一種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的分子標記及分子標記方法
【專利摘要】本發明涉及一種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的分子標記及分子標記方法，所述分子標記是以小麥基因組DNA為底物，以gwm642-1D為SSR引物，進行PCR擴增所得的擴增片段，用于檢測小麥面粉水溶劑保持力的特性，該標記不同的等位變異能夠解釋該性狀表型變異的10.57-15.68％，其中，分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的提高具有增效作用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的降低具有增效作用。本申請為小麥面粉水溶劑保持力在品質育種中的分子標記輔助選擇提供一條可行的途徑。
【專利說明】一種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的分子標記及分子標記 方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的分子標記及分子標記方法，屬于 作物遺傳育種學領域。
【背景技術】
[0002] 1994年美國Nabisco餅干公司的小麥粉及烘焙專家Slade和Levine提出了軟質 小麥品質評價的新方法-溶劑保持力（solvent retention capacity,簡稱SRC)，該方法 于1999年通過了美國谷物化學協會（AACC)的認定，編號為AACC 56-11。該方法以含水量 14%的面粉為基準，經過離心后，面粉所保持溶劑質量占面粉干重的百分比作為溶劑保持 能力（SRC)。用于檢測的溶劑分為4種，主要有蒸餾水、5%碳酸鈉溶液、5%乳酸溶液以及 50%蔗糖溶液，其中碳酸鈉 SRC與面粉中破損淀粉數量相關，乳酸SRC值與麥谷蛋白特性有 關，蔗糖SRC則與戊聚糖特性有關，而水SRC受面粉中所有成分的影響，其數值大小可以反 映面粉的綜合特性。通過4種SRC檢測，則可以反映面粉更多的理化特性，從而能夠更好地 推斷面粉的烘焙特性。現SRC在美國已成為評價軟麥品質的主導方法。
[0003] 面粉的不同品質特性均可以通過不同的SRC得到反映，其中面粉的面筋特性可以 通過乳酸SRC值大小來評價，在一定范圍內，乳酸SRC值越高則表明軟麥的面筋特性越好； 醇溶蛋白的特性可以通過蔗糖SRC值得到反映，在一定范圍內，蔗糖SRC值低則醇溶蛋白特 性好；破損淀粉的數量則可以通過碳酸鈉 SRC值大小來評價，其值低則表示破損淀粉含量 也較低；而水SRC受面粉中全部成分的影響，反映了面粉組分的綜合特性。因為餅干為低水 分含量的烘焙食品，因此要求原料面粉具有較低的吸水率、淀粉破損率和戊聚糖含量，SRC 檢測則正好彌補了餅干測試的某些不足之處，為餅干品質的評價提供了更多的面粉品質特 性信息。
[0004] 關于SRC值在軟麥（主要是餅干粉）評價中的指標的確定，張岐軍研究后認為根 據我國弱筋小麥特點，其適宜的SRC值范圍為：水SRC、碳酸鈉 SRC、蔗糖SRC和乳酸SRC值 分別為彡53 K 66 K 87 %和77. 9 %?85. 1 %，其中與AACC方法劃分標準較為接近的 為水SRC、碳酸鈉 SRC、蔗糖SRC，而乳酸SRC則與之相反。
[0005] Guttieri等研究結果表明SRC在不同品種間（即基因型間）差異顯著，Guttieri 和Souza等對Vanna/Penawawa, Kantol07/ID0488和M2/ID0470等3個軟麥組合重組自交系 后代群體的研究表明基因型是影響SRC值的主要因素。張岐軍等研究結果也表明影響SRC 值的主要因素為基因型，除個別指標外，基因型X環境間互作對SRC影響均不顯著，因此與 蛋白含量作為弱筋小麥的品質選擇指標相比以SRC值來篩選弱筋品種則更為可靠。夏云祥 研究結果表明決定SRC值的主要因素仍是基因型，不同環境對WSRC影響較小。
[0006] 在小麥SRC值的QTL定位研究方面，N. Smith和E. Souza 2008年利用187個選自 美國軟麥實驗室資源庫的品種，采用關聯分析的方法定位了分別與碳酸鈉 SRC、乳酸SRC、 鹿糖SRC、餅干直徑等相關聯的分子標記barc98、gwm429、barc010和barclOl等，這些標記 均位于2B染色體上。馬慶利用寧7840/Clark的重組自交系群體材料進行了 SRC的QTL定 位研究，在染色體5DS上發現了 1個與WSRC相關的QTL，在?、6D染色體上定位出2個與乳 酸SRC相關的QTL，加性效應分別為4. 7和-5. 4,各自解釋了 11. 5 %和15. 2 %的表型變異。 在4D染色體上發現與碳酸鈉 SRC相關的QTL 1個，加性效應1. 4,貢獻率為12. 2 %。在染色 體5A和?上分別發現與蔗糖SRC相關的QTL各1個，這兩個QTL的加性效應分別為-2. 84 和2. 71，各自解釋15. 9%和9. 9%的表型變異。
[0007] 利用關聯分析的方法進行SRC的QTL關聯定位研究國內尚未見報導。
[0008] 盡管SRC檢測所需儀器設備比較簡單、操作也很方便，但目前在品種遺傳改良中 主要還是用于種質資源的篩選方面，尚未有育成品種的報導。由于水SRC能夠綜合反映面 粉的特性，而且具有易操作等特點，在江蘇里下河地區農科所的高世代小麥品系檢測中已 經開始使用。由于小麥品質育種的特殊性，往往需要在種子收獲后再根據有關理化指標的 檢測來進行選擇，無法在試驗田間就對育種早世代材料進行直接選擇，而且在回交或滾動 回交育種中則必須根據籽粒測定結果進行選擇后再于下季進行配組，嚴重影響育種進度， 因此如果能篩選出穩定可靠的溶劑保持力（SRC)分子標記并且在育種中加以應用將會促 進弱筋小麥育種效率的提1?。
【發明內容】
[0009] 本發明所要解決的技術問題是提供一種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的分子標 記及分子標記方法，為小麥面粉水溶劑保持力在品質育種中的分子標記輔助選擇提供一條 可行的途徑。
[0010] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的 分子標記，所述分子標記是以小麥基因組DNA為底物，以gwm642-lD為SSR引物，進行PCR 擴增所得的擴增片段，用于檢測小麥面粉水溶劑保持力的特性，該標記不同的等位變異能 夠解釋該性狀表型變異的10. 57-15. 68%，其中，分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水 溶劑保持力的提高具有增效作用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的 降低具有增效作用。
[0011] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的 分子標記方法，包括：
[0012] (l)PCR 反應體系為：總計 10μ 1，包括 4ng/y 1 模板 DNA，lXPCRbuffer，2mmol/ LMg2+，0· 2 μ mol/L 熒光引物，25mmol/LdNTP，0· 6U/μ 1 Taq-DNATaq DNA 聚合酶；
[0013] (2)擴增程序為：94°C預變性5min，前兩個循環94°C變性45s，65°C退火45s，72°C 延伸55s，隨后每兩個循環退火溫度降2°C，直至55°C，保持退火溫度55°C擴增25個循環， 最后72°C延伸lOmin，然后降至4°C保存；
[0014] (3)擴增產物檢測：在擴增產物中加入3倍體積的無水乙醇沉淀，用70%乙醇洗 滌，然后溶解于30 μ 1無離子水中，用DNA測序儀ABI3730進行分析，通過GeneMapper3. 0 進行擴增條帶的讀取。其中分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的提高具 有增效作用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的降低具有增效作用。
[0015] 在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。
[0016] 進一步，所述分子標記的上游引物序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0017] 本發明的有益效果是：
[0018] 1、由于溶劑保持力是通過小麥收獲后籽粒來檢測面粉的特性，在育種中難以在田 間直接篩選，而與溶劑保持力相關聯的標記可以利用葉片盡早進行DNA檢測來預測和篩 選；
[0019] 2、本發明通過關聯分析定位了與面粉水溶劑保持力極顯著相關聯的SSR分子 標記gwm642_lD(位于roder發表的小麥遺傳連鎖圖1D的75cM處，參考文獻：R0der MS, Korzun V, ffendehake K, Plaschke J, Tixier MH, Leroy P, Ganal MW. A microsatellite map of wheat. Genetics, 1998,149 (4) :2007-2023)，可以解釋水溶劑保持力表型變異的 10. 57-15. 68%，檢測程序簡單，適于雜交和回交育種中目的（供體）單株的確定，提高選擇 效率。
[0020] 3、本發明提供了一種與小麥面粉水溶劑保持力極顯著（ρ〈0· 01)相關聯的分子標 記，使用的與小麥面粉水溶劑保持力相關聯的分子標記在國內外均未有發表過。利用該標 記可對田間植株DNA進行小麥面粉溶劑保持力的分子標記輔助選擇，從而節約成本，提高 育種效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1為3730DNA測序儀熒光標記結果，gwm642-lD等位變異188bp圖；
[0022] 圖2為3730DNA測序儀熒光標記結果，gwm642-lD等位變異202bp圖；
【具體實施方式】
[0023] 以下對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限 定本發明的范圍。
[0024] 實驗例
[0025] 一、試驗材料：
[0026] 試驗收集了 190個品種，在進行基因型分析時根據試驗結果剔除了 14個親緣關系 過近的品種，實際用于關聯分析的品種清單見表1。
[0027] 表1 :用于分析的176個品種
【權利要求】
1. 一種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的分子標記，其特征在于，所述分子標記是以 小麥基因組DNA為底物，以gwm642-lD為SSR引物，進行PCR擴增所得的擴增片段，用于 檢測小麥面粉水溶劑保持力的特性，該標記不同的等位變異能夠解釋該性狀表型變異的 10. 57-15. 68%，其中，分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的提高具有增 效作用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的降低具有增效作用。
2. -種與小麥面粉水溶劑保持力關聯的分子標記方法，其特征在于，包括： 1. PCR 反應體系為：總計 10μ 1，包括 4ng/y 1 模板 DNA，lXPCRbuffer，2mmol/LMg2+， 0.2以111〇1/1熒光引物，25111111〇1/1(1階13,0.6"4 1丁&9-0嫩丁&9 0嫩聚合酶； 2) 擴增程序為：94°C預變性5min，前兩個循環94°C變性45s，65°C退火45s，72°C延伸 55s，隨后每兩個循環退火溫度降2°C，直至55°C，保持退火溫度55°C擴增25個循環，最后 72°C延伸lOmin，然后降至4°C保存； 3) 擴增產物檢測：在擴增產物中加入3倍體積的無水乙醇沉淀，用70%乙醇洗滌，然后 溶解于30以1無離子水中，用0嫩測序儀41313730進行分析，通過661161&^^6『3.0進行擴增 條帶的讀取。其中分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的提高具有增效作 用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的降低具有增效作用。
3. 根據權利要求2所述的分子標記方法，其特征在于，所述分子標記的上游引物序列 如SEQ ID NO. 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 2所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046627SQ201410249902
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】張勇, 張伯橋, 高德榮, 吳宏亞, 張曉 , 張曉祥, 朱冬梅, 程凱 申請人:江蘇里下河地區農業科學研究所