用改變烏頭酸酶調控元件的細菌發酵生產l-蘇氨酸的方法
【專利摘要】本發明提供了發酵生產L-蘇氨酸的方法，其包括改造細菌染色體上acnA基因的野生型的調控元件，使其烏頭酸酶A的表達量降低但不消失；和，用改造的細菌發酵生產L-蘇氨酸。另外，本發明還提供了由該方法衍生的方法和應用，以及可以用在這些方法和應用中的細菌等。
【專利說明】用改變烏頭酸酶調控元件的細菌發酵生產L-蘇氨酸的方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于氨基酸發酵領域，具體而言，本發明涉及發酵生產1-蘇氨酸的方法及其衍生的方法和應用，和可以用在這些方法和應用中的細菌等。
[0003]
【背景技術】
[0004]通過產1-蘇氨酸的細菌(如，埃希氏菌屬的大腸桿菌和棒桿菌屬的桿狀細菌)發酵來生產1-蘇氨酸已經得到了產業化應用。這些細菌，可以是從自然界分離的細菌，也可以是通過誘變或基因工程改造獲得的細菌，或者兩者兼而有之。當前的文獻報道中，通過基因工程改造的注意力主要集中在Α?7/Λ MrTP等基因上(參見中國專利94102007和99121353等)，未見為了 L-蘇氨酸生產而關注烏頭酸酶(如，烏頭酸酶A)及其編碼基因。
[0005]烏頭酸酶是三羧酸循環中的一個酶，該酶催化兩步化學反應，分別為檸檬酸轉化為烏頭酸以及烏頭酸轉化為異檸檬酸。目前已知在埃希氏菌中，acnA基因(其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)編碼烏頭酸酶A，但是可能是由于其代謝距離最終的1-蘇氨酸產物太遠，中間代謝分支太多且復雜，而在1-蘇氨酸發酵中一直未引起人們的重視。
[0006]本發明人經過長期研究和實踐，尤其憑借了一些運氣，偶然發現acW基因的調控元件的改造能夠有助于提高1-蘇氨酸的產量；然而，現有技術要么通過增加拷貝和/或定點突變導入表達量和/或酶活性提高的有益的酶基因，要么通過敲除不利的基因以使之酶活性和/或表達量消失，但是與之不同的是，本發明人發現，基因的調控元件不能簡單地提高或敲除，尤其是敲除后基因的不表達使得細菌生長困難，難以實際應用，因此開發了新的針對acW基因的調控元件的方法，以此來提高1-蘇氨酸的產量，而且該方法與現有改造的大量高產L-蘇氨酸的細菌的染色體改造位點沒有沖突，可以疊加提高的效果，從而在實踐上可用于細菌發酵生產1-蘇氨酸。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題在于提供新的發酵生產1-蘇氨酸的方法及其相關的方法，包括相對于未改造細菌提高1-蘇氨酸的發酵生產量的方法，改造的細菌在發酵生產1-蘇氨酸中的應用，改造的細菌在相對于未改造細菌提高1-蘇氨酸的發酵生產量的應用，和/或，改造細菌的方法等。另外，本發明還提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、載體和/或細菌等。
[0008]具體而言，在第一方面，本發明提供了發酵生產1-蘇氨酸的方法，其包括:
(1)改造細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失；和，(2)用步驟(1)改造而得到的細菌發酵生產1-蘇氨酸。
[0009]在本文中，術語“改造”指的是是相應被改造的對象發生變化，從而達到一定的效果。改造位于染色體上的調控元件的頻度遠小于改造位于染色體上的基因的頻度，但是兩者進行改造的技術手段基本一致，包括但是不限于，誘變、定點突變、和/或同源重組，優選是后兩者。這些技術手段廣泛記載于分子生物學和微生物學文獻中，有許多甚至已經商品化了。在本發明的【具體實施方式】中，根據同源重組的原理，采用Addgene公司商品化的pKOV質粒系統來進行改造，將未改造細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件，改造成能夠使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失的新的調控元件。因此，在本文文中，優選改造是通過同源重組進行的改造。
[0010]本發明人經過長期研究發現，使得acW基因所編碼的烏頭酸酶A的表達量消失，將造成細菌本身生長困難，甚至無法生長/繁殖。因此，本發明的“改造”要相對于未改造的細菌，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失，優選使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低20%~95%，更優選降低50%~90%，如降低65%、70%或80%。
[0011]相應地，本發明還提供了其他應用或方法。例如，在第二方面，本發明提供了提高1-蘇氨酸的發酵量的方法，其包括:
(1)改造細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失；和，
(2)用步驟(1)改造而得到的細菌發酵產生1-蘇氨酸。
[0012]1-蘇氨酸作為細菌的重要代謝產物，大多數細菌或多或少都能夠發酵產生一定量的1-蘇氨酸。盡管低產L-蘇氨酸的細菌不適合有經濟效益地生產1-蘇氨酸，但是通過本發明的方法，仍舊能提高1-蘇氨酸的發酵量，仍舊可以供對經濟效益不敏感的地方使用。當然，在本文中，優選細菌是高產L-蘇氨酸的細菌。通過本發明的方法，可以進一步提高其產量。另外，在本發明的方法或應用中，除了改造細菌染色體上基因的野生型的調控元件以外，可以不再進行其他改造，如甚至可以不改造細菌染色體上的野生型的基因。例如，尤其對于高產L-蘇氨酸的細菌來說，僅僅改造細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件。
[0013]又如，在第三方面，本發明提供了改造獲得的細菌在發酵生產1-蘇氨酸中的應用，其中，所述改造獲得是改造細菌染色體上基因的野生型的調控元件而獲得，而且使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失。
[0014]改造獲得的細菌可以單獨應用于發酵生產1-蘇氨酸中，也可以和其他產L-蘇氨酸的細菌混合發酵生產1-蘇氨酸，或者以其他方式應用于發酵生產1-蘇氨酸中。在本文中，如無特別限定(如未以“改造獲得”來限定)，術語“細菌”是未改造或改造前的細菌，其染色體的acW基因座位前后的調控元件是野生型的調控元件。優選本文中，細菌是產蘇氨酸的細菌，如產蘇氨酸超過0.5g/L的細菌。
[0015]還如，在第四方面，本發明提供了改造獲得的細菌在提高1-蘇氨酸的發酵量的應用，其中，所述改造獲得是改造細菌染色體上基因的野生型的調控元件而獲得，而且使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失。
[0016]在本文中，細菌優選是埃希氏菌屬細菌，更優選是大腸桿菌。由于現有技術幾乎沒有在1-蘇氨酸生產/發酵中關注過細菌的猶A基因的調控元件，改造的染色體的基因大多集中于其他基因位點上，甚至都不關注調控元件，因此現有技術中的細菌(尤其是埃希氏菌屬細菌，如大腸桿菌)的基因前后沒有被報道不帶有野生型的調控元件。在本發明的【具體實施方式】中，無論高產還是低產L-蘇氨酸的細菌，只要帶有acW基因的野生型的調控元件，通過本發明的方法進行改造，就能使得L-蘇氨酸的發酵量得到提高。
[0017]更本質地，在第五方面，本發明提供了改造細菌的方法，其包括改造所述細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失。
[0018]本發明第五方面的方法改造而獲得的細菌能夠用于發酵生產或產生L-蘇氨酸。因此，在第六方面，本發明提供了本發明第五方面的方法改造而獲得的細菌。
[0019]野生型的調控元件可以是基因上游的啟動子、增強子或啟動子區域序列，也可以是基因下游與表達調控相關的序列。優選地，在本文中，所述野生型的調控元件是野生型的啟動子。在本發明的【具體實施方式】中，所述野生型的啟動子的核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示，其被替換后提高L-蘇氨酸的發酵量被證實。
[0020]經過本發明人研究和證實，更優選地，在本文中，所述改造細菌染色體上acnA基因的野生型的調控元件是將染色體上acW基因的野生型的調控元件替換為弱轉錄調控元件，優選替換為弱轉錄啟動子，如核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的弱轉錄啟動子。
[0021]所以，優選本發明第六方面的產蘇氨酸細菌，其不包含如SEQ ID No:1所示的野生型的啟動子的核苷酸序列。
[0022]更優選本發明第六方面的產蘇氨酸細菌，其包含以下第七方面的多核苷酸。
[0023]另外，本發明還提供了可以用于上述方法中的多核苷酸和/或載體等物質。例如，在第七方面，本發明提供了多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。又如，在第八方面，本發明提供了載體，其包含本發明第七方面的多核苷酸。
[0024]本發明的有益效果在于，開辟并且實踐證明了新的提高L-蘇氨酸的發酵量的方式，對于高產和低產L-蘇氨酸的細菌都適用，而且與現有改造的大量高產L-蘇氨酸的細菌的染色體改造位點沒有沖突，觀察到了可以疊加提高產量的效果，從而在實踐上可用于細菌發酵生產1-蘇氨酸，便于推廣應用。
[0025]為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。
[0026]另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。
[0027]
【具體實施方式】
[0028]以下通過實施例進一步說明本發明的內容。如未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南(第3版)》(科學出版社)、《微生物學實驗(第4版)》(高等教育出版社)以及相應儀器和試劑的廠商說明書等參考。
[0029] 構建實施例用轉錄活性較弱的啟動子替換acW的啟動子通過對疋coli K12 W3110中acnA上游序列分析，我們設計了弱轉錄啟動子(序列如SEQ ID No:2所示)并委托中科院微生物所合成并構建入pMD-19T質粒(可購自大連寶生物公司)中，來替換acW基因ORF上游196bp的野生型的啟動子區域(序列如SEQ ID No:1所示)，以減弱野生型acW基因的強度。
[0030]具體而言，以抽提的野生型大腸桿菌疋coli K12 W3110基因組染色體為模板，以引物Pl和P2、P3和P4分別進行PCR擴增，獲得長度分別為486 bp和619 bp的兩條DNA片段(分別命名為Up2和Down2片段)。以含有上述弱轉錄啟動子的pMD_19T質粒，以P5和P6進行PCR擴增，獲得長度為161 bp的弱轉錄啟動子片段(命名為P片段)。其中，PCR按如下方式進行:94°C變性30 s (秒)，52°C退火30 s (秒)，以及72°C延伸30 s (秒)(30個循環)。
[0031]將上述三條D N A片段經瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，再以上述Up2和P片段混合為模板，以Pl和P6為引物，通過Overlap PCR擴增長約622bp的片段(命名為Up-P片段)。其中，PCR按如下方式進行:94°C變性30s (秒)，52°C退火30 s (秒)，以及72°C延伸60s (秒)(30個循環)。
[0032]將瓊脂糖凝膠電泳分離純化后的Up-P和Down2片段為模板，以Pl和P4為引物，通過Overlap PCR擴增長約1240bp的片段(命名為Up-P-down片段)。其中，PCR按如下方式進行:94°C變性30 s (秒)，52°C退火30 s (秒)，以及72°C延伸60 s (秒)(30個循環)。
[0033]上述所用的引物序列如下:
Pl: 5’ -CGCGGATCCGTGATGGCGATTATATGAGG-3’
P2:5 ’ -GGTTTCTTAGACGTCGGATTGAGAAAACGCGCCCATCCAGGA-3，
P3:5 ’ -ATCAGCAGGACGCACTGACCCATTAAGGAGGAGCTATGTCG-3，
P4: 5’ -ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAATT-3’
P5:5 ’ -TCCTGGATGGGCGCGTTTTCTCAATCCGACGTCTAAGAAACC-3，
P6:5 ’ -CGACATAGCTCCTCCTTAATGGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3，
將瓊脂糖凝膠電泳分離純化后的Up-P-down片段和pKOV質粒(可購自Addgene公司)分別用雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳分離純化后連接，獲得用于導入的載體pK0V-Up-P-Down,并將載體pKOV-Up-P-Down送測序公司進行測序鑒定，表明其含有正確的弱轉錄啟動子序列，保存備用。
[0034]將構建好的pKOV-Up-P-Down質粒分別電轉化入常用的低產L-蘇氨酸的E.coliMG442菌株(可購自俄國國家工業微生物保藏中心(VKPM)，保藏編號CMM B-1628 ;其構建方法可參見US4278765A)和高產L-蘇氨酸的萬.coli BKIIM B-3996菌株(可購自俄國抗生素研究所，登記號為1867 ;其構建方法可參見US5175107A)(經測序確認這兩個菌株染色體上均保留有野生型的acnA基因(即Genbank等錄號U00096.2中的1333855至1336530位)及其上下游元件)，于30°C、100 rpm,在LB培養基中復蘇2 h后,根據Addgene公司的pKOV質粒的商品指南，挑選出同源重組陽性的單克隆，經測序確認其染色體上的野生型基因的上游啟動子被替換為弱轉錄啟動子，分別得到acnA啟動子突變的(低/高產L-蘇氨酸)大腸桿菌。經檢測，在不同培養基中，這兩個菌株的烏頭酸酶的表達量均有6510%的下降。
[0035]效果實施例蘇氨酸發酵實驗
將萬.coli BKIIM B-3996菌株、萬.coli MG442菌株以及實施例1和2的菌株分別接種在25mL表1所述的培養基中，于37°C、200rpm培養12 h。然后取I mL培養基的培養物接種在25 mL表1所述的培養基中，于37°C、200rpm培養培養36 h。當培養完成時，通過HPLC測定1-蘇氨酸的產生。
[0036] 表1培養基配方
【權利要求】
1.發酵生產L-蘇氨酸的方法，其包括: (O改造細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失；和， (2)用步驟(1)改造而得到的細菌發酵生產L-蘇氨酸。
2.提高L-蘇氨酸的發酵量的方法，其包括: (O改造細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失；和， (2 )用步驟(1)改造而得到的細菌發酵產生L-蘇氨酸。
3.改造獲得的細菌在發酵生產L-蘇氨酸中的應用，其中，所述改造獲得是改造細菌染色體上基因的野生型的調控元件而獲得，而且使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失。
4.改造獲得的細菌在提高L-蘇氨酸的發酵量的應用，其中，所述改造獲得是改造細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件而獲得，而且使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失。
5.改造細菌的方法，其包括改造所述細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失。
6.權利要求1-5之任一所述的方法或應用，其中，所述野生型的調控元件是野生型的啟動子。
7.權利要求6所述的方法或應用，其中，所述野生型的啟動子的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。
8.權利要求1-7之任一所述的方法或應用，其中，所述改造細菌染色體上acW基因的野生型的調控元件是將染色體上基因的野生型的調控元件替換為弱轉錄調控元件，優選替換為弱轉錄啟動子，如核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的弱轉錄啟動子。
9.權利要求1-8之任一所述的方法或應用，其中，所述細菌是埃希氏菌屬細菌，優選是大腸桿菌。
10.權利要求5所述的方法改造而得到的產蘇氨酸細菌，其不包含如SEQID No:1所示的野生型的啟動子的核苷酸序列。
【文檔編號】C12P13/08GK103993048SQ201410248982
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年4月7日 優先權日:2013年4月7日
【發明者】馬吉銀, 溫廷益, 陳金龍, 梁勇, 劉樹文, 魏愛英, 楊立鵬, 孟剛, 任瑞 申請人:寧夏伊品生物科技股份有限公司