長牡蠣Poly(I:C)應激實驗熒光定量的內參基因及其引物和應用的制作方法
【專利摘要】本發明為長牡蠣Poly(I:C)應激實驗熒光定量的內參基因及其引物和應用，涉及分子生物學領域，具體地說是長牡蠣聚肌苷酸聚胞苷酸應激實驗熒光定量內參基因的篩選。本發明篩選出的β-actin、GAPDH和RS18是Poly(I:C)應激實驗中，牡蠣血細胞內表達最穩定的3個內參基因。這3個內參基因在Poly(I:C)應激實驗中，表達的穩定性優于候選的另外的七個內參基因(包括常用的28S?rRNA和Elongation?factor-1α)，因此可以同時使用做為熒光定量內參基因，能為長牡蠣Poly(I:C)應激實驗中獲得功能基因表達的精確定量數據提供有力支持。
【專利說明】長牡蠣Poly(l:C)應激實驗熒光定量的內參基因及其引物和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，具體地說是長牡蠣聚肌苷酸聚胞苷酸(簡稱聚肌胞,Polyinosinic-polycytidylic acid, Poly (1: C))應激實驗中進行功能基因表達分析的內參基因的篩選。
【背景技術】
[0002]長牡販(Crassostrea gigas),也稱太平洋牡販(Pacific oyster),屬于瓣觸綱(Bivalvia),珍珠貝目(Pter1ida),牡販科,是冠輪動物(Lophotrochozoa)中軟體動物門(Mollusca)內的重要分支。其肉質肥嫩，鮮美可口，營養豐富，具有很高的經濟價值，是世界上重要的水產養殖對象。自然分布于日本、中國和韓國，為世界性廣布種。太平洋牡蠣作為貝類的“模式種”，一直受到科學家們的廣泛重視，尤其是近來長牡蠣基因組序列的破譯引起更廣泛的關注。
[0003]長牡蠣天然免疫系統一直是科學家們感興趣的領域。牡蠣開放的循環系統，每天都要面對潮間帶各種病原菌的挑戰，而牡蠣卻能應付自如，其體內必然存在完備精細的天然免疫系統。病原菌及相關病原分子應激實驗是近年來研究免疫基因對病原菌或相關分子響應機制的重要手段，研究者通過對牡蠣成體進行病原菌或其類似物刺激，利用熒光實時定量PCR技術研究免疫基因隨時間對病原菌或其類似物的響應。
[0004]Poly(IiC)是一種人工合成的雙鏈RNA的類似物，由肌苷酸與胞苷酸多聚而成，是一種免疫增強劑。由于Poly(1:C)與一些病毒的雙鏈RNA在結構上相似，它的鈉鹽可以用來模擬病毒感染，啟動抗病毒的免疫反應。因此，Poly(1:C)經常被用做刺激源進行免疫學研究，以探索生物個體對病毒的響應機制。
[0005] 熒光實時定量PCR(qRT-PCR)具有操作簡單，成本較低，靈敏度高的優勢，經常被用來研究目的基因的表達。一些對宿主對病原菌應激反應的研究，其轉錄水平的研究常常基于qRT-PCR實驗。而相對熒光定量實驗需要表達穩定的管家基因作為內參。管家基因是典型的組成性基因，在穩態或是病原應激的細胞中，管家基因都能相對較穩定表達。但是在不同的實驗條件下，管家基因的表達量還是有差異的。因此確定穩定表達的管家內參基因對獲得準確的qRT-PCR實驗結果是非常重要的。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是篩選長牡販(Crassostrea gigas) Poly (1: C)應激實驗突光定量的內參基因。即，基于熒光定量PCR中的相對定量法在長牡蠣Poly (1:C)應激實驗中對免疫基因及其他功能基因進行定量分析所用的基因熒光定量內參基因及其引物。
[0007]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0008]篩選出長牡蠣Poly(I = C)應激實驗熒光定量的內參基因:長牡蠣Poly(I = C)應激實驗中三個內參基因為β-actin，具有序列表SEQ ID No:1中堿基序列和GAPDH具有序列表SEQ ID No:2中喊基序列，RS18內參基因具有序列表SEQ ID No:3中喊基序列。
[0009]長牡蠣Poly (1:C)應激實驗熒光定量的內參基因的應用，所述貝類基因β-actin, GAPDH與RS18在長牡蠣Poly (1:C)應激實驗樣品中穩定表達(即，表達量變化小)，能夠在相對定量法實時熒光定量PCR中作為內參基因。
[0010]所述長牡蠣Poly (1: C)應激實驗熒光定量的內參基因的應用，同時使用三個穩定表達的管家基因作為基因內參；三個基因內參的表達量Ct值為各基因在應激實驗樣品中的表達量Ct值的算術平均數；通過該三基因內參校正上樣過程中的實驗誤差，能夠提高實驗的準確性。
[0011]β -actin的特異性引物為:
[0012]β -actin-F:5> -GTGCTACGTTGCCCTGGACTT-3，
[0013]β-actin-R:5，-TCGCTCGTTGCCAATGGTGAT-3，；
[0014]GAPDH的特異性引物為:
[0015]GAPDH-F: 5，-TTCTCTTGCCCCTCTTGC-3，
[0016]GAPDH-R: 5，-CGCCCAATCCTTGTTGCTT-3，；
[0017]RS18的特異性引物為:
[0018]RS18-F: 5，-GCCATCAAGGGTATCGGTAGAC-3 ’
[0019]RS18-R: 5，-CTGCCTGTTAAGGAACCAGTCAG-3，。
[0020]具體步驟為:
[0021]a.候選內參基因序列的獲得:選取長牡蠣熒光定量PCR常用5個的內參基因Elongat1n factor-1α，β -actin, 18S rRNA, 28S rRNA 和 Glyceraldehyde3_phosphatedehydrogenase (GAPDH),以及在牡販幼蟲發育過程中表達穩定的內參Ribosomalproteinl8 (RS18)和Ribosomal protein L7 (RL7),另外3個從牡販基因組中獲得的人的管家基因的同源基因 S-phase kinase-associated proteinl (SKPl) ,Heterogeneous nuclearribonucleoprotein Q (HNRQP)和 Ubiquitin-conjugating enzyme E2D2 (UBCDl)共 10 個基因作為內參基因的候選基因。
[0022]b.引物設計:根據獲得的候選基因序列設計該基因相應的特異引物(擴增產物單一，具體為溶解曲線峰單一，3%的瓊脂糖膠檢測條帶單一)。
[0023]c.PCR模板的準備:收集樣品后,用TRIzol (試劑,市購于Life Technologies公司)提取總 RNA,用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect RealTime)(試劑盒，市購于TaKaRa公司)按照說明書反轉成雙鏈cDNA。作為熒光定量PCR的模板。
[0024]d.熒光定量PCR反應:以反轉的cDNA為模版，用內參基因相應的特異引物在ABI7500FAST real-time PCR儀中進行擴增。獲得各個基因的表達數據Ct值。
[0025]e.根據所得Ct值通過GeNorm v3.4軟件計算，篩選出表達最穩定的內參管家基因并確定最優內參基因數目。
[0026]本發明具有如下優點:
[0027]1.本發明首次從多達十種候選內參基因中篩選出Poly(1:C)應激實驗中表達最穩定的內參基因，數據真實可靠。
[0028] 2.篩選出的內參基因適用于長牡蠣Poly(1:C)應激實驗中免疫相關基因或其他功能基因的表達分析，能顯著提高所得數據的準確性。其應用較為普遍，操作相對簡單，成本較低，靈敏度高，精確度高。
[0029]3.本研究篩選出的的三個內參基因是經過嚴格的內參篩選程序選出的，是長牡蠣在Poly (1:C)應激條件下表達最穩定的內參基因。
【專利附圖】
【附圖說明】
:
[0030]圖1.GeNorm軟件計算出的各內參管家基因表達穩定值；
[0031]圖2.GeNorm通過成對變異系數(Vn/Vn+1)確定最適合的內參基因的數目。
【具體實施方式】
[0032]下面的實施例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。本發明所采用實驗用品均來自市購，所用英文標記均為產品包裝名稱。
[0033]z序列表(I)SEQ ID NO:1 的f目息 β ~actin 某因
[0034]序列特征長度:1423bp
[0035]類型:核酸
[0036]鏈型:雙鏈
[0037]拓撲結構:線形
[0038]分子類型:DNA
[0039]特性名稱:β-actin
[0040]來源:長牡蠣
[0041]序列描述:牡蠣β-actin基因全長，基因編號AF026063
【權利要求】
1.長牡蠣Poly(I= C)應激實驗熒光定量內參基因，其特征在于:內參基因為β-actin、GAPDH和RS18 ;其中內參基因β-actin具有序列表SEQ ID No:1中堿基序列，內參基因GAPDH具有序列表SEQ ID No:2中堿基序列，內參基因RS18具有序列表SEQ ID No:3中堿基序列。
2.—種權利要求1所述的應用，其特征在于:長牡蠣Poly(1:C)應激實驗中采用內參基因定量，采用所述長牡蠣基因β -actin, GAPDH和RS18能夠在相對定量法實時熒光定量PCR中作為內參基因。
3.一種權利要求1所述P-actin、GAPD!^PRS18內參基因的特異性引物，其特征在于:所用內參基因β-actin的特異性引物為:
β -actin-F:5’ -GTGCTACGTTGCCCTGGACTT-3’
β -actin-R:5> -TCGCTCGTTGCCAATGGTGAT—3，； 所用內參基因GAPDH的特異性引物為:
GAPDH-F:5， -TTCTCTTGCCCCTCTTGC-3，
GAPDH-R:5’ -CGCCCAATCCTTGTTGCTT-3’ ； 所用內參基因RS18的特異性引物為:
RS18-F:5 ’ -GCCA TCAAGGGTATCGGTAGAC-3，
RS18-R:5，-CTGCCTGTTAAGGAACCAGTCAG-3，。
【文檔編號】C12N15/11GK104073557SQ201410257711
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月11日 優先權日:2014年6月11日
【發明者】黃寶玉, 張琳琳, 李莉, 張國范 申請人:中國科學院海洋研究所