一種耐高溫重組β-甘露聚糖酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種耐高溫重組β-甘露聚糖酶及其應用。將來自黑曲霉的按照畢赤酵母密碼子偏好性優化后的β-甘露聚糖酶基因克隆到畢赤酵母表達載體pPICZαA中，轉化至畢赤酵母KM71H中，可得到高表達量的重組β-甘露聚糖酶。該重組β-甘露聚糖酶最適溫度為80℃。將本發明的β-甘露聚糖酶用于酶解魔芋精粉生產甘露低聚糖，底物濃度高，產物產量高，反應時間短，轉化率高，具有較大的工業化生產潛力和應用價值。
【專利說明】一種耐高溫重組β-甘露聚糖酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種耐高溫重組β -甘露聚糖酶及其應用，屬于生物工程【技術領域】。【背景技術】
[0002]甘露低聚糖是由甘露糖與葡萄糖以β_1，4糖苷鍵連接形成的聚合度為2~10的功能性寡糖。甘露低聚糖具有促進人和動物腸道內以雙歧桿菌為代表的有益菌的增殖、改善腸道內菌群結構等功能性低聚糖共同的理化特性，同時也有清除自由基、增強機體抗氧化性的能力，若將甘露低聚糖作為功能性食品添加劑應用于工業開發，應用前景十分廣闊。
[0003]魔芋是我國云南、四川、陜西、貴州等地盛產的多年生草本植物，其芋塊莖中含有豐富的甘露聚糖。目前，魔芋粉主要被作為食用粗纖維或作為食品添加劑，開發利用程度不夠。利用β_甘露聚糖酶將魔芋水解制成甘露低聚糖，可大大拓寬魔芋粉的應用范圍，提高原料附加值，具有廣泛的經濟效益和社會效益。酶法制備甘露低聚糖的核心技術是采用高活力甘露聚糖酶和高濃度魔芋膠溶液。但目前發酵酶活力低，導致酶的生產和使用成本高；同時由于魔芋膠水溶液的粘度非常大，40g/L的魔芋膠已呈凝膠狀態，可阻止酶對它的水解作用。因此國內外文獻報道的魔芋膠酶水解工藝均采用10~30g/L的魔芋膠溶液，導致了酶解產物的后處理成本高、生產效率低。因此解決酶法制備甘露低聚糖所遇到的問題，首先要得到活力高穩定性好的β -甘露聚糖酶，其次是優化酶解工藝提高底物濃度。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種耐高溫重組甘
露聚糖酶。
[0005]本發明還要解決的技術問題是提供上述β -甘露聚糖酶酶解高濃度魔芋粉制備甘露低聚糖的應用。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
[0007]一種耐高溫重組β -甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ IDNo:2所示。
[0008]一種耐高溫重組甘露聚糖酶的編碼基因，是滿足下列要求的核苷酸序列之
[0009](I)編碼如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的核苷酸序列；
[0010](2)如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0011]一種表達耐高溫重組甘露聚糖酶的重組菌株，該菌株為基因組上整合了權利要求2所述的β-甘露聚糖酶的編碼基因的畢赤酵母。
[0012]其中，所述的畢赤酵母為分泌型巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。
[0013]構建上述重組菌株的方法，它包括如下步驟:
[0014](I)應用常規重組質粒構建方法構建出重組密碼子優化質粒pPICZ a A - man,該質粒以AOXl為啟動子，并含有SEQ ID No:1所示的β -甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因；[0015](2)將重組密碼子優化質粒pPICZ a A - man用Sac I酶切線性化后，電擊轉化入畢赤酵母宿主菌中，即構成表達β -甘露聚糖酶的畢赤酵母重組菌株；
[0016](3)將重組菌株經過甲醇利用表型篩選、外源基因多拷貝整合篩選以及誘導表達篩選后，即篩選出過量表達甘露聚糖酶的重組工程菌。
[0017]步驟(1)中，所述的重組質粒pPICZa A-man是密碼子偏好性優化后合成的目的基因man插入到質粒pPICZ a A中形成的重組質粒。具體方法參見Invitrogen公司的Mult1-Copy Pichia Expression Kit 操作手冊。
[0018]步驟(2)中，在將重組密碼子優化質粒pPICZ a A - man用Sac I酶切線性化之后，電擊轉化入畢赤酵母宿主菌中之前，可將密碼子優化質粒pPICZ a A - man導入大腸桿菌進行擴增。
[0019]上述耐高溫重組β -甘露聚糖酶的制備方法,將上述重組菌在BMGY培養基中30°C培養至細胞密度OD6tltlnm = 2~6，室溫離心收集菌體，用BMMY液體培養基將細胞重懸至OD600nm為1.0以誘導表達，28 °C繼續培養72h，每24h向培養基添加純甲醇至終濃度為Iv/v%，將完成培養的重組菌經離心除去菌體，收集上清液，以分子量為IOKDa的超濾管，濾去小分量的蛋白和鹽，經過分子篩Superdex75PrepGrade純化,使用100mmol/L pH5.0的朽1檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，流速0.3ml/min洗脫，分布收集洗脫峰中的樣品，經過酶活測定，確定目的樣品所在的收集管，得到電泳純的目的蛋白，該重組β_甘露聚糖酶酶活為1168IU/mg,最適反應溫度為80°C,最適pH為5.0。
[0020]上述耐高溫 重組甘露聚糖酶在酶法制備甘露低聚糖中的應用。
[0021]優選的是，以富含甘露聚糖的生物質為原料酶法制備甘露低聚糖，所述的生物質為魔芋粉、田菁膠、刺槐豆膠和瓜爾膠的一種或多種
[0022]更有選的是，以10_50IU/g的耐高溫重組β -甘露聚糖酶添加量、于ρΗ4.0-6.0、50-90°C的震蕩或攪拌條件下酶解底物濃度為30-200g/L生物質溶液，酶解0.5_8h后降溫離心去殘渣,上清即為甘露低聚糖。
[0023]最優選的是，底物濃度為100_200g/L的高濃度生物質，酶用量為10_50IU/g，酶初始階段一次性加入，底物分多次添加(也就是說先按照100-200g/L的濃度計算生物質的總添加量，然后分多次添加)，添加時間間隔在l_3h，pH4.0-6.0、50-90°C的震蕩或攪拌條件下共酶解4-12h后冷卻后離心去殘渣，上清即為甘露低聚糖。
[0024]有益效果:本發明與現有技術相比，具有如下優勢:
[0025](I)本發明中的重組β_甘露聚糖酶產量高，活力強，穩定性好。
[0026](2)本發明中的重組β -甘露聚糖酶可高效酶解魔芋粉，β -甘露聚糖酶和魔芋粉的最適比例為50IU/g，低于以往報道。酶解50g/L魔芋粉時甘露低聚糖得率為78%，甘露低聚糖濃度為39g/L，單糖含量很低。
[0027](3)本發明中優化后的酶解工藝和魔芋粉補料添加工藝可大大提高重組β -甘露聚糖酶對高濃度底物的酶解效率，最高甘露低聚糖濃度為81g/L，高于以往報道。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1是β -甘露聚糖酶的SDS-PAGE圖譜。
[0029]圖2是魔芋粉酶法水解過程pH優化。[0030]圖3是魔芋粉酶法水解過程酶解溫度優化。
[0031]圖4是魔芋粉酶法水解過程底物濃度優化。
[0032]圖5是魔芋粉酶法水解過程酶用量優化。
[0033]圖6是魔芋粉酶法水解過程酶解時間優化。
[0034]圖7是β -甘露聚糖酶降解魔芋精粉離子色譜檢測結果。
【具體實施方式】
[0035]以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。
[0036]實施例1:重組質粒的構建。
[0037]重組質粒pPICZ a A - man是按照畢赤酵母密碼子偏好性優化后的β -甘露聚糖酶基因(如SEQ IDNo:1所示)插入到質粒pPICZ a A中形成的。
[0038]實施例2:目的DNA的準備及畢赤酵母的電轉化。
[0039]將所得到的大腸桿菌轉化子培養，提取質粒，采用Sac I進行酶切，通過純化試劑盒純化得到線性的目 的DNA ;分別制取畢赤酵母GSl 15、ΚΜ71Η、SMDl 168、X - 33的電轉感受態細胞；將80 μ I電轉感受態細胞與10 μ I的線性化DNA混合，轉入2mm電轉化杯中電擊，電擊參數為:1500V, 25 μ F，200 Ω。
[0040]實施例3:轉化子的篩選。
[0041]將電轉化后的畢赤酵母GS115、ΚΜ71Η、SMDl 168, X - 33感受態細胞涂布于含有100 μ g/mL博來霉素的YPDS平板上，30°C條件下培養直至轉化子出現，該轉化子即為畢赤
酵母重組菌株。
[0042]挑取四種不同的單克隆，接種至25ml BMGY培養基中30°C培養至細胞密度OD6tltol=2~6，室溫離心收集菌體，用BMMY液體培養基將細胞重懸至OD6tltlnm為1.0以誘導表達。28°C繼續培養96h，每24h向培養基添加100%甲醇至終濃度為lv/v%。將完成培養的畢赤酵母基因工程菌經離心除去菌體，收集上清液，測定粗酶液酶活。當宿主為GS115和SMD1168時，菌株所產β-甘露聚糖酶活力偏低；而枷71!1和乂-33作為宿主產酶能力較佳，甲醇緩慢利用型的ΚΜ71Η宿主更為突出，甲醇誘導96h后菌株發酵活力達到252IU/mL。
[0043]酶活測定方法和酶活單位定義:采用DNS定糖法測定β -甘露聚糖酶的活性。將0.9mL5.0g/L洋槐豆膠底物溶液(pH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)與0.1mL經適當稀釋的酶液混合均勻，80°C反應lOmin，立即加入3.0mL DNS試劑，煮沸7min，冷卻后定容至25mL，搖勻。在540nm處測定樣品液吸光度。甘露聚糖酶活力單位定義為每分鐘水解底物產生I μ mol的甘露糖所需的酶量定義為一個活力單位(IIU)。
[0044]實施例4:重組β -甘露聚糖酶的高密度發酵。
[0045]挑取轉化有重組質粒pPICZ a A - man的重組畢赤酵母菌KM71H的單克隆，接種至BMGY培養基中30°C培養至細胞密度OD6tltol = 2~6，以體積分數10%的接種量接種于甘油含量為40g/L的BMS中進行發酵培養。發酵罐體積為3L，裝液量1.5L，30°C、pH5.0(28%的氨水調控)的條件下培養。重組酵母在發酵罐培養24h左右后，當甘油耗盡，濕重在90 - 150g/L，繼而以18.15mL/h/L的速度流加甘油4h。停止流加甘油至DO再次反彈后饑餓培養lh，當細胞濕量達到180 - 220g/L后，開始流加甲醇誘導培養。甲醇誘導96h后菌株發酵活力達到2319IU/mL。
[0046]實施例5:重組β -甘露聚糖酶的純化。
[0047]發酵液離心所得上清通過分子量為IOKDa的超濾管進行超濾，濾去小分量的蛋白和鹽，取超濾過的液體2mL,經過分子篩Superdex75PrepGrade純化,使用100mmol/LpH5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，流速0.3ml/min洗脫，分布收集洗脫峰中的樣品，經過酶活測定，確定目的樣品所在的收集管，得到電泳純的目的蛋白，酶活為1168IU/mg。如圖1所示，是經純化酶液的SDS-PAGE圖譜。其中M為標準分子量蛋白質，I為含有pPICZ a A質粒的重組畢赤酵母KM71H發酵上清液作為對照，2為含有pPICZ a A-man質粒的重組畢赤酵母KM71H發酵上清液，3為純化的重組β -甘露聚糖酶。實施例6:重組β -甘露聚糖酶的酶學性質分析。
[0048]分析純化后的β -甘露聚糖酶的酶學性質，β -甘露聚糖酶的最適pH為5.0,當pH處于4~6之間時，該酶均有大于95%的相對酶活，在pH3~7范圍內保持70h，仍然具有90%以上的酶活力。β -甘露聚糖酶的最適反應溫度為80°C，90°C時仍然具有高達76.8%的相對酶活。60°C下保溫70h仍然保持90%以上的酶活力。
[0049]實施例7:魔芋粉酶法水解條件的工藝優化。
[0050](I)酶解pH:以125IU/g魔芋粉的酶液添加量、于80°C、170rpm、不同pH下(3.0~
6.0)酶解50g/L魔芋膠溶液，2h后HPLC檢測pH對甘露低聚糖得率的影響，結果顯示(圖2)酶解pH為3.0時魔芋粉在緩沖液中吸水成固態，不發生酶水解反應，酶解pH在4.0~
5.0范圍內，魔芋粉的酶解效率較高。
[0051](2)酶解溫度:以125IU/g魔芋粉的酶液添加量、于pH5.0、170rpm、不同溫度下(50~90°C )酶解50g/L魔芋膠溶液，2h后HPLC檢測溫度對甘露低聚糖得率的影響，結果顯示(圖3)酶解溫度在50~90°C范圍內，魔芋粉的酶解效率都較高。
[0052](3)底物濃度:以125IU/g魔芋粉的酶液添加量、于pH5.0、80°C、170rpm下酶解底物濃度在2.5~50g/L的魔芋膠溶液，2h后HPLC檢測底物濃度對甘露低聚糖得率的影響，結果顯示(圖4)隨著底物濃度的增加，甘露低聚糖產量相應增加，沒有明顯的傳質受阻現象。
[0053](4)酶用量:以50g/L的魔芋膠溶液為底物，在pH5.0、80°C、170rpm下酶解，酶液添加量為12.5~125IU/g魔芋粉，2h后HPLC檢測酶用量對甘露低聚糖得率的影響，結果顯示(圖5)當酶用量從12.5IU/g提高到50IU/g時，隨著酶用量增加，甘露低聚糖產量不斷提高，但從50IU/g繼續增加到一定程度時甘露低聚糖產量增加不明顯。
[0054](5)酶解時間:以50IU/g魔芋粉的酶液添加量、于pH5.0、80°C、170rpm下酶解底物濃度為50g/L的魔芋膠溶液，在O~4h范圍內不同時間點取樣，HPLC檢測酶解時間對甘露低聚糖得率的影響，結果顯示(圖6)由于魔芋吸水性極強，Oh時呈現固態，隨著時間的推移，甘露聚糖酶發生酶水解作用，底物不斷的液化，反應2h后基本液化完全，酶解已經趨于停止，甘露低聚糖含量也不再上升。
[0055]實施例8:最優酶解條件下重組β -甘露聚糖酶對魔芋粉的降解分析。
[0056]以50IU/g魔芋粉的酶液添加量、于ρΗ5.0、80°C、170rpm下酶解底物濃度為50g/L的魔芋膠溶液，酶解2h后加溫至100°C保持IOmin使酶滅活，冷卻后離心去殘渣，上清用于HPLC和離子色譜分析。HPLC結果顯示，甘露低聚糖濃度為39g/L，甘露低聚糖得率為78%。圖7為β-甘露聚糖酶降解魔芋粉離子色譜檢測結果，從圖中可知，該重組β-甘露聚糖酶酶解魔芋精粉主要產物為甘露二糖和甘露六糖，甘露二糖含量為45.5 %，甘露六糖為34.3%，甘露一糖、甘露三糖、甘露四糖含量分別為7.5%，8.8%，3.4%。
[0057]實施例9:重組β -甘露聚糖酶酶解刺槐豆膠制備甘露低聚糖。
[0058]以30IU/g刺槐豆膠的酶液添加量、于ρΗ5.0、70°C、170rpm下酶解底物濃度為30g/L的魔芋膠溶液，酶解2h后加溫至100°C保持IOmin使酶滅活，冷卻后離心去殘渣，上清用于HPLC和離子色譜分析。HPLC結果顯示，甘露低聚糖濃度為25.8g/L，甘露低聚糖得率為78%。
[0059]實施例10:酶解條件下重組β -甘露聚糖酶酶解高濃度魔芋粉制備甘露低聚糖。
[0060]150g/L的魔芋粉在Oh時一次性全部添加，β -甘露聚糖酶在Oh時按50IU/g魔芋粉(以150g/L魔芋粉計)一次性全部添加，在pH為5.0、溫度為80°C、轉速為170rpm的條件下酶解，6h后酶解結束,將酶液加溫至100°C保持IOmin使酶滅活,冷卻后離心去殘洛,上清用于HPLC分析，結果顯示甘露低聚糖濃度為56.6g/L。
[0061]實施例11:重組β -甘露聚糖酶酶解分批添加的魔芋粉制備甘露低聚糖。
[0062]150g/L的魔芋粉分三次添加，添加時間分別為0h、2h和4h。β -甘露聚糖酶在Oh時按50IU/g魔芋粉(以150g/L魔芋粉計)一次性全部添加。在pH為5.0、溫度為80°C、轉速為170rpm的條件下酶解，6h后酶解結束，將酶液加溫至100°C保持IOmin使酶滅活，冷卻后離心去殘洛，上 清用于HPLC分析,結果顯示甘露低聚糖濃度為81g/L。
【權利要求】
1.一種耐高溫重組β -甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.一種耐高溫重組β_甘露聚糖酶的編碼基因，其特征在于，是滿足下列要求的核苷酸序列之一: (1)編碼如SEQID No:2所示氨基酸序列的核苷酸序列； (2)如SEQID No: I所示的核苷酸序列。
3.一種表達耐高溫重組甘露聚糖酶的重組菌株，其特征在于，該菌株為基因組上整合了權利要求2所述的β-甘露聚糖酶的編碼基因的畢赤酵母。
4.根據權利要求3所述的重組菌株，其特征在于，所述的畢赤酵母為分泌型巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。
5.構建權利要求3所述的重組菌株的方法，其特征在于，它包括如下步驟: (1)應用常規重組質粒構建方法構建出重組密碼子優化質粒pPICZa A - man,該質粒以AOXl為啟動子，并含有SEQ ID No:1所示的β -甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因； (2)將重組密碼子優化質粒pPICZa A - man用Sac I酶切線性化后，電擊轉化入畢赤酵母宿主菌中，即構成表達β-甘露聚糖酶的畢赤酵母重組菌株； (3)將重組菌株經過甲醇利用表型篩選、外源基因多拷貝整合篩選以及誘導表達篩選后，即篩選出過量表達甘露聚糖酶的重組工程菌。
6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的重組質粒pPICZ a A - man是密碼子偏好性優化后合成的目的基因man插入到質粒pPICZ a A中形成的重組質粒。
7.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟(2)中，在將重組密碼子優化質粒pPICZ a A - man用Sac I酶切線性化之后，電擊轉化入畢赤酵母宿主菌中之前，可將密碼子優化質粒PPICZ a A - man導入大腸桿菌進行擴增。
8.權利要求1所述的耐高溫重組甘露聚糖酶的制備方法，其特征在于，將權利要求3所述的重組菌在BMGY培養基中30°C培養至細胞密度OD6tltol = 2~6，室溫離心收集菌體，用BMMY液體培養基將細胞重懸至OD6tltol為1.0以誘導表達，28°C繼續培養72h，每24h向培養基添加純甲醇至終濃度為1V/V%，將完成培養的重組菌經離心除去菌體，收集上清液，經超濾和分子篩純化制備得到耐高溫重組β-甘露聚糖酶。
9.權利要求1所述的耐高溫重組β-甘露聚糖酶在酶法制備甘露低聚糖中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，以富含甘露聚糖的生物質為原料酶法制備甘露低聚糖，所述的生物質為魔芋粉、田菁膠、刺槐豆膠和瓜爾膠的一種或多種。
11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于，以10-50IU/g的耐高溫重組β-甘露聚糖酶添加量、于pH4.0-6.0、50-90°C的震蕩或攪拌條件下酶解底物濃度為30_200g/L生物質溶液，酶解0.5-8h后降溫離心去殘渣，上清即為甘露低聚糖。
12.根據權利要求11所述的應用，其特征在于，底物濃度為100-200g/L的高濃度生物質，酶用量為10-50IU/g，酶初始階段一次性加入，底物分多次添加，添加時間間隔在l_3h，pH4.0-6.0、50-901:的震蕩或攪拌條件下共酶解4-1211后冷卻后離心去殘渣，上清即為甘露低聚糖。
【文檔編號】C12N15/56GK104004735SQ201410274470
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】歐陽嘉, 倪玉佳, 周旻昱, 鄭兆娟, 李鑫, 朱均均, 徐勇, 勇強 申請人:南京林業大學