一種農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法

一種農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法
【專利摘要】本發明屬于植物遺傳工程【技術領域】。具體公開了一種應用于麻瘋樹子葉外植體轉化受體系統的農桿菌介導的遺傳轉化方法。本發明首先利用高濃度TDZ（噻苯隆）溶液對子葉外植體進行短期浸泡，然后再用低濃度的農桿菌菌液短期侵染子葉外植體，這樣可以大大提高農桿菌的遺傳轉化率；將侵染后的外植體進行再生培養，對抗性芽直接進行PCR鑒定后就可以進行微嫁接，獲取轉基因植株。本發明大大提高了遺傳轉化率，而且顯著縮短了獲得完整轉化植株的周期。
【專利說明】一種農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物遺傳工程【技術領域】，具體涉及一種農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化 方法，更具體涉及一種應用于麻瘋樹子葉外植體轉化受體系統的農桿菌介導的遺傳轉化方 法。

【背景技術】
[0002] 植物遺傳轉化是一種重要和先進的育種技術。麻瘋樹由于其種子中含油量較高 (40?60%)，可以開發為"生物柴油"，因而成為一種非常具有應用前景的能源植物，但其分 布區域較窄，種子結實率較低，種子油的質量也還有待于進一步改良。為了擴大麻瘋樹的種 植區域，培育出了高產、優質的麻瘋樹新品種，可以利用遺傳轉化技術達到這些目的。目前， 植物遺傳轉化的技術已經基本成熟，而最為通常的轉化方法是應用農桿菌介導法將外源基 因導入到受體植物的細胞并整合到染色體基因組中以實現外源基因穩定的遺傳和表達。
[0003] 在采用常規的農桿菌轉化麻瘋樹子葉外植體的過程中，由于子葉外植體再生不定 芽方法還不夠先進，同時侵染外植體的農桿菌菌液濃度較高，侵染時間較長，需要采用抗生 素溶液清洗外植體，導致獲得外植體再生不定芽質量較差，再生不定芽的效率較低，需要對 再生不定芽進行額外的增殖培養和伸長培養，因而還導致獲得再生不定芽芽條的培養時間 較長(一般需要3-4個月）；進行生根培養時，對芽條的質量要求比較高，一般要求長度大于 2. 5 cm的芽條；生根培養基中抗生素的添加嚴重抑制了麻瘋樹抗性芽條的生根，導致麻瘋 樹外植體在遺傳轉化處理后很難得到能夠栽培成活的完整植株，即使獲得了完整的轉化植 株，所需的培養周期也較長(一般需要5個月）。目前報道的轉基因植株的檢測一般是獲得 完整抗性植株后提取DNA，然后進行報告基因的PCR擴增和Southern雜交檢測，這樣就造成 那些未能進入生根培養或者生根未能成功的陽性芽被淘汰，導致最終的轉化效率偏低。


【發明內容】

[0004] 本發明目的是針對現有農桿菌介導的麻瘋樹子葉外植體遺傳轉化方法存在轉化 率低、時間長的缺陷，提供一種應用于麻瘋樹子葉外植體轉化受體系統的農桿菌介導的遺 傳轉化方法。
[0005] 本發明通過以下技術方案實現上述發明目的： 一種農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法，包括如下步驟： 51. 獲取麻瘋樹子葉外植體，將子葉外植體在20 mg/L高濃度TDZ溶液中浸泡40分鐘 后取出； 52. 將子葉外植體置于無激素的預培養基上培養1?4天后，用0D6(KI為0. 1?0. 2的 低濃度農桿菌菌液侵染子葉外植體30秒； 53. 將侵染后的子葉外植體置于無抗生素和激素的共培養基上培養1?6天后，再將子 葉外植體置于無激素的篩選和恢復培養基上培養，獲得抗性芽； 54. 將抗性芽進行伸長培養，對伸長后的小芽或芽條進行PCR檢測，以PCR檢測結果為 陽性的小芽或芽條為接穗進行微嫁接，獲得遺傳轉化苗。
[0006] 本發明為了提高麻瘋樹子葉外植體再生不定芽的質量和效率，對子葉外植體采用 高濃度的TDZ溶液進行預處理；對外植體進行侵染時，采用低濃度的農桿菌菌液（0D〈0. 2) 浸泡侵染30秒左右，可以大大提高遺傳轉化效率；長度大于0. 5 cm抗性芽經過葉片直接 PCR檢測后，以轉化小芽或芽條為接穗，嫁接到作為砧木的無菌萌發的麻瘋樹幼苗的下胚軸 上，可以在較短的時間內獲得完整的轉化植株(只需2個月），而不需要對抗性芽進行額外的 伸長和生根培養，并且把傳統方法中由于質量不佳、長度較短（0. 5?2. 5 cm)而被忽視的 小芽(未利用這些小芽進行生根誘導培養但它們也可能是轉化芽)也都充分利用起來。應用 本研究的方法，可以提高麻瘋樹子葉外植體遺傳轉化效率，顯著縮短獲得轉化植株的時間。
[0007] 優選地，S2所述預培養基的培養時間為1天。
[0008] 優選地，S3所述共培養基的培養時間為2天。
[0009] 優詵地,S2所沭農桿菌菌液為含有DCambia 1300重組質粒的EHA105農桿菌菌液。 [0010] 優選地，S2所述預培養基為：MS培養基配方的無機成分+MS培養基配方的有機成 分 +100 mg/L 肌醇 +30 g/L 鹿糖 +300 mg/L 蛋白胨 +7 g/L 瓊脂，pH 為 5. 8 ?6. 0。
[0011] 優選地，S3所述共培養基為：MS培養基配方的無機成分+MS培養基配方的有機成 分+2 g/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮，pH為5. 5。
[0012] 優選地，S4所述PCR檢測時，取長度大于或等于0.5 cm抗性小芽或芽條，從小芽 或芽條的葉片上剪下一小塊葉片(直徑< 2 _)，放入PCR反應混合液中直接進行檢測。
[0013] 本發明的有益效果是： 本發明為了保證農桿菌介導的麻瘋樹子葉外植體轉化受體系統的遺傳轉化的效果和 效率，主要從幾個方面進行了優化：（1)利用一套高效的誘導子葉外植體再生不定芽的方 法，可在較短時間（只需30天左右，而常規方法至少需要45天）內獲得數量可觀且質量較 好的再生不定芽，這種再生方法可很好地應用于農桿菌侵染的麻瘋樹子葉外植體轉化受體 系統，并且由于再生出的不定芽質量較好，不需要額外的長時間的不定芽增殖和伸長培養 (這兩個過程一般都需要60天)，只需要在本發明所提供的伸長培養基上培養15天即可獲 得伸長的芽條；（2)本發明優化了檢測篩選標記基因的方法，無需像常規的方法一樣等到 獲得完整抗性植株之后再進行PCR檢測，本發明在獲得長度大于等于0. 5 cm的抗性芽后 即可取芽上葉片的極少部分(直徑小于2 mm)作為模板，進行篩選標記基因的PCR擴增，顯 著縮短了獲得陽性植株的時間，并對檢測體系進行了進一步的優化，節約檢測了成本，容易 實現推廣應用；（3)對侵染方法進行了進一步地優化，對外植體進行農桿菌侵染時，采用低 濃度菌液（0D_=0. 1?0. 2)進行短時間（30秒）的侵染，省去了常規方法采用高濃度菌液 (0D_=0. 6?0. 8)進行較長時間10?30分鐘侵染后需用抗生素溶液清洗外植體的步驟，不 僅保證了轉化效率，而且省時省力；（4)對預培養和共培養時間進行了優化，進一步保證了 轉化效率；（5)提高了轉化芽的利用效率，將常規方法中可能被忽視的小芽(長度為0. 5? 2. 5 cm)也都利用起來，直接利用其為接穗，與砧木進行微嫁接，可以高效、快速的獲得轉化 苗，縮短了獲得完整轉化植株的周期。
[0014] 說明書附圖 圖1.以麻瘋樹子葉外植體為受體的遺傳轉化體系，分子檢測和微嫁接植株的馴化移 栽示意圖；A :經過20 mg/L TDZ溶液浸泡處理40分鐘后的麻瘋樹子葉外植體在預培養基上 進行1天的預培養；B :經過農桿菌侵染30秒后的外植體在表面鋪有一張無菌濾紙的共培 養基上進行2天的暗培養（28°C);C:外植體在添加了 1.5 mg/L潮霉素，200 mg/L羧芐青 霉素和200 mg/L頭孢霉素 的篩詵和恢復培養基上培養30天；D :潮霉素抗性再生不定芽在 添加了 0.5 mg/L BA，0.25 mg/L KT，0.25 mg/L IAA，0.4 mg/L GA3, 200 mg/L 羧芐青霉素 和200 mg/L頭孢霉素 的MS培養基上進行15天的伸長培養；E :部分轉基因植株葉片（1?5 號)中篩選標記基因(潮霉素抗性基因)的PCR檢測結果（CK1以pCambial300重組質粒為對 照1 ;以水為對照2);F:嫁接苗在添加了 0.3 mg/L IBA和2 mg/L谷氨酰胺的1/2 MS培養 基上培養20天后效果；G :嫁接苗移栽至土壤中繼續生長的效果；Η :轉基因植株葉片的GUS 染色結果；I :野生型植株葉片的⑶S染色結果（bars=l cm)。
[0015] 圖2.葉片直接PCR檢測體系的優化。

【具體實施方式】
[0016] 下面結合說明書附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，本發 明采用的試劑、設備為本【技術領域】常規試劑和設備。
[0017] 實施例1 S1.制備用于侵染處理麻瘋樹子葉外植體的農桿菌菌液 用已滅菌的接種環從保存有農桿菌菌種(含有植物雙元表達載體重組質粒）的小管中 蘸取少許菌液，在固體YEP培養基上劃線接種之后，把培養皿放置于28°C生化恒溫培養箱 培養3天，待培養基上長出單菌落后，再用接種針挑取單菌落接種至盛有20 mL液體YEP培 養基的50 mL離心管（已滅菌)中，恒溫搖床（28°C，200 rpm)上培養24小時后，4000 rpm離 心10 min，保留沉淀倒掉上清液，再向大離心管中加入20 mL液體共培養基，懸浮沉淀，恒溫 搖床（28°C，200 rpm)中培養1小時，加入液體共培養基調整菌液的0D6(KI值為0. 1?0. 2。
[0018] 所述YEP培養基：5 g/L牛肉浸膏+1 g/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L蔗糖+0. 4 g/100 mL MgS04 · 7H20,用 1 mg/L NaOH 溶液調整 pH 至 7. 4。培養基在 121 °C，0. 1 MPa 的 條件下滅菌15分鐘，待培養基冷至60 °C左右時，加入經過孔徑為0. 22微米濾膜過濾滅菌 的100 mg/mL卡那霉素母液和50 mg/mL氯霉素母液，使兩者終濃度分別為100 mg/L和50 mg/L ;其中固體培養基中加入7 g/L瓊脂。
[0019] 所述液體共培養基：MS培養基配方的無機成分（16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、 1.7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化鈣、16. 9 mg/L-水硫酸錳、8. 6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、0.83 mg/L碘化鉀、0.25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、0.025 mg/ L五水硫酸銅、0.025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫 酸亞鐵）+MS培養基配方的有機成分（2 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L鹽酸硫胺素、0.5 mg/L鹽酸 批口多醇、0.5 mg/L煙酸）+2 g/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰 丁香酮，用1 mg/L NaOH溶液調整pH至5. 5。培養基在121 °C，0.1 MPa的條件下滅菌15 分鐘，待培養基冷卻至60°C左右時，加入經過孔徑為0. 22微米濾膜過濾滅菌的100 mg/mL 乙酰丁香酮母液，使其終濃度為100 mg/L。
[0020] S2.獲取麻瘋樹子葉外植體供體材料和子葉外植體； 選取大小均一的成熟麻瘋樹種子，經常規次氯酸鈉滅菌后，接種至無激素 MS培養基 上，在室溫為25 °C、光照強度為2000 lx、光照時間為每天12小時的條件下培養5天，獲得 兩片子葉作為子葉外植體供體材料，對子葉進行切割，獲取0. 5 cmXO. 5 cm子葉小塊作為 外植體。
[0021] 所述MS培養基：MS培養基配方的無機成分（16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、1.7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L-水硫酸猛、8. 6 mg/ L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、0· 83 mg/L碘化鉀、0· 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、0· 025 mg/L 五水硫酸銅、〇· 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫 酸亞鐵）+MS培養基配方的有機成分（2 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L鹽酸硫胺素、0.5 mg/L鹽酸 吡哆醇、0.5 mg/L煙酸)+100 mg/L肌醇+30 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用1 mg/L NaOH溶液調整pH至5. 8?6. 0。培養基在121 °C、0· 1 MPa的條件下滅菌15分鐘。
[0022] S3. TDZ溶液處理子葉外植體； 在超凈工作臺上，把切好的子葉外植體放入經高溫蒸汽滅菌的廣口玻璃瓶中，然后向 該廣口玻璃瓶中倒入20 mg/L TDZ處理溶液至完全浸沒外植體，輕輕搖動玻璃瓶10?20 秒，使得所有的外植體都與液體接觸，蓋上廣口玻璃瓶蓋，靜置40分鐘后倒掉TDZ溶液，取 出子葉外植體，放置在無菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的TDZ溶液。
[0023] 所述TDZ處理溶液的配制：準確稱取一定量的分析純TDZ藥品，用1 mg/L NaOH充 分溶解，再用去離子水定容，配制成20 mg/L的TDZ處理溶液。采用1 mg/L HC1調整pH值 為5. 8?6. 0 ;已配制好的高濃度的TDZ處理溶液經過孔徑為0. 22微米濾膜進行過濾滅菌。
[0024] S4.對子葉外植體進行農桿菌侵染前的預培養； 把經過上述TDZ溶液短期處理后的外植體接種至預培養基上，在室溫為25 °C、光照強 度為2000 lx、光照時間為每天12小時的條件下培養1天(附圖1 A)。
[0025] 所述預培養基：MS培養基配方的無機成分（16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、1.7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L-水硫酸猛、8. 6 mg/ L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、0· 83 mg/L碘化鉀、0· 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、0· 025 mg/L 五水硫酸銅、0.025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸 亞鐵）+ MS培養基配方的有機成分（2 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L鹽酸硫胺素、0.5 mg/L鹽酸 吡哆醇、〇· 5 mg/L煙酸)+100 mg/L肌醇+30 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用1 mg/L NaOH溶液調整pH至5. 8?6. 0。培養基在121 °C，0· 1 MPa的條件下滅菌15分鐘。
[0026] S5.對子葉外植體進行農桿菌侵染； 在超凈工作臺中，把經過步驟S4預培養后的子葉外植體轉移到經高溫蒸汽滅菌的容 積為200 ml的廣口玻璃瓶中，然后向該玻璃瓶中倒入步驟S1所述的農桿菌菌液至完全浸 沒外植體，蓋上廣口玻璃瓶瓶蓋，靜置30 s后倒掉農桿菌菌液，取出子葉外植體，放置在無 菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的農桿菌菌液。
[0027] S6.對侵染后的子葉外植體進行共培養； 把經過步驟S5農桿菌局部侵染后的子葉外植體接種至表面鋪有一張無菌濾紙的無抗 生素和激素的固體共培養基上，在室溫為25 °C、黑暗條件下，共培養2天(附圖1 B)。
[0028] 所述共培養基：MS培養基配方的無機成分（16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、1.7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L-水硫酸猛、8. 6 mg/ L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、0· 83 mg/L碘化鉀、0· 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、0· 025 mg/L 五水硫酸銅、0.025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸 亞鐵)+ MS培養基配方的有機成分（2 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L鹽酸硫胺素、0.5 mg/L鹽酸批 口多醇、0.5 mg/L煙酸）+100 mg/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙 酰丁香酮+8 g/L瓊脂，用1 mg/L NaOH溶液調整pH至5. 5。培養基在121 °C，0.1 MPa的 條件下滅菌15分鐘，待培養基冷卻至60 °C左右時，加入經過孔徑為0. 22微米濾膜過濾滅 菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其終濃度為100 mg/L。
[0029] S7.對侵染后的子葉外植體進行篩選和恢復再生培養 把經過S6共培養后的子葉外植體接種至篩選和恢復培養基上，在室溫為25 °C、光照 強度為2000 lx、光照時間為每天12小時的條件下培養30天（附圖1 C)。
[0030] 所述篩選和恢復培養基:MS培養基配方的無機成分（16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝 酸鉀、1.7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化鈣、16. 9 mg/L -水硫酸 錳、8. 6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、0· 83 mg/L碘化鉀、0· 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、 0.025 mg/L五水硫酸銅、0.025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵）+ MS培養基配方的有機成分（2 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L鹽酸硫胺素、 0.5 mg/L鹽酸批卩多醇、0.5 mg/L煙酸)+100 mg/L肌醇+30 g/L鹿糖+300 mg/L蛋白胨+篩 選劑（1.5 mg/L潮霉素）+抑菌劑（200 mg/L羧芐青霉素和200 mg/L頭孢霉素）+7 g/L瓊 月旨，用1 mg/L NaOH溶液調整pH至5. 8?6.0。培養基在121 °C，0.1 MPa的條件下滅菌 15分鐘。加入經過孔徑為0. 22微米濾膜過濾滅菌的抑菌劑母液和篩選劑母液至所定濃度 S8.抗性芽伸長培養 把經過S7篩選和恢復培養后的帶有抗性芽的子葉外植體接種至伸長培養基上，在室 溫為25 °C、光照強度為2000 lx、光照時間為每天12小時的條件下培養15天（附圖1 D)。
[0031] 所述伸長培養基：MS培養基配方的無機成分（16.5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、 1.7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化鈣、16. 9 mg/L-水硫酸錳、 8.6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、0.83 mg/L碘化鉀、0.25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、0.025 mg/L五水硫酸銅、0· 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七 水硫酸亞鐵）+ MS培養基配方的有機成分（2 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L鹽酸硫胺素、0.5 mg/ L鹽酸批卩多醇、0.5 mg/L煙酸）+100 mg/L肌醇+30 g/L鹿糖+300 mg/L蛋白胨+0.5 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（BA)+0.25 mg/L激動素（KT)+0.4 mg/L赤霉素（GA3)+0.25 mg/L吲哚 乙酸（IAA) +抑菌劑（200 mg/L羧節青霉素和200 mg/L頭孢霉素）+10 mg/L精氨酸+7 g/ L瓊脂，用1 mg/L NaOH溶液調整pH至5. 8?6. 0。培養基在121 °C，0· 1 MPa的條件下滅 菌15分鐘。加入經過孔徑為0. 22微米濾膜過濾滅菌的IAA、GA3、抑菌劑母液和篩選劑母 液至所定濃度。
[0032] S9.對抗性芽進行PCR檢測 用滅過菌的剪刀在培養瓶中剪取經過S8伸長培養后的抗性芽(長度大于或等于0. 5 cm)上的一點葉片(直徑< 2 mm)，將所取葉片放入已經裝有配好的PCR檢測反應體系的PCR 小管中，將在12000 rpm離心機上離心1分鐘后的PCR小管放入PCR儀上按照反應程序進 行PCR反應，在4 v/cm電壓下對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，檢測結果為擴增陽 性的即為轉化小芽或者芽條。
[0033] 所述PCR檢測反應體系：從抗性小芽或者芽條上剪下一小塊葉片(直徑< 2 mm)為 檢測對象并作為PCR擴增模板，采用篩選標記基因的引物（由于本次研究采用的是在多克 隆位點連接有35S啟動子+GUS編碼序列的pCambia 1300G質粒為對照，其篩選標記基因為 潮霉素磷酸轉移酶基因)，進行PCR檢測，檢測結果見圖1中E。
[0034] 采用15 μ L反應體系進行PCR檢測，反應體系如下表：

【權利要求】
1. 一種農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法，其特征在于，包括如下步驟：
51. 獲取麻瘋樹子葉外植體，將子葉外植體在20 mg/L高濃度TDZ溶液中浸泡40分鐘 后取出；
52. 將子葉外植體置于無激素的預培養基上培養1?4天后，用0D6(KI為0. 1?0. 2的 低濃度農桿菌菌液侵染子葉外植體30秒；
53. 將侵染后的子葉外植體置于無抗生素和激素的共培養基上培養1?6天后，再將子 葉外植體置于無激素的篩選和恢復培養基上培養，獲得抗性芽；
54. 將抗性芽進行伸長培養，對伸長后的小芽或芽條進行PCR檢測，以PCR檢測結果為 陽性的小芽或芽條為接穗進行微嫁接，獲得遺傳轉化苗。
2. 根據權利要求1所述的農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法，其特征在于，S2所述預 培養基的培養時間為1天。
3. 根據權利要求1所述的農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法，其特征在于，S3所述共 培養基的培養時間為2天。
4. 根據權利要求1所述的農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法，其特征在于，S2所述農 桿菌菌液為含有pCambia 1300重組質粒的EHA105農桿菌菌液。
5. 根據權利要求1所述的農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法，其特征在于，S2所述預 培養基為：MS培養基配方的無機成分+MS培養基配方的有機成分+100 mg/L肌醇+30 g/L 鹿糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，pH為5. 8?6. 0。
6. 根據權利要求1所述的農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法，其特征在于，S3所述共 培養基為：MS培養基配方的無機成分+MS培養基配方的有機成分+2 g/L肌醇+500 mg/L水 解酪蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮，pH為5. 5。
7. 根據權利要求1所述的農桿菌介導的麻瘋樹遺傳轉化方法，其特征在于，S4所述PCR 檢測時，取長度大于或等于0. 5 cm抗性小芽或芽條，從小芽或芽條的葉片上剪下一小塊直 徑< 2 mm的葉片，放入PCR反應混合液中直接進行檢測。
【文檔編號】C12N15/84GK104087611SQ201410275476
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】劉振蘭, 劉穎, 楊躍生, 鄭少燕, 莊楚雄, 李靜, 陳曉陽 申請人:華南農業大學