
[0083]取對數生長期胃癌BGC-823細胞，調整濃度為5X105個/ml，種于六孔板內。次日加入不同濃度黑根霉菌絲多糖溶液，處理12h后收獲細胞，加入JC-1染料37度孵育30分鐘，PBS(磷酸鹽緩沖液，ph7.2-7.4)洗去殘留染料后上機檢測。
[0084]流式細胞術檢測結果顯示，實施例1制得的黑根霉菌絲多糖處理BGC-823細胞12h后，發出紅色熒光的細胞數目減少，FL2/FL1比值顯著降低，表明RPS誘導BGC-823細胞線粒體膜電位下降和線粒體功能失調(圖4)。
[0085]實施例6黑根霉菌絲多糖體外給藥對胃癌BGC-823細胞Caspase-3和Caspase-9活性的影響
[0086]Caspase是一種含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細胞質中以酶原狀態存在，被激活后可以對細胞組組分選擇性、限制性的酶切。凋亡相關的caspases可以分為兩類:一類是起始者，如caspase-8、9、10等；一類是執行者,如caspase-3、6、7等。線粒體途徑中，活化的Caspase-9可以激活 Caspase-3,導致細胞骨架蛋白和核纖層蛋白等的降解,引起一系列凋亡過程中細胞形態學變化。Caspase-3在染色質聚縮和細胞核碎裂過程中發揮關鍵作用。另外為確認caspase-3是否通過線粒體途徑激活，我們同時檢測了線粒體途徑的頂端蛋白酶Caspase-9酶活力的變化。
[0087]實驗方法
[0088]將處于對數長期的胃癌BGC-823細胞接種于六孔板，24小時后，加入黑根霉菌絲多糖母液，使其終濃度為0.2,0.6、lmg/ml，并設對照組。處理12h后收獲細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解15min，20000g離心10-15分鐘，取上清立即測定caspase3的酶活性或-70°C保存樣品。
[0089]結果如圖5所示，實施例1制得的黑根霉菌絲多糖體外給藥后，BGC-823細胞中caspase-3的酶活力顯著提高,0.6mg/ml處理組的Caspase-9酶活力提高至對照組的1.72倍，說明黑根霉菌絲多糖誘導BGC-823細胞發生線粒體調控的細胞凋亡。
[0090]實施例7黑根霉菌絲多糖體外給藥誘導胃癌BGC-823細胞發生酸性囊泡的積累和自噬性細胞死亡
[0091]自噬是細胞內一種自食(self-eating)的現象，自噬發生時，膜包裹部分胞質和細胞內需要降解的細胞器、蛋白質等形成自噬體，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現細胞穩態和細胞器的更新。但是過量的自噬會導致細胞的死亡，自噬性細胞死亡和細胞凋亡擁有眾多相同的刺激因素和調節蛋白。
[0092]實驗方法
[0093]將處于對數長期的胃癌BGC-823細胞接種于六孔板，24小時后，加入黑根霉菌絲多糖母液，使其終濃度為0.6mg/ml，處理3h、6h、12h、24h、36h、48h后胰酶消化收集細胞，100 μ g/ml的AO (吖啶橙)染色15分鐘，PBS重懸后上機檢測。
[0094]結果如圖6所示，實施例1制得的黑根霉菌絲多糖體外給藥后，BGC-823細胞內酸性囊泡細胞器顯著增加，表明細胞自噬活性的增強和自噬性死亡的發生。
[0095]實施例8 一種具有抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖體內給藥對荷瘤小鼠體重、腫瘤體積和瘤重的影響
[0096]取對數生長期的胃癌BGC-823細胞，臺盼藍染色檢查活細胞含量在95%以上，用PBS緩沖液調節細胞密度為1父108個/1111，右側肩胛部皮下接種841^/(:-皿/1111品系的裸鼠50只，0.2ml/只。一周后選取成瘤小鼠，隨機分為4組，對照組、黑根霉菌絲多糖25mg/kg.day組、50mg/kg.day組、lOOmg/kg.day組，每組10只，組間平均體重差異不超過I克。不同濃度的黑根霉菌絲多糖生理鹽水溶液于每天固定時間灌胃給藥，對照組給予等量生理鹽水，連續給藥15天。觀察各組小鼠的生長情況，每5天稱量小鼠體重。末次給藥24后放血處死小鼠，剝取皮下實體瘤瘤塊，去除脂肪和結締組織后稱重。
[0097]實施例1制得的黑根霉菌絲多糖體內給藥可以抑制異體移植腫瘤的生長，促進荷瘤小鼠體重的增加，結果見表1、表2。表1所示黑根霉菌絲多糖灌胃給藥對荷瘤小鼠體重的影響，對照組荷瘤小鼠體重增加緩慢，黑根霉菌絲多糖灌胃處理的荷瘤小鼠體重增加明顯加快，其中100mg/kg.day組20天后小鼠平均體重比對照組高16.06%。表2所示黑根霉菌絲多糖灌胃給藥對荷瘤小鼠腫瘤瘤重的影響，隨給藥劑量的增加，荷瘤小鼠瘤重下降，100mg/kg.day組的抑瘤率最高達到46.62%。上述結果說明黑根霉菌絲多糖體內給藥可以增加荷瘤小鼠體重，抑制荷瘤小鼠腫瘤生長。
[0098]表1黑根霉菌絲 多糖體內給藥對BGC-823荷瘤小鼠體重(克)的影響(η = 10，
X 土 SD )
[0099]
|0d(給藥前)|5d[TodKEd
O(對照組) 19.5+1.6~ 20.5+1.9~ 23.8 + 2.1~24.2 + 1.8
25mg/kg.day~19.3+1.3~21.7+1.8~ 24.6 + 1.9~25.5 + 2.6
50mg/kg.day~19.7+1.8~22.5 + 2.0~ 25.9 + 2.3~26.5 + 2.1
100mg/kg.day 19.4+1.7~ 21.2 + 1.7~ 25.3 + 2.5~ 26.9 + 2.9
[0100]表2黑根霉菌絲多糖體內給藥對BGC-823荷瘤小鼠腫瘤瘤重的影響(η = 10，
X 土SD )
[0101]
Mj瘤重(克) j抑瘤率(％ )
對照組1.72 + 0.22
【權利要求】
1.一株具有產抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖的黑根霉(Rhizopusnigricans) RN-9，該菌株于2013年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏號CGMCCN0.8436。
2.權利要求1所述黑根霉(Rhizopusnigricans) RN-9在制備具有抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的黑根霉菌絲多糖中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟如下: (1)將菌種保藏號為CGMCCN0.8436的黑根霉(Rhizopus nigricans) RN-9接種于PDA培養基中活化24小時，制得活化菌絲； (2)將步驟(1)制得的活化菌絲轉接于馬鈴薯蔗糖液體培養基中，培養溫度為27~290C, 120rpm,培養10天,4層紗布過濾,制得液體發酵菌絲； (3)將步驟(2)制得的液體發酵菌絲在75°C下，經95%的乙醇回流脫脂8小時； (4)將步驟(3)制得的脫脂菌絲通過熱水浸提獲取熱水提取液，60°C減壓濃縮至原體積的20% -30%，然后向冷卻至室溫的濃縮液中加入三倍體積的體積百分比為95%的乙醇溶液，4°C過夜，離心，收集沉淀； (5)將步驟(4)收集的沉淀用去離子水溶解,然后加入1/3體積的seveage試劑,劇烈振蕩脫去蛋白質， 制得粗糖溶液； (6)將步驟(5)制得的粗糖溶液通過弱堿性陰離子交換樹脂D-301R脫色后，采用DEAE-Fast Flow陰離子交換凝膠和S印hacryl S-500HR凝膠分離純化，制得黑根霉菌絲多糖(RPS)溶液； (7)將步驟(6)制得的黑根霉菌絲多糖溶液經真空冷凍干燥后，制得黑根霉菌絲多糖。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟(1)中活化的時間為20~26h，活化溫度為25°C~30°C。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟(3)中的脫脂溫度為75°C，時間為8小時。
6.如權利要求3所述的應用,其特征在于,所述步驟(4)中的離心條件為:1000Orpm離心 5min。
7.如權利要求3所述的應用,其特征在于,所述步驟(5)的seveage試劑由氯仿與正丁醇按體積比4:1的比例混合。
8.權利要求1所述黑根霉(Rhizopusnigricans) RN-9在制備具有抑制胃癌BGC-823細胞生長活性的藥物中的應用。
【文檔編號】C12P19/04GK104017736SQ201410275718
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】陳靠山, 陳國創, 張鵬英, 禹文茜 申請人:山東大學