一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物、制備方法及用途
【專利摘要】本發明公開了一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物、制備方法及其作為基因載體的應用。系通過可逆加成-斷裂鏈轉移(RAFT)聚合以及后續脫保護反應合成了側基為氨基的甲基丙烯酰胺陽離子功能聚合物，隨后，將含保護基的精氨酸以及乳糖酸砌塊聯接到聚甲基丙烯酰胺分子上，最后脫除保護基后即得到目標聚合物，其制備方法簡單，反應條件溫和。細胞評價結果表明，本發明中制備的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物具有高生物相容性、低細胞毒性、高基因轉染效率、良好的血清穩定性，是一類有效的新型糖基修飾聚合物非病毒基因載體，可作為高效的基因轉染試劑得到應用。
【專利說明】一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物、制備方法及用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物功能材料領域。具體涉及到側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的 聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物、制備方法及其作為生物功能載體材料的應用。
【背景技術】
[0002] 研制高效、低毒的新型陽離子聚合物載體材料已經成為了目前生物功能材料及轉 染試劑相關領域研究的主要方向之一。近來發現，許多陽離子聚合物作為基因載體的轉 染效率相對較低是因其在細胞內輸送過程中需要跨越一些膜性細胞器（如細胞膜和核膜 等），而跨膜能力較低，因而增強陽離子聚合物基因載體的跨膜能力將是提高其基因轉染效 率的可能方法之一。目前在天然產物中發現一些富含精氨酸殘基的多肽，如Tat肽、核定位 (NLS)肽、肽核酸、糖基化多肽，以及合成的寡聚精氨酸多肽等具有較強的跨膜能力，相關研 究表明精氨酸殘基的存在對其穿膜能力起著至關重要的作用。因此，設計合成將天然精氨 酸片段化學偶聯至陽離子聚合物基因載體材料中進行改性，將可能提高其與基因的相互作 用及載體/基因復合物的細胞內吞能力，進而實現提高基因轉染效率的目的。在本發明的 前期工作中，已經開發了一系列側基精氨酸修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物作為基因 載體（Biomaterials2013, 34, 7923 ;中國專利申請號201310325795. 9)，發現天然精氨酸結 構的修飾及修飾率對提高載體的轉染效率具有重要影響，然而，該體系在細胞毒性和轉染 效率方面還有待進一步改善。
[0003] 另一方面，糖類化合物是一類重要的生物活性物質，其具有良好的生物相容性和 可降解性，不僅是生物體能量的來源，同時在生物體構建、物質代謝和信號轉導等諸多的生 理過程中發揮著極其重要的作用。目前，糖類化合物已被廣泛應用于生物醫藥領域，一些自 然界中廣泛存在的多糖，如幾丁質（chitin)、殼聚糖（chitosan)、纖維素（cellulose)、淀 粉（starch)、糊精（dextran)等被大量應用于制備生物材料。此外，一些特定結構的小分 子糖類化合物具有細胞膜識別、介導細胞黏附以及細胞內信號轉導等生物學功能，被作為 修飾基團引入生物材料中進行功能化改性，從而達到提高材料的生物相容性及實現特定生 物功能的目的。近年來研究發現將一些小分子的糖類物質（如山梨醇、甘露糖、葡萄糖酸、 乳糖酸等）作為結構砌塊，與線性或枝化結構的PEI分子偶聯后作為基因載體輸送DNA或 siRNA，能夠進一步提高載體的生物相容性，其原因可能是由于引入的多羥基糖分子砌塊導 致載體表面陽離子電荷密度降低，從而降低了對細胞膜的破壞能力所致。而且經上述糖類 物質修飾后的載體可獲得大大優于未經修飾載體的基因轉染效率，這可能與引入的多羥基 糖分子砌塊具有較高滲透性導致其細胞內吞效率提高相關。因此，合理的設計糖類分子砌 塊引入到相關的陽尚子聚合物基因載體材料中，實現商效基因表達從而提商其轉染效率， 同時又能降低載體細胞毒性，將是解決轉染效率與細胞毒性的有效方法，也是研發高性能 基因輸送生物材料的可行性方向。
[0004] 進一步的，通過發展反應條件溫和、可控的聚合反應及化學修飾技術得到分子量 可控、分子量分布窄、結構明確的糖基修飾聚合物，有利于研究載體結構與其性能之間的關 系，也可為進一步從結構上優化載體材料提供參考。因此，在上述的相關基礎上，本發明擬 設計開發一類具有規整可控分子骨架的陽離子聚合物，其結構中同時包含可提高載體/DNA 復合物的非特異性胞吞能力的精氨酸陽離子片段，以及具有良好生物相容性并可提高表面 滲透壓的乳糖酸片段，進一步將其發展成為一系列新型的高效、低毒的基因載體。在此基礎 上，發展溫和、高效、易操作的化學偶聯和修飾方法，為發展安全、高效的基因治療提供性能 優良的新型生物材料。這也是本發明所致力的目標。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的之一在于提供一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙 烯酰胺陽離子聚合物。
[0006] 本發明的目的之二在于提供一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙 烯酰胺陽離子聚合物的制備方法。
[0007] 本發明的目的之三是提供一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯 酰胺陽離子聚合物作為基因載體材料的用途。
[0008] 本發明所提供的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離 子聚合物，可由以下化學結構式（I)表示：
[0009]
【權利要求】
1. 一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽離子聚合物，可由以下 化學結構式（I)表不：
上式（I)中，η表示甲基丙烯酰胺聚合物主鏈的聚合度，其取值范圍為5?400,優選 5?200 ;Χ表示側基天然精氨酸修飾的聚甲基丙烯酰胺共聚單元的聚合度，其取值范圍為 5?400,優選5?200 ;y表示側基乳糖酸修飾的聚甲基丙烯酰胺共聚單元的聚合度，其取 值范圍為5?200,優選5?100 表示陰離子反離子，具體包括氯離子、三氟甲磺酸根離 子或三氟乙酸根離子TFA'
2. 如權利要求1所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽 離子聚合物，其特征是所述的η為5?200 ;所述的X為5?200 ;所述的y為5?100。
3. 如權利要求1所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺陽 離子聚合物的制備方法，其特征是通過下列步驟進行： 第一步：將端氨基Boc保護的己二胺基甲基丙烯酰胺功能單體 偶氮二異丁腈AIBN自由基聚合引發劑、RAFT鏈轉移劑十二烷基三硫代碳酸-(4-氰基戊 酸）酯依次按摩爾比5?200:3:1溶于有機溶劑中，于25?120°C下反應4?48h ;然后濃 縮反應溶液，將濃縮液在冰乙醚中沉淀除去未反應殘留單體，所得沉淀經過濾干燥，得到側 基為Boc保護的己氨基的甲基丙烯酰胺聚合物，其數均分子量為1500?11萬，隨后上述 聚合物加過量酸脫除Boc保護基，在0?50°C下反應1?3h，最終制備得到側基為己氨基 的甲基丙烯酰胺陽離子功能聚合物，其結構式如下（II )所示：
上式（II )中，A'n同權利要求1或2; 第二步：在有機溶劑中和〇?50°C溫度下，叔丁氧羰基-Νω-(2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氫 苯并呋喃-5-磺酰基）-L-精氨酸Boc-Arg(Pbf)-0Η、乳糖酸、苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四 甲基脲六氟磷酸酯HBTU、二異丙基乙基胺DIPEA按設定的摩爾比（1.0:0. 1?0.3:0.8? 2. 5:1. 0?3. 0)反應10?60min ;然后加入第一步中的產物側基為己氨基的甲基丙烯酰胺 陽離子功能聚合物，在〇?50°C下反應12?120h，其后加入有機或無機酸在0?50°C下持 續反應1?3h脫除精氨酸的保護基團，得到如結構式（I)所示產物。
4. 根據權利要求3所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的合成制備，其特征是所述的有機溶劑包括乙酸乙酯、四氫呋喃、1，4_二氧 六環、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、乙醚、乙腈、丙 酮、苯、甲苯或它們的混合溶劑。
5. 根據權利要求3所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物制備方法，其特征是所述步驟中使用的有機或無機酸是鹽酸、三氟甲磺酸或 三氟乙酸。
6. 根據權利要求3所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的制備方法，其特征是所述步驟一中的反應溫度為15?50°C ;合成步驟二中 所述的反應溫度為〇?30°C。
7. 根據權利要求3所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的制備方法，其特征是所述步驟一中的側基為Boc保護的己氨基的甲基丙 烯酰胺聚合物，其數均分子量為1500?5萬。
8. 根據權利要求3所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的制備方法，其特征是所述步驟一中的數均分子量是利用 1Η核磁共振1H NMR 譜圖中聚合物末端RAFT試劑的殘基上質子的特征峰積分與聚合物側鏈上的特定基團上質 子的特征峰積分的比值計算出或者通過凝膠滲透色譜GPC來表征。
9. 根據權利要求3所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物的制備方法，其特征是所述步驟二中的產物經過減壓旋蒸除去溶劑，將粗產 物溶于水后過濾并在純水中透析12?72h，進一步冷凍干燥的純化處理；純化后所得共聚 物的摩爾組成通過測定其1H核磁共振1HNMR譜圖，利用精氨酸和乳糖酸片段上的特定質子 的特征峰積分與側基己氨基上特定質子的特征峰積分的比值計算得到。
10. 根據權利要求1所述的一類側基天然精氨酸和乳糖酸協同修飾的聚甲基丙烯酰胺 陽離子聚合物作為血清穩定性的生物功能載體材料的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK104086685SQ201410272640
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】曹阿民, 李慧, 盛瑞隆, 羅挺, 孫景景 申請人:中國科學院上海有機化學研究所