一種麥芽糊精底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種麥芽糊精底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶及其制備方法,屬于遺傳工程和酶工程領域。本發明通過對P.macerans?strain?JFB05-01(CCTCC?NO:M208063)的CGTase的195位的酪氨酸(Tyr)替換為絲氨酸(Ser),260位的酪氨酸(Tyr)替換為精氨酸(Arg),265位的谷氨酰胺(Gln)替換為賴氨酸(Lys),使AA-2G產量分別提高了23%,44%和40%。對以上突變株組合突變,獲得雙突變體Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y260R/Q265K以及三點突變體Y195S/Y260R/Q265K。它們利用麥芽糊精為糖基供體生產AA-2G產量分別提高了57%,49%,55%和59%。這些突變株比野生型CGTase更利于利用麥芽糊精為糖基供體生產AA-2G。
【專利說明】一種麥芽糊精底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶及其制備方法
[0001]本申請是發明名稱為“一種麥芽糊精底物特異性提聞的環糊精糖基轉移酶及其制備方法”,申請號為201210527869.2, 申請日期:為2012年12月10日的發明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種環糊精糖基轉移酶及制備方法,特別是一種麥芽糊精底物特異性提聞的環糊精糖基轉移酶及其制備方法。
【背景技術】
[0003]L-抗壞血酸(L-AA,維生素C)是水溶性維生素,參與很多體內的生理活動,在保持和促進人體健康中起到重要的作用,是人體無法自身合成的必需的營養元素。但L-AA極不穩定,在空氣中易被氧化為脫氫抗壞血酸,破壞分子中的共軛體系,發生不可逆裂解反應,特別是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下,反應更迅速,使L-AA的生理活性減弱甚至消失,這使得它在應用上受到很大的限制。因此,如何增強L-AA的穩定性是目前國內外學術界和產業界所關注的焦點問題。
[0004]2-0- a -D-吡喃型葡萄糖基_L_抗壞血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物,是將一個糖基以α -1, 4-糖苷鍵連接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽,不易發生氧化反應,所以在水溶液中特別穩定,并且AA-2G沒有直接還原性,有效地保護了 L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今發現的穩定性和性能最佳的L-AA替代品。
[0005]目前,AA-2G主要通過糖基轉移酶生物催化生成,其中環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α _環糊精或β _環糊精為糖基供體,將葡萄糖基催化轉移到受體L-AA上。然而,若以α-環糊精為糖基供體,成本太高;若以β-環糊精為糖基供體,由于它的溶解度較低,酶促反應效率受到較大限制。因此,選擇一種既便宜又易溶的糖基供體(如麥芽糊精)將會大大減少AA-2G的生廣成本,提聞其利潤。但是,由于目ill環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)對麥芽糊精的底物特異性(轉化率)較低,因此,通過分子改造CGTase技術提高其對麥芽糊精的底物特異性,將推動與L-AA糖基衍生物相關行業的快速發展。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種麥芽糊精底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶,以Genbank AF047363.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶為出發序列,第195位的酪氨酸突變成絲氨酸Y195S,第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R,第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K或其組合。
[0007]所述環糊精葡萄糖基轉移酶來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)。
[0008]所述環糊精葡萄糖基轉移酶的獲得方法為以Genbank AF047363.1公布的基因為出發基因,將第195位的酪氨酸突變成絲氨酸Y195S,第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R,第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K或將其組合進行雙突變或三突變。
[0009]產所述環糊精葡萄糖基轉移酶的基因工程菌或轉基因細胞系也為本發明要求保護的范圍。
[0010]本發明要解決的另一個技術問題是提供一種產環糊精葡萄糖基轉移酶基因工程菌的構建方法,具體步驟如下:
[0011]I)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼所述環糊精葡萄糖基轉移酶基因;
[0012]2)將步驟I)獲得的環糊精葡萄糖基轉移酶基因連接到大腸桿菌表達載體,得到重組表達載體;
[0013]3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21得到基因工程菌。
[0014]本發明要解決的另一個技術問題是提供一種應用所述基因工程菌發酵生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法,以產環糊精葡萄糖基轉移酶突變體的基因工程菌為生產菌株,活化后按4%接種量將種子發酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養基;大腸桿菌在30°C搖床培養至OD6tltl = 0.6,加入0.01mM終濃度的IPTG誘導胞外表達,并在25°C搖床繼續培養發酵90h后,將發酵液于4°C、1000Orpm離心20min除菌體,收集富含環糊精葡萄糖基轉移酶的上清液。
[0015]軟化類芽孢桿菌(Peanibacillusmacerans) JFB05-01 (CCTCC NO:M208063),已在中國專利CN101294149公開,
【公開日】2008年10月29日。
[0016]來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans) JFB05-01的環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGTase)的三種突變體酶:Y195S,Y260R及Q265K,它們相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產AA-2G時,產量分別提高23%,44%和40%。
[0017]Peanibacillus macerans JFB05-0ICGTase 的三種雙突變體酶 Y195S/Y260R, Y195S/Q265K和Y260R/Q265K,相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產AA-2G產量分別提高了 57%,49%和55%。
[0018]Peanibacillus macerans JFB05-0ICGTase 的一種三點突變體酶 Y195S/Y260R/Q265K,其特征是:將雙突變體酶Y195S/Y260R基因中第265位的谷氨酰胺Gln突變成了精氨酸賴氨酸Lys,命名為Y195S/Y260R/Q265K。相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產AA-2G產量提高了 59%。
[0019]本發明的有益效果:本發明構建了 7個有意義的突變體,均實現了環糊精糖基轉移酶對麥芽糊精的底物特異性的提高,以此為糖基供體所產AA-2G產量均高于野生型CGTase,更利于AA-2G工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0020]圖1不同反應時間下野生型CGTase和突變型酶生成AA-2G的產量。
[0021]:野生型 CGTase ;.:Y260R ; ▲:Q265K ; ▼:Y195S ; O:Y260R/Q265K ; Δ:Y260R/Y195S ;?:Q265K/Y195S ;?:Y260R/Q265K/Y195S。
【具體實施方式】
[0022]實施例1:底物特異性提高的環糊精葡萄糖基轉移酶[0023]本發明的環糊精糖基轉移酶是在GenBank AF047363.1公布的基因序列基礎上,對其3個位點進行氨基酸進行單突變或組合突變獲得,具體獲得了 7種突變體,分別為Y260R ;Q265K ;Y195S ;Y260R/Q265K ;Y260R/Y195S ;Q265K/Y195S ;Y260R/Q265K/Y195S。
[0024]可以通過化學全合成或定點突變的方式將其成熟區的3個位點進行氨基酸的取代。
[0025]實施例2:底物特異性提高的環糊精葡萄糖基轉移酶的制備方法
[0026]本例以PCR方法為例進行說明,但被發明的保護并不限于僅通過PCR方法獲得突變的方法。突變體酶 Y195S,Y260R, Q265K, Y195S/Y260R, Y195S/Q265K, Y260R/Q265K 和Y195S/Y260R/Q265K的制備方法如下:
[0027]I)定點突變
[0028]單突變體酶Y195S,Y260R及Q265K的定點突變,利用快速突變試劑盒MutanBESTkit,以表達載體 cgt/pET-20b (+)1 (1.Li, Z.,B.Li, Z.Gu, G.Du, J.ffu, and J.Chen.2010.Extracellular expression and biochemical characterization of alpha-cyclodextringlycosy I transferase from Paenibacillus macerans.Carbohydr Res345:886-892.)為模板,
[0029]引入Y195S密碼子的頂點突變引物為:
[0030]正向引物:5’-TACAAGAACCTCTCTGACCTGGC-3’,下劃線為突變堿基;
[0031 ]反向引物:5’ -AATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATC-3’ ;
[0032]引入Y260R密碼子的頂點突變引物為:
[0033]正向引物:5’-GGGGAATGGCGTCTTGGCGCGG-3’,下劃線為突變堿基;
[0034]反向引物:5’-GAACGTAAATACCGGATGATCGCC-3’;
[0035]引入Q265K密碼子的頂點突變引物為:
[0036]正向引物:5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3,,下劃線為突變堿基;
[0037]反向引物:5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’。
[0038] 雙突變體酶Y195S/Y260R,Y195S/Q265K及Y260R/Q265K的定點突變:利用快速突變試劑盒MutanBEST kit,分別以單突變體酶Y195S基因為模板,
[0039]引入Y260R密碼子的定點突變引物為:
[0040]正向引物:5’-GGGGAATGGCGTCTTGGCGCGG-3’,下劃線為突變堿基;
[0041 ]反向引物:5’ -GAACGTAAATACCGGATGATCGCC-3’ ;
[0042]引入Q265K密碼子的定點突變引物為:
[0043]正向引物:5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3,,下劃線為突變堿基;
[0044]反向引物:5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’;
[0045]以單突變體酶Y260R基因為模板,引入Q265K密碼子的定點突變引物為:
[0046]正向引物:5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3,,下劃線為突變堿基;
[0047]反向引物:5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’。
[0048]PCR 反應體系均為:5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 5 μ L,2.5mMdNTPs4 μ L, 10 μ M 正向弓丨物 I μ L,10 μ M 反向弓丨物 I μ L,模板 DNAl μ L, 2.5U/ μ L PrimeSTARTaq HS0.5 μ L,加入雙蒸水至50 μ L ;
[0049]PCR產物擴增條件均為:98 V預變性3min ;隨后進行98 V !Os, 62 V 15s,72°C 6min30個循環;最后72°C保溫IOmin ;
[0050]PCR產物經MutanBEST kit處理,轉化大腸桿菌JM109感受態細胞,感受態細胞在含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養基培養過夜后,挑單克隆于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養,后提取質粒,將突變質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受:態細胞,所有質粒均測序正確;
[0051]2)突變體表達與純化:
[0052]挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養生長8~IOh,按4%接種量將種子發酵液接到含100 μ g/mL氨節青霉素的TB液體培養基;大腸桿菌在30°C搖床培養至OD6tltl = 0.6,加入0.01mM終濃度的IPTG誘導胞外表達,并在25°C搖床繼續培養發酵90h后,將發酵液于4°C、1000Orpm離心20min除菌體,收集上清液。
[0053]上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜,4°C、10000rpm離心20min,取沉淀物用適量含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩沖液A溶解,并在緩沖液A中透析過夜后,通過0.22 μ m膜過濾后制成上樣樣品;Ni親和柱用緩沖液A平衡后,將上樣樣品吸入Ni柱,使之完全吸附后,分別用A、含20-480mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A的洗脫,流速lmL/min,檢測波長為280nm,分部收集含CGTase酶活的洗脫液;活力組分在50mM磷酸鈉緩沖液(pH = 6)中透析過夜后,分別得到純化突變體酶Y195S,Y260R, Q265K,Y195S/Y260R, Y195S/Q265K, Y260R/Q265K 和 Y195S/Y260R/Q265K。
[0054]實施例3:本實施例說明酶活分析及AA-2G的合成及檢測。
[0055]I)酶活測定方法:
[0056]甲基橙法測定α-環化活力的方法:取適當稀釋的酶液0.lmL,加入裝有0.9mL預先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的3%可溶性淀粉溶液中,在40°C下反應10min后,加入1.0mLl.0M的鹽酸停止反應,再加入1.0mL用50mM磷酸緩沖液配制的0.1mM甲基橙,在16°C下保溫20min,在505nm下測定吸光度。一個酶活單位定義在該條件下每分鐘生成
I μ mol α -環糊精所需酶量。
[0057]淀粉水解活力測定方法:將適量的酶液加入到含I %可溶性淀粉的50mM磷酸緩沖液
[0058]
【權利要求】
1.一種麥芽糊精底物特異性提高的環糊精糖基轉移酶,以Genbank AF047363.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶為出發序列,其特征在于第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K。
2.一種獲得權利要求1所述環糊精葡萄糖基轉移酶的方法,其特征在于以GenbankAF047363.1公布的基因為出發基因,將該基因編碼的環糊精轉移酶的第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K。
3.產權利要求1所述環糊精葡萄糖基轉移酶的基因工程菌或轉基因細胞系。
4.權利要求3所述產環糊精葡萄糖基轉移酶基因工程菌的構建方法,其特征在于包括如下步驟: 1)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼權利要求1所述環糊精葡萄糖基轉移酶基因; 2)將步驟I)獲得的環糊精葡萄糖基轉移酶基因連接到大腸桿菌表達載體,得到重組表達載體; 3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)得到基因工程菌。
5.權利要求3所述的基因工程菌,其特征在于所述表達載體為pET-20b(+)。
6.應用權利要求3所述基因工程菌發酵生產環糊精葡萄糖基轉移酶的方法,其特征在于以產環糊精葡萄糖基轉移酶突變體的基因工程菌為生產菌株,活化后按4%接種量將種子發酵液接到含1 00 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養基;大腸桿菌在30°C搖床培養至OD600 = 0.6,加入0.0ImM終濃度的IPTG誘導胞外表達,并在25°C搖床繼續培養發酵90h后,將發酵液于4°C、1000Orpm離心20min除菌體,收集富含環糊精葡萄糖基轉移酶的上清液。
【文檔編號】C12N9/10GK104004724SQ201410271721
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年12月10日 優先權日:2012年12月10日
【發明者】陳堅, 堵國成, 劉龍, 李江華, 韓瑞枝 申請人:江南大學