同時檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片的制作方法
【專利摘要】本發明涉及同時檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取試劑盒、DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒、DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒、連接有特異探針的基因芯片。本發明僅用100μl腦脊液即可實現多種皰疹病毒、腸道病毒核酸同時提取、擴增和檢測，所需樣本量少，提取快捷，擴增效率高，結果可靠，特異性強，可以實現對上述病毒引起的臨床病毒性腦炎、腦膜炎的早期診斷和治療，解決了目前臨床腦脊液中病毒檢測的瓶頸問題。
【專利說明】同時檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片
【技術領域】
[0001]本發明涉及同時檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，屬于分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]病毒性腦炎、腦膜炎是由病毒感染引起的以中樞神經系統(CNS)損害為主的傳染病，常見的病毒主要包括皰疹病毒科的單純皰疹病毒I型和2型(HSV1和HSV2)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、人巨細胞病毒(HCMV)、人類皰疹病毒6型(HHV6)和7型(HHV7)以及引起手足口病的腸道病毒(EVs)如腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A16型(CoxA16)和柯薩奇B組5型(CoxB5)等。由單純皰疹病毒引起的單純皰疹病毒腦炎是散發性腦炎及腦膜炎最常見的病原體，若不及時用無環鳥苷進行抗病毒治療，則死亡率可高達70%.而近年亞洲地區流行的手足口病，規模呈上升趨勢，并發重癥CNS感染而導致死亡的病例也逐漸增多，可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎、急性脊髓灰質炎樣麻痹、腦脊髓炎、神經源性肺水腫，甚至導致死亡，重癥存活患者常伴有神經系統后遺癥。
[0003]由于不同的病毒感染，病變范圍、程度相差懸殊，臨床表現十分復雜，缺乏特異性，給診斷帶來困難，確診的主要依據是腦脊液的病原學診斷，但腦脊液中病毒含量甚低，其病毒培養檢測不但費時、費力，而且敏感性和特異性很差，遠遠不能滿足臨床要求，嚴重滯后于臨床治療；而組織學和免疫學檢測方法需要在疾病中后期取材才可能得到陽性結果，由此延誤治療造成該類疾病的死亡率居高不下或病后嚴重的后遺癥，對人民身體健康和生命質量造成嚴重危害。
[0004]分子生物學技術的發展為解決這一難題提供了條件，PCR是一種簡便和快速的體外DNA擴增技術，是以樣本中的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，特異性地在體外擴增所需要的目的基因，以檢測DNA病毒；RT-PCR技術是在PCR技術基礎上建立起來的，以樣本中的RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，反轉錄成cDNA后，再以cDNA為模板進行PCR擴增，以檢測RNA病毒的感染。兩者因其簡便、快速、靈敏、特異等優點已成為生物醫學領域最有價值的研究手段和病毒學診斷的金標準。皰疹病毒為一組有包膜的DNA病毒，而包括手足口病毒在內的腸道病毒是一組正義單鏈RNA病毒，由于DNA病毒和RNA病毒基因組核酸提取方法及擴增程序都不同，目前所建立的檢測腦脊液皰疹病毒和腸道病毒的方法仍需將DNA病毒與RNA病毒分別進行核酸提取，DNA病毒的核酸提取多采用蛋白酶K/酚-氯仿-異戊醇提取法，再將提取的DNA進行PCR擴增；RNA病毒的核酸提取多采用Trizol/氯仿-異丙醇提取法，再將提取的RNA進行RT-PCR檢測。
[0005]中國專利文獻CN103614371A(申請號201310594174.0)公開了一種同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法,該發明公開了一種同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步驟:對待提取物使用異硫氰酸胍裂解液裂解；硅膠膜吸附RNA ;洗液I除去雜蛋白；洗液II洗去雜質；DEPC水洗脫核酸；上述異硫氰酸胍裂解液包括 3-7M 異硫氰酸胍、0.6% -1.0% TriTon-100,30-50mM Tris-Cl、5_15mMDTT,60-90y g/mL 蛋白酶 K、10_30mM EDTA, PH 在 4.3-4.6 ;上述洗液 I 包括 5-6M 鹽酸胍，53-59%無水乙醇，Κ70-90μ g/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6 ;上述洗液II包括70-80%乙醇。該發明的優點在于提取過程簡單、周期短、成本低、能同時提取動物血清樣本、雙拭子樣本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
[0006] 雖然上述文獻公開了同時提取DNA和RNA的方法，但所含試劑多、成分復雜、操作較為繁瑣，更重要的是該方法僅針對動物血清及雙拭子樣本中的RNA病毒和DNA病毒核酸，因這些樣本通常含有的RNA病毒和DNA病毒核酸濃度較高，易于提取分離，但如應用于病毒含量較低的腦脊液樣本，可造成腦脊液本身低濃度的病毒丟失使結果呈現假陰性，因而不適宜腦脊液中病毒的提取。
【發明內容】
[0007]本發明針對現有技術的不足，提供一種同時檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，僅通過一次提取、擴增和雜交即可同時檢測出腦脊液中上述病毒的靶基因，時間僅需
5.5小時。
[0008]本發明技術方案如下:
[0009]一種同時檢測腦脊液中人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取試劑盒、DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒、DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒、連接有特異探針的基因芯片；其特征在于:
[0010]所述的DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒中的引物由Biotin-HHVl，2，4，5-f、HHVI, 2，5-r、HHV4_r、Biotin-EV-f和EV_r五種引物混合，核苷酸序列分別如下:
[0011]HHV1, 2, 4, 5-f:5/ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3'；
[0012]HHV1,2,5-r: 5' -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3'；
[0013]HHV4-r:5' -GAGCTCCACCCCCTTCATC-3'；
[0014]EV-f:5' -TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3'；
[0015]EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3 ；
[0016]其中HHVl, 2，4，5-f 為擴增 HSV1、HSV2、EBV, CMV 的上游引物；
[0017]HHVl, 2，5-r 為擴增 HSV1、HSV2、CMV 的下游引物；
[0018]HHV4-r為擴增EBV的下游引物；
[0019]Biotin-HHVl, 2，4，5-f 和 Biotin-EV-f 為在兩條上游引物 HHV1, 2，4，5-f 和 EV_f的5’端添加生物素Biotin作為標記物；
[0020]所述的特異性探針分為腸道病毒特異性探針和人類皰疹病毒特異性探針，腸道病毒特異性探針序列如下:
[0021 ] EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA ；
[0022]CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG ；
[0023]CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG ；
[0024]人類皰疹病毒特異性探針序列如下:
[0025]HSV1-P:GGCACAGCACAAAGATGGA ；
[0026]HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA ；
[0027]HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG ；[0028]HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG。
[0029]根據本發明優選的，所述核苷酸提取試劑盒中的提取裂解液，每百毫升組分如下:
[0030]硫氰酸胍47.264g, N-月桂酰肌氨酸0.5g, 二硫蘇糖醇15.425mg,梓檬酸鈉736.25mg，糖原 IOmg, DEPC_ddH20 加至 100mL ；
[0031]根據本發明優選的，所述的DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒中的特異性逆轉錄引物序列如下:
[0032]EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3'；
[0033]根據本發明優選的，所述的DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒，反應體系如下:
[0034]5XRT Buffer2y I, RT Enzyme Mix0.5 μ 1，2 μ M 特異性逆轉錄引物 0.5 μ 1，核酸模板 2 μ I，DEPC-ddH20 加至 10 μ I。
[0035]逆轉錄試劑盒除引物外的其它試劑也可采用本領域市售產品。
[0036]根據本發明優選的，所述的DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒中，PCR擴增反應體系如下:
[0037]IOXPCR Bufferl.5 μ I, dNTP(10mM each) 0.4 μ 1，MgCl2 (IOmM) 0.6 μ 1，混合引物10.4 μ 1，PCR 模板 1.Ομ I, Taq 聚合酶 0.5μ 1，加 ddH20 至 15μ I。
[0038]根據本發明優選的，所述的PCR擴增的引物由Biotin-HHVl，2，4，5-f,HHVl, 2，5-r、HHV4-r、Biotin-EV-f 和 EV-r 五種引物按摩爾比 4.5:0.6:0.2:4.5:0.6 的比
例混合。
[0039]本發明所應用的雜交緩沖液、洗漆液和Cy3_Streptavidin溶液為普通市售試劑。
[0040]利用上述基因芯片同時檢測腦脊液中人類皰疹病毒及腸道病毒的方法，步驟如下:
[0041](I)取腦脊液100μ 1，加入200 μ I硫氰酸胍核酸提取裂解液，渦旋振蕩器混勻30sec，室溫靜置IOmin ；
[0042](2)加入250 μ I預冷的異丙醇，冰上放置5min ;12000rpm,4°C離心10min ;棄上清，DEPC配制的體積百分比為75%乙醇750μ I洗滌沉淀，12000rpm，4°C離心10min ;風干，
10μ I DEPC-ddH20溶解后做為核酸模板；
[0043](3)取步驟(2)制得的核酸模板，利用DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒進行RT-PCR，制得逆轉錄反應產物；
[0044]RT-PCR 反應體系:
[0045]5 X RT Buffer2 μ I，加入 RT Enzyme Mix0.5 μ I，2 μ M 特異性逆轉錄弓丨物 0.5 μ I，核酸模板2 μ 1，DEPC-ddH20加至10 μ 1，混勻；
[0046]RT-PCR 反應條件:42°C 15min,85°C 5sec ；
[0047]所述的PCR擴增為非對稱的生物素標記引物擴增，兩條上游引物5’端的標記物為生物素，所用熒光素為Cy3標記的鏈霉親和素； [0048](4)取步驟(3)制得的逆轉錄反應產物為模板，利用DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒進行PCR擴增，制得PCR擴增產物；
[0049]PCR反應體系:
[0050]10XPCR Bufferl.5 μ 1，dNTP(10mM each) 0.4 μ 1，MgCl2 (IOmM) 0.6 μ I，混合引物10.4 μ 1，PCR 模板 1.0 μ 1，Taq 聚合酶 0.5 μ 1，加 ddH20 至 15μ I ；
[0051]PCR反應條件:
[0052]95°C 預變性 5min ;95°C 變性 30sec、58°C退火 30sec、72°C 延伸 30sec，35 個循環；最后72°C延伸5min。
[0053](5)取步驟⑷制得的PCR擴增產物于95 V變性3min，冰中冷卻，與等量雜交緩沖液混勻，與連接有特異分子探針的基因芯片雜交，48 °C避光2h，洗滌之后與Cy3-Streptavidin溶液在室溫反應30min,洗漆,離心干燥,進行掃描分析。
[0054]有益效果
[0055]1、本發明克服了臨床腦脊液樣本中不同DNA、RNA病毒核酸提取和擴增的限制，實現了對腦脊液DNA病毒和RNA病毒基因進行同時提取和擴增，與DNA、RNA分別提取再進行PCR和RT-PCR擴增的結果一致；
[0056]2、本發明僅用100μ I腦脊液即可實現多種皰疹病毒、腸道病毒核酸同時提取、擴增和檢測，所需樣本量少，提取快捷，擴增效率高，結果可靠，特異性強，可以實現對上述病毒引起的臨床病毒性腦炎、腦膜炎的早期診斷和治療，解決了目前臨床腦脊液中病毒檢測的瓶頸問題；
[0057]3、本發明所述的基因芯片可以一次性快速檢測四種皰疹病毒:單純皰疹病毒I型和2型(HSV1和HSV2)、EB病毒(EBV)、人巨細胞病毒(HCMV)，和三種腸道病毒:腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)和柯薩奇B組5型(CoxB5)，具有平行、準確、省時、省力、樣本用量少的特點。
[0058]4、本發明以腦脊液為主要樣本的RNA病毒和DNA病毒核酸提取方法，結合快速擴增及病毒芯片技術，可以實現僅通過一次提取、擴增和雜交即可同時檢測腦脊液中常見的人類皰疹病毒和腸道病毒的靶基因。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0059]圖1、人類皰疹病毒DNA和腸道病毒RNA同時提取擴增與分別提取擴增結果；
[0060]圖中:左側為本發明的DNA/RNA同時提取擴增的結果；右側為DNA、RNA分別提取后再行PCR、RT-PCR的結果；
[0061]其中M為DL-2000DNA Marker ；HSV1為單純皰疹病毒I型；HSV2為單純皰疹病毒2型；EBV為EB病毒；CMV為人巨細胞病毒；EV71為腸道病毒71型；CA16為柯薩奇病毒A組16型；CB5為柯薩奇病毒B組5型。
[0062]圖2、典型樣本的病毒芯片雜交結果；
[0063]其中:1.為HSVl陽性樣本雜交結果；2.為HSV2陽性樣本雜交結果；3.為EBV陽性樣本雜交結果；4.為CMV陽性樣本雜交結果；5.為EV71陽性樣本雜交結果；6.為CA16陽性樣本雜交結果；7.為CB5陽性樣本雜交結果；8.為EBV和CMV雙陽性樣本雜交結果；
[0064]圖3、病毒檢測探針排布圖；
[0065]
【權利要求】
1.一種同時檢測腦脊液中人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取試劑盒、DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒、DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒、連接有特異探針的基因芯片；其特征在于: 所述的DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒中的引物由Biotin-HHVl, 2，4，5_f、HHVI, 2，5-r、HHV4_r、Biotin-EV-f和EV_r五種引物混合，核苷酸序列分別如下:
HHVI, 2，4，5-f:5/ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3'；
HHV1, 2, 5-r: 5' -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3'； HHV4-r:5' -GAGCTCCACCCCCTTCATC-3'； EV-f:5' -TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3'； EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3 ； 其中HHVI, 2，4，5-f為擴增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物； HHVI, 2，5-r為擴增HSV1、HSV2、CMV的下游引物； HHV4-r為擴增EBV的下游引物； Biotin-HHVl, 2， 4，5-f 和 Biotin-EV-f 為在兩條上游引物 HHVI, 2，4，5-f 和 EV-f 的 5，端添加生物素Biotin作為標記物； 所述的特異性探針分為腸道病毒特異性探針和人類皰疹病毒特異性探針，腸道病毒特異性探針序列如下:
EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA ；
CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG ；
CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG ； 人類皰疹病毒特異性探針序列如下:
HSVl-P:GGCACAGCACAAAGATGGA ；
HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA ；
HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG ；
HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG。
2.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述核苷酸提取試劑盒中的提取裂解液，每百毫升組分如下: 硫氰酸胍47.264g,N-月桂酰肌氨酸0.5g, 二硫蘇糖醇15.425mg,檸檬酸鈉736.25mg,糖原 10mg，DEPC-ddH20 加至 100ml。
3.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒中的特異性逆轉錄引物序列如下:
EV-r:5/ -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3'。
4.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒，反應體系如下: 5XRT Buffer2y I, RT Enzyme Mix0.5 μ 1，2 μ M 特異性逆轉錄引物 0.5 μ 1，核酸模板。2 μ I，DEPC-ddH20 加至 10 μ L.
5.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒中，PCR擴增反應體系如下:
IOXPCR Bufferl.5 μ I,每種濃度均為 IOmM 的 dNTP0.4 μ 1，IOmM 的 MgCl20.6 μ 1，混合引物 10.4μ 1，PCR 模板 1.0 μ 1，Taq 聚合酶 0.5 μ 1，加 ddH20 至 15μ I。
6.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的PCR擴增的引物由Biotin-HHVl, 2，4，5-f,HHVI, 2，5_r、HHV4_r、Biotin-EV-f 和 EV-r 五種引物按摩爾比 4.5:.0.6:0.2:4.5:0.6 的比例混合。
7.利用權利要求1所述基因芯片同時檢測腦脊液中人類皰疹病毒及腸道病毒的方法，其特征在于，步驟如下: (1)取腦脊液100μ1，加入200μ I硫氰酸胍核酸提取裂解液，渦旋振蕩器混勻30sec，室溫靜置IOmin ； (2)加入250μI預冷的異丙醇，冰上放置5min ; 12000rpm，4°C離心10min ;棄上清，DEPC配制的體積百分比為75%乙醇750 μ I洗滌沉淀，12000rpm，4°C離心10min ;風干，.10 μ I DEPC-ddH20溶解后做為核酸模板； (3)取步驟(2)制得的核酸模板，利用DNA與RNA同時逆轉錄試劑盒進行RT-PCR，制得逆轉錄反應產物； RT-PCR反應體系 : . 5 X RT Buffer2y 1，加入 RT Enzyme Mix0.5 μ 1，2 μ M 特異性逆轉錄引物 0.5 μ 1，核酸模板 2 μ 1，DEPC-ddH20 加至 10 μ 1，混勻；
RT-PCR 反應條件:42°C 15min，85°C 5sec ； 所述的PCR擴增為非對稱的生物素標記引物擴增，兩條上游引物5’端的標記物為生物素，所用熒光素為Cy3標記的鏈霉親和素； (4)取步驟(3)制得的逆轉錄反應產物為模板，利用DNA與RNA同時PCR擴增試劑盒進行PCR擴增，制得PCR擴增產物； PCR反應體系:
10XPCR Bufferl.5 μ I, dNTP(10mM each) 0.4 μ I, MgCl2 (IOmM) 0.6 μ I,混合弓丨物.10.4 μ 1，PCR 模板 1.0 μ 1，Taq 聚合酶 0.5 μ 1，加 ddH20 至 15μ I ； PCR反應條件: . 95°C預變性5min ;95°C變性30sec、58°C退火30sec、72°C延伸30sec，35個循環；最后.72°C 延伸 5min ； (5)取步驟(4)制得的PCR擴增產物于95°C變性3min，冰中冷卻，與等量雜交緩沖液混勻，與連接有特異分子探針的基因芯片雜交，48°C避光2h，洗滌之后與Cy3-Str印tavidin溶液在室溫反應30min，洗滌，離心干燥，進行掃描分析。
【文檔編號】C12Q1/70GK103981289SQ201410249930
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】劉毅, 段春紅, 馬衍輝 申請人:山東大學齊魯兒童醫院