用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重pcr引物及其設計方法

用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重pcr引物及其設計方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物及其設計方法，設計方法，設計方法包括利用引物設計軟件設計同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物組合、篩選競爭狀態優勢引物利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證，最后去除擴增引物中的競爭狀態劣勢引物，獲得多重PCR引物組合，同時還公開了多重PCR的檢測方法；與現有技術相比，本發明的優點在于：采用本發明建立的多重PCR同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的方法，具有操作簡便、快速，特異性強，靈敏度高等優點，只需一個PCR反應就可同時檢測出這四種細菌。
【專利說明】用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物及其設計方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種用于同時檢測海洋陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物及其設計方法。
【背景技術】
[0002]陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌，屬于可以通過食物、水進行傳播的病原菌。它們的生物學特性和致病性有一定的區別，但都可以引起食物中毒和消化系統疾病。
[0003]陰溝腸桿菌屬于條件致病菌，一般條件下不會引起致病，但也可引起敗血癥、下呼吸道感染、傷口感染、軟組織感染、心內膜炎、泌尿道感染等癥狀。陰溝腸桿菌能夠引起人類重視，主要是因為其可產生超廣譜內酰胺酶、AmpC酶，耐藥情況嚴重，并且具備多種其他耐藥機制，給臨床抗生素治療帶來新的挑戰。陰溝腸桿菌耐藥機制主要包括產生內酰胺酶、qnr基因介導耐藥、整合子、主動外排泵系統作用、藥物作用靶位的改變、外膜通透性改變等。這些復雜的耐藥機制存在，對于其他細菌混合性感染的抗生素治療造成無效或療效甚微。陰溝腸桿菌廣泛存在于自然界中，由其引起的海產品食物中毒偶有發生，但是在醫院中的傳播僅次于大腸桿菌和克雷伯菌。
[0004]產單核細胞增生李斯特菌是一種重要人畜共患病的病原菌。人感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單 核細胞增多等。該菌廣泛存在于自然界中，食品中存在的產單核細胞增生李斯特菌對人類的安全具有危險，在4°C的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。在歐美、日本由該菌造成的臨床疾病和食物污染問題，已超過在細菌性食物中毒中占第I位的沙門氏菌。我國多地也有該菌引發疾病而住院和死亡的報道。因為該菌是一種細胞內寄生菌，抗生素治療只能在一段時間內發揮作用，目前發現其耐藥性呈現散狀分布，對一些抗生素耐藥性不斷增強。
[0005]嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體中，是多種水生動物的原發性致病菌，對人而言為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病的病原菌。嗜水氣單胞菌可以產生毒性很強的外毒素，如:溶血素、組織毒素、壞死毒素、腸毒素和蛋白酶等，主要引起腸道性感染。嗜水氣單胞菌感染人的病例少有記載，但是一旦發作，死亡率很高，治愈率較低，常會與其它菌(如溫和產氣單胞菌、弧菌等)混合感染使病情加重。在我國也發生過多次由嗜水氣單胞菌引起的食物中毒。
[0006]副溶血弧菌對人和動物均有較強的毒力，其致病物質主要有耐熱性溶血素(TDH)和耐熱溶血相關毒素(TRH)，這些毒素具有溶血活性、腸毒性和致死作用。該菌因在含食鹽較濃(3%-4%以上)的培養基中生長，而在不含鹽的培養基內不能繁殖，故而又稱嗜鹽菌。副溶血弧菌在世界各地均有分布，通常存在于海岸線區域以及海產品中，人多因食用污染本菌又未經良好加工的海產品，如蟹類、牡蠣、蝦等而引起食物中毒。副溶血弧菌引起的食物中毒，在沿海地區細菌性食物中毒中所占比例較高，是沿海區域最主要的食物中毒細菌之一。其引起的細菌性食物中毒危害僅次于沙門氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌和肉毒梭菌。我國沿海地區每年都有大量由副溶血性弧菌引起食物中毒報道。
[0007]聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)是一種體外快速擴增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數小時內可使目的基因片段擴增到數百萬個拷貝的分子生物學技術。PCR技術的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火(復性)、延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93°C左右一段時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸:DNA模板與引物的結合物在72°C，Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環變性、退火(復性)、延伸三個過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。多重PCR是在普通PCR的基礎上加以改造，在一個PCR反應體系中同時加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術。多重PCR在一次反應中能同時擴增多個目的片段的多個靶序列。該技術可用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定，在同一 PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增。多重PCR最大的問題在于引物的設計和反應條件的優化。和一般PCR相比較，多重PCR在同一 PCR反應管內需要同時擴增出多個病原菌的目的片段，一次完成多個模板的擴增。在本發明中，在同一反應管內檢出陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜 水氣單胞菌和副溶血弧菌，將大大節省時間和試劑，節約經費，為檢測提供更多更準確的信息 。多重PCR的引物設計要求總體上與一般PCR的引物一致，如引物自身需要有穩定的二級結構，引物之間也不能形成發夾和引物二聚體等。這是因為單對引物擴增單個模板都能擴增出條帶清晰的目的片段，但是各種引物混和后擴增會有條帶丟失現象出現。各引物之間還存在競爭關系，強勢引物可能掩蓋弱勢引物，導致目的片段丟失。甚至引物之間相互作用產生嚴重的引物二聚體，導致目的片段丟失。
[0008]多重PCR以其快速、高效、特異性好、靈敏度高的特點，在食品病原微生物、非致病微生物及環境微生物等檢測中具有重要作用，符合口岸、衛生、質檢等部分快速檢測的需要，是一種準確、可靠、科學的分子生物學方法。有鑒于此，盡快開發一種用于同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR勢在必行。這對于加強水產品中這些致病菌的快速檢驗檢疫、水產養殖病害的調查和防治、無公害水產品檢測和生產以及水產品衛生質量監督檢驗等方面都具有提示和警示的作用。

【發明內容】

[0009]本發明所要解決的一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物及其設計方法。
[0010]本發明所要解決的另一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR檢測方法，其具有簡單、靈敏、快速、特異性強的特點。
[0011]本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案為:該用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物，其特征在于:該四種致病菌的多重PCR引物分別包括陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物；
[0012]其中，陰溝腸桿菌的上下游引物為:
[0013]Pl:5’ -AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’ ；
[0014]P2:5， -CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，；
[0015]產單核細胞增生李斯特菌的上下游引物為:
[0016]P3:5’ -TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3’ ；
[0017]P4:5，-CATATTCCACTTTAACCGTG-3，；
[0018]嗜水氣單胞菌的上下游引物為:
[0019]P5:5， -AAAGCGGATT ATGCAGAAGCACTG-3，；
[0020]P6:5， -GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3，；
[0021]副溶血弧菌的上下游引物為:
[0022]P7:5’ -TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’ ；
[0023]P8:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’ ；
[0024]進一步地，用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物，其特征在于:所述陰溝腸桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為1250bp，所述產單核細胞增生李斯特菌引物對應的PCR擴增片段大小為768bp和272bp，所述嗜水氣單胞菌引物對應的PCR擴增片段大小為483bp，所述副溶血弧菌引物對應的PCR擴增片段大小為454bp。
[0025]本發明中用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物的設計方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0026]步驟1，利用引物設計軟件設計同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數為20-24個，引物的熔解溫度Tm值為55°C _65°C，引物的6(:%為40% -60% ；
[0027]步驟2，對引物組合中的引物進行篩選，保留不形成引物二聚體的引物；
[0028]步驟3，判斷所保留引物的競爭優劣狀態，將上述所保留引物的GC%和堿基數進行比較，當引物的堿基數均相同且內側引物的GC %小于外側引物的GC %，或者當引物的堿基數不完全相同且內側引物的堿基數比外側引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態劣勢引物，進行步驟4 ;否則判斷為競爭狀態優勢引物，進行步驟5 ；
[0029]步驟4，再次篩選競爭狀態引物，具體步驟為:重復步驟2，對所保留的引物按照步驟3進行再次判斷；
[0030]步驟5，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證；
[0031 ] 步驟6，去除擴增引物中的競爭狀態劣勢引物，獲得多重PCR弓丨物組合。
[0032]本發明中用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物的多重PCR檢測方法，其特征在于包括如下步驟:
[0033]I)細菌的初步分離:從培養基中提取基因組DNA，備作PCR模板；
[0034]2)多重PCR擴增包括:a、多重PCR擴增反應體系:取上述DNA模板溶液38_60ng/μ L，用上述試劑盒進行檢測，反應體系為20-30.0 μ L，各反應產物分別為TaqDNA聚合酶0.02U/yL, PCR緩沖液2.5 μ L，脫氧核糖核苷三磷酸混合物lOmmol/L，引物Ρ1、P2各0.5-2μ L，P3、P4 各 0.75-1.5 μ L，P5、P6 各 0.75-1.5 μ L，P7、P8 各 0.25-1.0 μ L，余量用重蒸水補足；b、擴增反應條件:941:預變性41^11，941:變性30s，56°C退火45s，72°C延伸40s，循環30次，72°C終末延伸IOmin ;c、將步驟b的擴增產物進行電泳檢測及結果分析。
[0035]作為優選，所述步驟a中引物P1、P2各2μ L，P3、P4各0.75 μ L，P5、P6各0.75 μ L，P7、P8 各 0.25 μ L0
[0036]與現有技術相比，本發明的優點在于:采用本發明建立的多重PCR同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的方法，具有操作簡便、快速，特異性強，靈敏度高等優點，只需一個PCR反應就可同時檢測出這四種細菌，通過應用該方法對不同環境海水樣品和養殖海水樣品的檢測，同時與常規方法檢測進行比較多重PCR檢出結果，與常規細菌分離鑒定結果完全吻合；采用本發明多重PCR同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的方法，能提示和警示樣品是否具有危害性，這對于預防和控制我國水產品和海洋環境安全具有重要的現實意義。目前未見國內外利用該技術檢測海洋及其水產品中陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的報道，該技術有望為多部門檢測這四種細菌提供一種快速靈敏、簡便可靠的方法，特別適合檢疫、衛生等部門實施快速檢驗需要。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為多重PCR鑒別陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的電泳檢測結果。
【具體實施方式】
[0038]以下通過結 合附圖及實施例對本發明作進一步說明。
[0039]I)利用primer express2.0引物設計軟件設計同時擴增陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重引物組合；
[0040]2)篩選多重引物組合中PCR檢測陰溝腸桿菌的引物；
[0041]3)篩選多重引物組合中PCR檢測產單核細胞增生李斯特菌的引物；
[0042]4)篩選多重引物組合中PCR檢測嗜水氣單胞菌的引物；
[0043]5)篩選多重引物組合中PCR檢測副溶血弧菌的引物；
[0044]6)篩選多重PCR同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的引物組合。
[0045]所述的步驟I)，其中涉及的引物參照實驗室海洋分離株相應的基因序列和GenBank 上發表(E.bact.gyrB 為 GenBank AF302677、AY370837, L.mono, ppbp 為 GenBankFR733647、HE999705, A.hydr.hlyA 為 GenBank L36462、⑶229025，V.para, tlh 為 GenBank⑶971655、AB012596)的四種細菌對應的基因序列，應用primer express2.0設計的同時檢測四種細菌的特異性引物組合。
[0046]在本專利文本中，E.bact.為陰溝腸桿菌的英文縮寫，L.mon0.為產單核細胞增生李斯特菌的英文縮寫，A.hydr.為嗜水氣單胞菌的英文縮寫，V.para.為副溶血弧菌的英文縮寫；E.bact.(gyrB)Pl和E.bact.(gyrB)P2為根據陰溝腸桿菌gyrB基因設計的上游引物Pl和下游引物P2,L.mon0.(ppbp)P3和L.mono, (ppbp) P4為根據產單核細胞增生李斯特菌ppbp基因設計的上游引物P3和下游引物P4, A.hydr.(hlyA)P5和A.hydr.(hlyA)P6為根據嗜水氣單胞菌hlyA基因設計的上游引物P5和下游引物P6，V.para.(tlh)P7和V.para.(tlh)P8為根據副溶血弧菌tlh基因設計的上游引物P7和下游引物P8。
[0047]所述的步驟2)、3)、4)、5)和6)，經過篩選，得出陰溝腸桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為1250bp，產單核細胞增生李斯特菌引物對應的PCR擴增片段大小為768bp和272bp，嗜水氣單胞菌引物對應的PCR擴增片段大小為483bp，副溶血弧菌引物對應的PCR擴增片段大小為454bp。具體引物序列如下:
[0048]陰溝腸桿菌的上下游引物為:
[0049]E.bact.(gyrB)Pl:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3，；
[0050]E.bact.(gyrB)P2:5， -CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，；
[0051]產單核細胞增生李斯特菌的上下游引物為:
[0052]L.mon0.(ppbp)P3:5，-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3，；
[0053]L.mono, (ppbp)P4:5，-CATATTCCACTTTAACCGTG-3，；
[0054]嗜水氣單胞菌的上下游引物為:
[0055]A.hydr.(hlyA)P5:5’ -AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3，；
[0056]A.hydr.(hlyA)P6:5，-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3，；
[0057]副溶血弧菌的上下游引物為:
[0058]V.para.(tlh)P7:5’ -TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’ ；
[0059]V.para, (tlh)P8:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3，；
[0060]所述的步驟6)，多重PCR同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌方法最佳反應條件的測定，分別利用4對引物進行4種細菌模板多重PCR最佳退火溫度、引物濃度、模板濃度等的測定，然后根據實驗結果進行多重PCR最佳循環次數的測定。
[0061]所述的步驟6)，多重PCR同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌方法的反應體系為25 μ L，具體如下:10XPCR Buffer (含25mmol/L MgCl2) 2.5 μ L, 10mmol/L 脫氧核糖核苷三憐酸混合物(dNTP) 3 μ L, 10mmol /T, E.bact.(gyrB)上下游引物各 0.5 μ L, 10mmol/L L.mono, (ppbp)和 A.hydr.(hlyA)上下游引物各
1.5μ L, 10mmol/L V.para, (tlh)上下游引物各 1.0 μ L，5U/μ L Taq酶 0.25 μ L，E.bact.的DNA 模板 3 μ L, L.mon0.的 DNA 模板 4 μ L, A.hydr.的 DNA 模板 5 μ L, V.para.的 DNA 模板2 μ L，ddH20補足至25 μ L。擴增條件為預變性94°C 5min ;變性94°C 30s，退火56°C 30s,延伸72°C 60s，循環30次；終延伸72°C IOmin ;4°C保存。反應結束后取反應液各5 μ L進行
1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件:Tris硼酸(TBE)、電流50mA,電壓150v,電泳時間30min后以Bio-Rad凝膠成像系統拍攝成像，圖1中顯示了對本實施例樣品分別進行多重和單重PCR的檢測結果，其中M號泳道為DL2000DNA Marker ;1號泳道為四重PCR擴增結果，在分子量約為1250bp、768bp與272bp、483bp和454bp處分別呈現明亮目的擴增條帶，說明本實施例的樣品中存在陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌；2號泳道為陰溝腸桿菌的檢測結果，呈現分子量約為1250bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有陰溝腸桿菌；3號泳道為產單核細胞增生李斯特菌的檢測結果，呈現分子量約為768bp和272bp的明亮的、特征的擴增條帶，說明樣品中含有產單核細胞增生李斯特菌；4號泳道為嗜水氣單胞菌的檢測結果，呈現分子量約為483bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含 有嗜水氣單胞菌；5號泳道為副溶血弧菌的檢測結果，呈現分子量約為454bp的明亮的、單一的擴增條帶，說明樣品中含有副溶血弧菌。
[0062]實施例1
[0063]用于同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物設計方法，該方法包括以下步驟:
[0064]步驟1，利用引物設計軟件01igo6.0設計同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數為24個，引物的熔解溫度Tm值為65 °C，引物的GC %為40 % ;
[0065]步驟2，對引物組合中的引物進行篩選，保留不形成引物二聚體的引物；
[0066]步驟3，判斷所保留引物的競爭優劣狀態，將上述所保留引物的GC%和堿基數進行比較，當引物的堿基數均相同且內側引物的GC %小于外側引物的GC %，或者當引物的堿基數不完全相同且內側引物的堿基數比外側引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態劣勢引物，進行步驟4 ;否則判斷為競爭狀態優勢引物，進行步驟5 ;
[0067]步驟4，再次篩選競爭狀態引物，具體步驟為:重復步驟2，對所保留的引物按照步驟3進行再次判斷；
[0068]步驟5，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證；
[0069]步驟6，去除擴增引物中的競爭狀態劣勢引物，獲得多重PCR引物組合。 [0070]具體引物序列如下:
[0071]E.bact.(gyrB)Pl:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3，
[0072]E.bact.(gyrB)P2:5，-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，
[0073]L.mon0.(ppbp)P3:5，-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3J
[0074]L.mono, (ppbp)P4:5，-CATATTCCACTTTAACCGTG-3，
[0075]A.hydr.(hlyA)P5:5，-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3，
[0076]A.hydr.(hlyA)P6:5，-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’
[0077]V.para.(tlh)P7:5，-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3，
[0078]V.para, (tlh)P8:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3J。
[0079]實施例2
[0080]用于同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物設計方法，該方法包括以下步驟:
[0081]步驟I,利用引物設計軟件Primer Premier5.0設計同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數為20個，引物的熔解溫度Tm值為55°C，引物的GC%為60% ;
[0082]步驟2，對引物組合中的引物進行篩選，保留不形成引物二聚體的引物；
[0083]步驟3，判斷所保留引物的競爭優劣狀態，將上述所保留引物的GC%和堿基數進行比較，當引物的堿基數均相同且內側引物的GC %小于外側引物的GC %，或者當引物的堿基數不完全相同且內側引物的堿基數比外側引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態劣勢引物，進行步驟4 ;否則判斷為競爭狀態優勢引物，進行步驟5 ；
[0084]步驟4，再次篩選競爭狀態引物，具體步驟為:重復步驟2，對所保留的引物按照步驟3進行再次判斷；
[0085]步驟5，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證；[0086]步驟6，去除擴增引物中的競爭狀態劣勢引物，獲得多重PCR引物組合。
[0087]具體引物序列如下:
[0088]E.bact.(gyrB)Pl:5，-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’
[0089]E.bact.(gyrB)P2:5，-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3，
[0090]L.mon0.(ppbp)P3:5，-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3J
[0091]L.mono, (ppbp)P4:5，-CATATTCCACTTTAACCGTG-3，
[0092]A.hydr.(hlyA)P5:5，-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3J
[0093]A.hydr.(hlyA)P6:5，-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’
[0094]V.para.(tlh)P7:5，-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3，
[0095]V.para, (tlh)P8:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3J。
[0096]實施例3
[0097]1、設計合成陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌引物
[0098]參照海洋分離株相應的基因序列和GenBank上發表的四種細菌對應的基因序列(E.bact.gyrB 為 GenBank AF302677、AY370837, L.mono, ppbp 為 GenBank FR733647、HE999705,A.hydr.hlyA 為 GenBank L36462、⑶229025，V.para, tlh 為 GenBank ⑶971655、AB012596)的四種細菌對應的基因序列，應用primer express2.0設計一對特異性引物，陰溝腸桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為1250bp，產單核細胞增生李斯特菌引物對應的PCR擴增片段大小為768bp和272bp，嗜水氣單胞菌引物對應的PCR擴增片段大小為483bp，副溶血弧菌引物對應的PCR擴增片段大小為454bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；具體參見表1:
[0099]
【權利要求】
1.一種用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物，其特征在于:該四種致病菌的多重PCR引物分別包括陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物； 其中，陰溝腸桿菌的上下游引物為:
Pl:5’ -AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’ ；
P2:5’ -CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’ ； 產單核細胞增生李斯特菌的上下游引物為:
P3:5’ -TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3’ ；
P4:5’ -CATATTCCACTTTAACCGTG-3’ ； 嗜水氣單胞菌的上下游引物為:
P5:5’ -AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’ ；
P6:5’ -GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’ ； 副溶血弧菌的上下游引物為:
P7:5’ -TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’ ；
P8:5’ -GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’。
2.根據權利要求1所述的用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物，其特征在于:所述陰溝腸桿菌引物對應的PCR擴增片段大小為1250bp，所述產單核細胞增生李斯特菌引物對應的PCR擴增片段大小為768bp和272bp，所述嗜水氣單胞菌引物對應的PCR擴增片段大小為483bp，所述副溶血弧菌引物對應的PCR擴增片段大小為454bp。
3.一種根據權利要求1所述的用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物的設計方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟1，利用引物設計軟件設計同時檢測陰溝腸桿菌、產單核細胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數為20-24個，引物的熔解溫度Tm值為55°C _65°C，引物的6(:%為40% -60% ； 步驟2，對引物組合中的引物進行篩選，保留不形成引物二聚體的引物； 步驟3，判斷所保留引物的競爭優劣狀態，將上述所保留引物的GC%和堿基數進行比較，當引物的堿基數均相同且內側引物的GC %小于外側引物的GC %，或者當引物的堿基數不完全相同且內側引物的堿基數比外側引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態劣勢引物，進行步驟4 ;否則判斷為競爭狀態優勢引物，進行步驟5 ； 步驟4，再次篩選競爭狀態引物，具體步驟為:重復步驟2，對所保留的引物按照步驟3進行再次判斷； 步驟5，利用PCR方法對競爭狀態優勢引物進行擴增驗證； 步驟6，去除擴增引物中的競爭狀態劣勢弓丨物，獲得多重PCR弓丨物組合。
4.一種應用如權利要求1所述的用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物的多重PCR檢測方法 ，其特征在于包括如下步驟: 1)細菌的初步分離:從培養基中提取基因組DNA，備作PCR模板； 2)多重PCR擴增包括:a、多重PCR擴增反應體系:取上述DNA模板2~8μ L，反應體系為20-30.0 μ L，各反應產物分別為TaqDNA聚合酶5U/ μ L，0.1-0.25 μ L，PCR緩沖液2.5 μ L，脫氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，2-3.5 μ L，引物P1、P2各0.5-2 μ L，Ρ3、Ρ4各 0.75-1.5 μ L，P5、P6 各 0.75-1.5 μ L，P7、P8 各 0.25-1.0yL,余量用重蒸水補足；b、擴增反應條件:94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸40s，循環30次，72°C終末延伸IOmin ;c、將步驟b的擴增產物進行電泳檢測及結果分析。
5.根據權利要求4所述的用于同時檢測海洋中四種致病菌的多重PCR引物的多重PCR檢測方法，其特征在于:所述步驟a中引物P1、P2各2yL，P3、P4各0.75yL，P5、P6各.0.75 μ L, Ρ7、Ρ8 各 0.25 μ L。
【文檔編號】C12Q1/04GK103981275SQ201410241775
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】楊季芳, 管峰, 陳吉剛, 毛芝娟 申請人:浙江萬里學院