一種高密度發酵培養枯草芽孢桿菌的方法
【專利摘要】本發明公開了一種高密度發酵培養枯草芽孢桿菌的方法，屬于微生物發酵工程領域。以提高枯草芽孢桿菌的菌體產量和芽孢率。該方法是經激活枯草芽孢桿菌、二步發酵培養生產目標產品。本發明方法的培養基成分易得且價格便宜、工藝參數簡單、發酵周期短，所得枯草芽孢桿菌的細胞生物量可達到9×109cfu/ml以上，且芽孢率90%以上。顯著提高產品的質量和穩定性。
【專利說明】一種高密度發酵培養枯草芽孢桿菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物發酵領域，更具體涉及一種高密度發酵培養枯草芽孢桿菌的方法。
【背景技術】
[0002]枯草芽孢桿菌{Bacillus 5^ii7i5.)是芽孢桿菌屬的一種,革蘭氏陽性需氧菌,無莢膜，周生鞭毛，能運動。其廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖。枯草芽孢桿菌菌體在生長過程中產生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質，這些活性物質對致病菌或內源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。能迅速消耗環境中的游離氧，造成腸道低氧，促進有益厭氧菌生長，并產生有機酸，降低腸道PH，間接抑制其他致病菌生長；刺激動物免疫器官的生長發育，激活T、B淋巴細胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強細胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力。是我國農業部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一。
[0003]在水產養殖領域，枯草芽孢桿菌能有效降解養殖水體中的有機質，改善水色，抑制有害藻類的過度繁殖，消除底部淤積，改良地質；有效降解高分子物質為低分子物質，促進營養成分的吸收，提高飼料的利用率，同時還能抑制病害微生物的生長，提高水產動物的免疫力，增強水產動物的抵抗力，減少疾病的發生，提高成活率。
[0004]目前枯草芽孢桿菌生產過程中普遍存在菌數和芽孢率偏低的問題，一般芽孢含量在5.0X109cfu/ml以下，沒有芽孢的菌體會在短時間內死亡，大大降低菌劑的活性和質量穩定性。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種高密度發酵培養枯草芽孢桿菌的方法，能促進枯草芽孢桿菌的生長，提高枯草芽孢桿菌的菌體數量和芽孢產率。
[0006]為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是:一種高密度發酵培養枯草芽孢桿菌的方法，包括以下步驟:
①將-70°C保存的枯草芽孢桿菌無菌劃線接種于滅菌的固體培養基上，于35~38°C培
養3~4天，得到激活的枯草芽孢桿菌；
所述固體培養基按質量百分比，由如下組分組成:牛肉膏0.3^0.4%、蛋白胨0.6^1.0%、瓊脂1.5~2.0%，余量為水，PH6.8~7.2 ；
@將激活的枯草芽孢桿菌接種于1000ml搖瓶的滅菌培養基中，培養基裝量為200ml，搖床培養條件為:溫度33~37°C、轉數20(T220rpm，培養16~20小時，得到一級發酵罐所用的種子液；
所述液體培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.1-0.7%、牛肉膏0.3^0.4%、蛋白胨0.6^1.0%、酵母膏0.4^0.6%、磷酸氫二鉀0.1-0.3%、硫酸銨0.2^0.5%、氯化鈉0.3~0.6%,消泡劑0.15%~0.25%、余量為水，PH6.8~7.2 ；
@將將步驟?得到的種子液接種于IOOL種子發酵罐的滅菌培養基中，培養基裝量為70L，接菌量5~10%(v/v)，發酵條件為:溫度33~37°C、罐壓0.03~0.05Mpa通氣比列:起始通氣比為1:0.6 (v/v),發酵6~10小時后加大通氣比為1:1 (v/v)、起始攪拌轉數為180 rpm，發酵6~10小時后攪拌轉數調整為220 rpm，發酵培養10-14小時，得到二級罐所用種子菌液；
所述液體培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.1~0.7%、牛肉膏0.3~0.4%、蛋白胨0.6~1.0%、酵母膏0.4~0.6%、磷酸氫二鉀0.1~0.3%、硫酸銨0.2~0.5、硫酸鎂
0.02~0.04%、硫酸錳0.005~0.01%、氯化鈉0.3~0.6%，消泡劑0.15%~0.25%、余量為水，ΡΗ7.0~7.2 ；
將將步驟@得到的種子液接種于1000L發酵罐的滅菌培養基中，培養基裝量為700L，發酵條件與步驟@相同，接種量5~10%(v/v)，發酵培養36~40小時。收集發酵培養液
得到枯草芽孢桿菌液體產品；
所述液體培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.1~0.7%、玉米漿粉2~3%、玉米微粉0.1~0.2%、磷酸氫二鉀0.1~0.3%、硫酸銨0.2~0.5%、硫酸鎂0.01~0.03%、氯化鈉
0.2~0.5%、消泡劑0.15%~0.25%、余量為水，ΡΗ7.0~7.2 ；
培養基的滅菌條件為:121°C、0.1lMpa滅菌2(T30min.平板計數得到枯草芽孢桿菌數在9 X 109cfu/ml以上，孔雀石綠染色后油鏡觀察，芽孢率90%以上。
[0007]本發明方法的優點在于:培養基成分易得且價格便宜、工藝參數簡單、發酵周期短，所得的枯草芽孢桿菌不僅活菌數高，并且芽孢率高，可達到8X109cfu/ml以上，顯著提
聞廣品質量。
【具體實施方式】
[0008]為了更好的理解本發明，以下實施例對本發明作進一步說明。
[0009]實施例1
CO將-70°C保存的枯草芽孢桿菌無菌劃線接種于滅菌的固體培養基上(固體培養基按質量百分比，由如下組分組成:牛肉膏0.3%、蛋白胨0.6%、瓊脂1.5%，余量為水，PH7.0，121°C、0.1lMpa 滅菌 20min.)37°C培養 4 天。
[0010]@將固體培養基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后，接種于1000ml搖瓶的滅菌培
養基中(培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸銨0.2%、氯化鈉0.5%，消泡劑0.15%、余量為水，PH7.0，1210C>0.1lMpa滅菌20min)，培養基裝量為200ml，搖床培養條件為:溫度37°C、轉數220rpm，培養16小時。
[0011]@將步驟@得到的種子液接種于IOOL種子發酵罐的滅菌培養基中(培養基按質
量百分比 :由如下組分組成:葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸銨0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、氯化鈉0.5%，消泡劑0.15%、余量為水，PH7.0， 121°C、0.1lMpa滅菌20min)，培養基裝量為70L，接菌量5% (v/v)，發酵條件為:溫度37°C、罐壓0.05Mpa，通氣比列:起始通氣比為1: 0.6( v/v)，發酵6小時后加大通氣比為1:1 (v/v)、起始攪拌轉數為180 rpm ,發酵6小時后攪拌轉數調整為220 rpm,發酵培養10小時，得到二級罐所用種子菌液；
④將步驟@培養的種子液接種于1000L發酵罐的滅菌培養基中(培養基按質量百分
比:由如下組分組成:葡萄糖0.4%、玉米漿粉2%、玉米微粉0.1%，磷酸氫二鉀0.1%、硫酸銨0.2%、硫酸鎂0.01%、氯化鈉0.2%、消泡劑0.15%、余量為水，PH7.0,121°C、0.1lMpa滅菌2(T30min)，培養基裝量為700L，發酵條件為:溫度37°C、罐壓0.05Mpa，通氣比列:起始通氣比為I:0.6 (v/v),發酵6小時后加大通氣比為1:1 (v/v)、起始攪拌轉數為180 rpm，發酵6小時后攪拌轉數調整為220 rpm，接種量10% (v/v)，發酵培養36小時。收集發酵培養液得到枯草芽孢桿菌液體產品。營養瓊脂平板計數活菌數9.6X109cfu/ml，孔雀石綠芽孢染色油鏡觀察芽孢率92%。
[0012]實施例2
①將-70°C保存的枯草芽孢桿菌無菌劃線接種于滅菌的固體培養基上(固體培養基
按質量百分比，由如下組分組成:牛肉膏0.3%、蛋白胨0.6%、瓊脂1.5%，余量為水，PH7.0，121°C、0.1lMpa 滅菌 20min.)37°C培養 4 天。
[0013]@將固體培養基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后，接種于1000ml搖瓶的滅菌培
養基中(培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸銨0.2%、氯化鈉0.5%，消泡劑0.15%、余量為水，PH7.0，1210C>0.1lMpa滅菌20min)，培養基裝量為200ml，搖床培養條件為:溫度37°C、轉數220rpm，培養18小時。
[0014]?將步驟@得到的種子液接種于100L種子發酵罐的滅菌培養基中(培養基按質
量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸銨0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、氯化鈉0.5%，消泡劑0.15%、余量為水，PH7.0，121°C、0.1lMpa滅菌20min)，培養基裝量為70L，接菌量10% (v/v)，發酵條件為:溫度37°C、罐壓0.05Mpa，通氣比列:起始通氣比為1:0.6(v/v)，發酵8小時后加大通氣比為1:1 (v/v)、起始攪拌轉數為180 rpm ,發酵8小時后攪拌轉數調整為220 rpm,發酵培養12小時，得到二級罐所用種子菌液；
?將步驟@培養的種子液接種于1000L發酵罐的滅菌培養基中(培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.5%、玉米漿粉2.5%、玉米微粉0.15%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸銨0.24%、硫酸鎂0.02%、氯化鈉0.4%、消泡劑0.15%、余量為水，PH7.2，PH7.0，121。。、
0.llMpa，滅菌2(T30min)，培養基裝量為700L，發酵條件為:溫度37°C、罐壓0.05Mpa，通氣比列:起始通氣比為1:0.6 (v/v)，發酵8小時后加大通氣比為1:1 (v/v)、起始攪拌轉數為180 rpm，發酵8小時后攪拌轉數調整為220 rpm，接種量10% (v/v)，發酵培養40小時。收集發酵培養液得到枯草芽孢桿菌液體產品。營養瓊脂平板計數活菌數1.3X1010cfu/ml,孔雀石綠芽孢染色油鏡觀察芽孢率95%。
[0015]實施例3①將-70°C 保存的枯草芽孢桿菌無菌劃線接種于滅菌的固體培養基上(固體培養基
按質量百分比，由如下組分組成:牛肉膏0.3%、蛋白胨0.6%、瓊脂1.5%，余量為水，PH7.0，121°C、0.1lMpa 滅菌 20min.)37°C培養 4 天。
[0016]@將固體培養基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后，接種于1000ml搖瓶的滅菌培
養基中(培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸銨0.2%、氯化鈉0.5%，消泡劑0.15%、余量為水，PH7.0，1210C>0.1lMpa滅菌20min)，培養基裝量為200ml，搖床培養條件為:溫度37°C、轉數220rpm，培養18小時。
[0017]@將步驟@得到的種子液接種于100L種子發酵罐的滅菌培養基中(培養基按質
量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸銨0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、氯化鈉0.5%，消泡劑0.15%、余量為水，PH7.0，121°C、0.1lMpa滅菌20min)，培養基裝量為70L，接菌量10% (v/v)，發酵條件為:溫度37°C、罐壓0.05Mpa，通氣比列:起始通氣比為1: 0.6( v/v)，發酵8小時后加大通氣比為1:1 (v/v)、起始攪拌轉數為180 rpm ,發酵8小時后攪拌轉數調整為220 rpm,發酵培養12小時，得到二級罐所用種子菌液；
?將步驟@培養的種子液接種于1000L發酵罐的滅菌培養基中(培養基按質量百分
比:由如下組分組成:葡萄糖0.7%、玉米漿粉3%、玉米微粉0.2%、磷酸氫二鉀0.3%、硫酸銨
0.5%、硫酸鎂0.03%、氯化鈉0.5%、消泡劑0.15%、余量為水，PH7.2，121 °C >0.1lMpa,滅菌2(T30min)，培養基裝量為700L，發酵條件為:溫度37°C、罐壓0.05Mpa，通氣比列:起始通氣比為1:0.6 (v/v),發酵10小時后加大通氣比為1:1 (v/v)、起始攪拌轉數為180 rpm ,發酵10小時后攪拌轉數調整為220 rpm，接種量10%( v/v)，發酵培養40小時。收集發酵培養液得到枯草芽孢桿菌液體產品。營養瓊脂平板計數活菌數1.5Χ101(ι(^ιι/πι1，孔雀石綠芽孢染色油鏡觀察芽孢率97%。
【權利要求】
1.一種高密度發酵培養枯草芽孢桿菌的方法，包括以下步驟: ①將-70°c保存的枯草芽孢桿菌無菌劃線接種于滅菌的固體培養基上，于35~38°C培養3~4天，得到激活的枯草芽孢桿菌； 所述固體培養基按質量百分比，由如下組分組成:牛肉膏0.3^0.4%、蛋白胨0.6^1.0%、瓊脂1.5~2.0%，余量為水，PH6.8~7.2 ； ②將激活的枯草芽孢桿菌接種于1000ml搖瓶的滅菌培養基中，培養基裝量為200ml，搖床培養條件為:溫度33~37°C、轉數20(T220rpm，培養16~20小時，得到一級發酵罐所用的種子液； 所述液體培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.1-0.7%、牛肉膏0.3^0.4%、蛋白胨0.6^1.0%、酵母膏0.4^0.6%、磷酸氫二鉀0.1-0.3%、硫酸銨0.2^0.5%、氯化鈉0.3~0.6%,消泡劑0.15%~0.25%、余量為水，ΡΗ6.8~7.2 ； ③將步驟②培養的種子液接種于100L種子發酵罐的滅菌培養基中，培養基裝量為70L,接菌量5~10% (v/v)，發酵條件為:溫度33~37。。、罐壓0.03~0.05Mpa通氣比列為1:0.6^1:1 (v/v)、攪拌轉數為18(T220 rpm,發酵培養10-14小時，得到二級罐所用種子菌液； 所述液體培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.4^0.7%、牛肉膏0.3^0.4%、蛋白胨0.6^1.0%、酵母膏0.4^0.6%、磷酸氫二鉀0.1-0.3%、硫酸銨0.2^0.5、硫酸鎂0.02~0.04%、硫酸錳0.005~0.01%、氯化鈉0.3~0.6%，消泡劑0.15%~0.25%、余量為水，ΡΗ7.0~7.2 ； ④將步驟③培養的種子液接種于1000L發酵罐的滅菌培養基中，培養基裝量為700L，發酵條件與步驟3)相同，接種量5~10% (v/v)，發酵培養36~40小時； 所述液體培養基按質量百分比:由如下組分組成:葡萄糖0.1-0.7%、玉米漿粉2-3%、玉米微粉0.1-0.2%、磷酸氫二鉀0.1-0.3%、硫酸銨0.2~0.5%、硫酸鎂0.01-0.03%、氯化鈉0.2~0.5%、消泡劑0.15%~0.25%、余量為水，ΡΗ7.0~7.2。
2.根據權利要求1所述的一種高密度發酵培養枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于所述培養基使用前都需要滅菌處理，滅菌條件為:121°C、0.1lMpa滅菌2(T30min。
【文檔編號】C12R1/125GK103992977SQ201410249033
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月8日 優先權日:2014年6月8日
【發明者】李貴杰, 王燕, 張群峰, 耿建 申請人:威海金牌生物科技股份有限公司