表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒及其應用，屬于表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒的拯救和應用領域。本發明通過重疊PCR方法將螢火蟲熒光素酶基因克隆到豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆pBRCISM的Npro蛋白編碼區內，利用基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作技術拯救了一株穩定表達螢火蟲熒光素酶基因的重組病毒CSFV-NproFluc，其微生物保藏編號為：CGMCC?No.9058。本發明重組豬瘟病毒所攜帶的熒光素酶基因在連續傳代過程中穩定遺傳，豬瘟病毒感染性沒有發生變化，在抗體效價測定以及高通量篩選豬瘟病毒特異性抑制劑等方面有廣泛的應用前景。
【專利說明】表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及重組豬瘟病毒，尤其涉及一株表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒，本發明還涉及該重組豬瘟病毒在抗體效價測定和篩選豬瘟病毒特異性抑制劑中的應用，屬于表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒的拯救和應用領域。
【背景技術】
[0002]豬痕(classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(classical swine fevervirus, CSFV)引起的一種接觸性、致死性傳染病，以高熱和出血為其典型特征，發病率和死亡率極高，被世界動物衛生組織(OIE)列為必須申報的動物疫病。豬瘟對養豬業危害嚴重，常造成巨大經濟損失，也是中國計劃要消滅的重大動物疫病之一。目前，對豬瘟疫情的防控主要是通過對感染豬進行嚴格撲殺和對周邊地區進行消毒防疫。
[0003]豬痕病毒(CSFV)是黃病毒科(Flaviviridae)痕病毒屬(Pestivirus)的成員，CSFV基因組為單股正鏈線性RNA分子，基因組大小為12.3kb，兩端分別為5'端非翻譯區(untranslated region, UTR)和 3'端 UTR,中間包含一個大的開放閱讀框(open readingframe，0RF)，其中ORF編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白。該多聚蛋白在病毒感染的宿主細胞內，受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解為11種病毒特異性蛋白，包括4種病毒結構蛋白(C、Ems、El和E2)和7種非結構蛋白(NpM、P7、NS2_3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B) (Moen nig, V., 2000.1ntroduction to classical swine fever: virus, diseaseand control policy.Vet.Microbiol.73, 93 - 102.)。
[0004]反向遺傳操作技術的建立為研究CSFV基因功能和新型疫苗開辟了新的途徑。利用反向遺傳操作技術將外源標簽插入病毒基因組可以用來研究病毒的復制、病毒編碼蛋白的功能及抗病毒藥物的篩選(Beer, M., Reimann, 1., Hoffmann, B., Depner, Κ., 2007.Novelmarker vaccines against classical swine fever.Vaccine25, 5665 - 5670.)。例如，攜帶增強型綠色熒光蛋白的CSFV可用于病毒感染的快速檢測和中和抗體效價的測定(Li，Y.，Shen, L., Sun, Y., Yuan, J., Huang, J., Li, C., Li, S., Luo, Y., Qiu, H.J., 2013.Simplified serumneutralization test based on enhanced green fluorescent protein-tagged classicalswine fever virus.J.Clin.Microbiol.51, 2710 - 2712.)。但是，綠色突光蛋白的檢測需要通過借助熒光顯微鏡進行判斷，因此在高通量篩選方面受到了限制。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是拯救一株能夠穩定表達螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase, Flue)基因的重組CSFV，該穩定表達螢火蟲熒光素酶的重組CSFV能夠快速檢測CSFV的復制并能高通量篩選抗豬瘟病毒因子，解決現有技術中用綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒的檢測需要借助熒光顯微鏡進行判斷以至在高通量篩選方面受到限制等問題。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案為:[0007]本發明通過重疊PCR方法將螢火蟲熒光素酶基因克隆到豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆pBRCISM的Npro編碼區內第412位堿基和第413位堿基之間(即ΝΡ11'°蛋白第13位和第14位氨基酸之間)，構建出含有Fluc基因的CSFV全長感染性克隆，命名為pBRCISM-NproFluc ;利用基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作技術用pBRCISM_Npir°Fluc拯救出
5株攜帶 Fluc 基因的重組豬瘟病毒，即:CSFV-NpMFluc、CSFV-NproFluc-U CSFV-NproFluc-2,CSFV-NproFluc-3 和 CSFV-NpMFluc_4，其中重組病毒 CSFV_Npir°Fluc 在所表現出的 Fluc 活性以及遺傳穩定性方面明顯優于另外4株重組豬瘟病毒；本發明將性能最為優異的重組豬瘟病毒CSFV-Np1:°Fluc提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為=CGMCC N0.9058 ；分類命名為:表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒。保藏單位:中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2014年4月11日；保藏地址:中國北京朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0008]本發明還提供了拯救攜帶Fluc基因的重組病毒CSFV-Npn5Fluc的方法，包括以下步驟:
[0009](I)擴增 Fluc 基因；
[0010](2)擴增CSFV病毒第215-412位堿基和第413-684位堿基之間的基因片段；
[0011](3)通過重疊PCR將步驟⑴和⑵的擴增片段融合，獲得融合片段Fluc-N_ ；
[0012](4)將步驟(3) 獲得的融合片段FIuc-Npm克隆至豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆中，構建出含有Fl uc基因的CSFV全長感染性克隆，命名為pBRCISM-NpmFIuc ；
[0013](5)將質粒pBRCISM-NpmFIuc轉染SK6細胞，將細胞傳代后，收獲病毒，即得。
[0014]其中，步驟⑶中重疊PCR所用引物序列為SEQ ID N0.1-6所示；步驟⑷中所用豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆為pBRCISM ;步驟(4)中用XhoI和AgeI雙酶切融合片段Fluc-Npn5和豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆。
[0015]本發明通過間接免疫熒光試驗(IFA)和RT-PCR方法均顯示重組病毒CSFV-NproFluc拯救成功。測定病毒生長曲線后發現該重組病毒與親本病毒Shimen株相比，病毒滴度下降了近10倍。該重組病毒在兩種豬源細胞系(PK-15和SK6)上連續傳代的過程中，其所攜帶的Fluc基因并沒有發生丟失，且在傳代的過程中病毒滴度和表達Fluc基因能力未發生明顯變化，證明了該重組病毒的遺傳穩定性。
[0016]通過在不同時間點檢測CSFV-Npn5Fluc的Fluc活性發現，在感染重組病毒后4.5h檢測到CSFV Npm蛋白的表達。Western blot檢測結果表明，在CSFVHluc感染SK6細胞12h后，可以檢測到預期大小的Npm-FIuc融合蛋白。隨著感染時間的延長，目的蛋白免疫染色的信號強度逐漸增大，同Fluc活性增強的趨勢相同。
[0017]CSFV基因組為12.3kb，其允許外源基因插入的容量是未知的。本發明插入的Fluc基因(1653bp)片段較大，是EGFP基因(717bp)的兩倍多，在CSFV基因組中引入較大基因片段能否成功拯救病毒、乃至所拯救的重組病毒是否保持親本病毒的特性具有不可預見性。
[0018]本發明以相同的方法通過重疊PCR將F1UC-FMDV2A融合基因引入豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆pBRCISM的Npro蛋白編碼序列之前，構建出含有Fluc基因的CSFV全長感染性克隆，命名為pBRCISM-Fluc2A ;利用基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作技術，將pBRCISM-Fluc2A轉染SK6細胞，但是未能拯救出重組豬瘟病毒。
[0019]本發明以相同的方法通過重疊PCR將Fluc基因引入豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆pBRCISM的NS5A編碼序列之中(即NS5A蛋白第3166位和第3167位氨基酸之間)，構建出含有Fluc基因的CSFV全長感染性克隆，命名為pBRCISM-NS5A-Fluc。利用基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作技術，用pBRCISM-NS5A-Fluc轉染SK6細胞，同樣也未能拯救出
重組豬瘟病毒。
[0020]本發明還提供了攜帶Fluc基因的重組病毒CSFV-NpmFIuc在抗體效價測定中的應用。
[0021]本發明用該重組病毒對免疫攻毒后的50份豬血清進行了中和試驗，結果表明，CSFV-Fluc-NT測定的抗CSFV中和抗體滴度與由IDEXX-ELISA測定的抗體阻斷率呈現良好的相關性(R2 = 0.9194)，表明CSFV-NpmFIuc可以用來定量檢測中和抗體。
[0022]本發明還提供了攜帶Fluc基因的重組病毒CSFV-NpmFIuc在篩選CSFV特異性抑制劑中的應用。
[0023]本發明用該重組病毒測定了 12個針對CSFV基因組不同區域的siRNA的干擾效果。結果表明，利用該重組 病毒成功的篩選出了 3個對CSFV復制具有較強干擾效果的SiRNA分子。
[0024]與傳統的CSFV中和試驗(CSFV-wt-NT)相比，CSFV_Fluc_NT具有較多優勢。首先，CSFV-Fluc-NT無抗體的孵育和染色程序，從而可以節省時間；其次，CSFV-Fluc-NT中Fluc活性的測定可以在儀器上快速進行，并不需要用目視判定結果的IFA。此外，CSFV-Fluc-NT可以在冷凍儲存板(細胞裂解后)儲存3d后進行，也可以用于批量分析。本發明拯救的CSFV-NproFluc適用于高通量篩選抗病毒藥物。
[0025]本發明所涉及到的術語定義
[0026]除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0027]術語“反向遺傳操作技術”意指通過構建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上對病毒基因組進行體外人工操作，如進行基因點突變、缺失、插入、顛換、轉位和互補等改造，以此來研究RNA病毒的基因復制與表達調控機理、RNA編輯和自發重組與誘導重組、病毒與宿主間的相互作用關系、抗病毒策略、基因治療研究，以及構建新型病毒載體來表達外源基因和進行疫苗的研制等。
[0028]術語“基因組”意指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子(部分病毒是RNA)。
[0029]術語“核苷酸序列”意指DNA或RNA中堿基的排列順序。
[0030]術語“疫苗”意指將病原微生物(如細菌、立克次氏體、病毒等)及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。
[0031]術語“轉染”意指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程。
[0032]術語“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒價，衡量病毒滴度的單位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)、半數致死量(LD5tl)和半數組織感染量(TCID5tl)。
[0033]術語“免疫”意指機體免疫系統識別自身與異己物質，并通過免疫應答排除抗原性異物，以維持機體生理平衡的功能。
[0034]術語“中和抗體”意指當病原微生物侵入機體時會產生相應的抗體，能夠與病原微生物表面的抗原結合，從而阻止該病原微生物黏附靶細胞受體，防止侵入細胞。[0035]術語“抗血清”意指一種含有多克隆抗體的血清。
[0036]術語“傳代”意指當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養液的過程，否則將影響細胞的繼續生存。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1 為 pBRCISM (A)、pBRCISM-NproFluc (B)、pBRCISM-Fluc2A (C)和pBRCISM-NS5A-Fluc(D)的構建示意圖；
[0038]圖2為CSFV-NpmFIuc的Fluc基因表達的動力學；
[0039]圖3為用RT-PCR檢測CSFV-NpmFIuc在SK6細胞上連續傳代過程中不同代次(PO、PU P2、P3、P8、P9 和 P10)病毒基因組中的 Fluc-Npr。基因；M1:DL_15, 000DNA marker ;P0、P1、P2、P3、P8、P9和PlO =CSFV-NproFluc在傳代過程中基因組中的FIuc-Npm基因的RT-PCR檢測；Shimen:親本病毒Shimen株基因組中的Npm基因的RT-PCR檢測；NT:為陰性對照(Negative control)，即不加 RNA 模板進行 RT-PCR 檢測；M2:DL-2000DNA marker ；
[0040]圖4為IFA測定CSFV-NpmFIuc在連續傳代過程中的病毒滴度；
[0041]圖5為測定CSFV-NpmFIuc在連續傳代過程中表達的Fluc活性；
[0042]圖6為CSFV-NpmFIuc的免疫熒光試驗檢測結果；
[0043]圖7為CSFV-NpmFIuc與親本病毒Shimen株的生長曲線；*，p < 0.05 ；
[0044]圖8為用Western blot檢測Npio-FIuc融合蛋白的表達；
[0045]圖9 為 CSFV-NproFluc 表達 Fluc 活性的最早時間;**，p < 0.01 ;*** ;p < 0.001 ;
[0046]圖10為CSFV-Fluc-NT和IDEXX-ELISA檢測中和抗體滴度的相關性分析；
[0047]圖11為CSFV-NpmFIuc用于抗病毒siRNA的篩選結果；#，p < 0.01 ；
[0048]圖12為CSFV-NpmFIuc對于不同濃度抗病毒siRNA的劑量依賴性分析結果；
[0049]圖13為siRNA對親本病毒Shimen株的抑制效果驗證結果；**, p < 0.01。
【具體實施方式】
[0050]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0051]1、實驗材料
[0052]CSFV石門(Shimen)株(GenBank登錄號AF092448.2)和PK-15細胞由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室保存；SK6細胞由瑞典國家獸醫研究所Lihong Liu博士惠贈。
[0053] 包含Fluc基因的質粒pGEM-luc購自Promega公司；pMD18_T Simple載體購自TaKaRa公司；CSFV Shimen株的全長感染性克隆pBRCISM由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室構建和保存。針對CSFV E2蛋白的單克隆抗體和抗Npm蛋白的血清由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室制備和保存；抗β -tubulin單克隆抗體和FITC標記的羊抗鼠IgG購自Sigma公司。
[0054]雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；中和試驗所用血清來源于用嵌合載體疫苗rAdV-SFV-E2免疫、用親本病毒Shimen株攻毒后的試驗豬(Sun，Y.，Tian，D.Y.，Li，S.，Mengj Q.L.，Zhao, B.B.，Li，Y.，Li，D.，Ling, L.J.，Liao, Y.J.，Qiuj H.J.,2013.Comprehensive evaluation of the adenovirus/alphavirus-repliconchimeric vector-based vaccine rAdV-SFV-E2against classical swine fever.Vaccine31, 538 - 544.)。
[0055]實施例1攜帶Fluc基因的重組CSFV的拯救
[0056]1、實驗方法
[0057]1.1攜帶Fluc基因的全長感染性克隆的構建
[0058]根據pGEM-luc 質粒中 Fluc 基因設計引物 NpMFluc-2_F/Npir°Fluc-2-R(表 I)，以該質粒為模板擴增Fluc基因；根據親本病毒Shimen株全長序列設計引物NpmFIuc-1-F/NproFluc-1-R 和 Npir°Fluc-3-F/Npir°Fluc-3-R(表 I)，用這兩對引物分別擴增病毒第 215-412位堿基和第413-684位堿基之間的基因片段；最后，以Npjr°Fluc-1-F/NpMFluc-3-R為引物，通過重疊PCR獲得融合片段FIuc-Npm,并將此融合片段FIuc-Npm連至pMD18-TSimple載體進行測序鑒定。
[0059]表1引物名稱及其序列
[0060]
【權利要求】
1.一株表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒，其特征在于:螢火蟲熒光素酶基因插入豬瘟病毒Shimen株Npm蛋白編碼區內第412位堿基和第413位堿基之間。
2.按照權利要求1所述的重組豬瘟病毒，其特征在于，其微生物保藏編號為=CGMCCN0.9058。
3.—種拯救權利要求1或2所述的重組豬瘟病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)擴增螢火蟲熒光素酶基因； (2)擴增豬瘟病毒第215-412位堿基和第413-684位堿基之間的基因片段； (3)通過重疊PCR將步驟⑴和⑵所擴增的基因融合，獲得融合片段FIuc-Npm; (4)將步驟(3)獲得的融合片段FIuc-Npm克隆至豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆中構建得到含有Fluc基因的豬瘟病毒全長感染性克隆質粒； (5)將豬瘟病毒全長感染性克隆質粒轉染SK6細胞，將細胞傳代后，收獲病毒，即得。
4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(3)中重疊PCR所用引物的序列為SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.6 所示。
5.按照權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(4)中所用豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆為pBRCISM。
6.按照權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(4)中用XhoI和AgeI雙酶切融合片段Fluc-Npn5和豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆。
7.權利要求1或2所述的重組豬瘟病毒在抗體效價測定中的應用。
8.權利要求1或2所述的重組豬瘟病毒在篩選豬瘟病毒抑制劑中的應用。
9.權利要求1或2所述的重組豬瘟病毒在高通量篩選抑制豬瘟病毒復制的藥物中的應用。
【文檔編號】C12Q1/70GK104017779SQ201410252648
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】仇華吉, 申梁, 李永鋒, 孫元, 李素, 羅玉子 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所